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A Novel tridimensionnelle chambre d'écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d'écoulement physiologiques

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DOI :

10.3791/50959

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15 juillet 2013

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1Torrey Pines Institute for Molecular Studies, 2Cascade LifeSciences Inc.

Dans cet article

Résumé

Dispositif de chambre de flux en trois dimensions est une nouvelle In vitro Technologie pour l'évaluation quantitative et progressive de la cascade de l'extravasation des cellules circulantes dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique. Le dispositif vient donc combler un besoin critique pour les études de base, préclinique, clinique et de la migration cellulaire.

Résumé

L'extravasation des cellules du sang circulant joue un rôle central dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques, y compris les cellules souches métastases homing et de la tumeur. Le dispositif de chambre écoulement tridimensionnel (ci-après le dispositif 3D) est une nouvelle technologie in vitro qui reproduit la contrainte de cisaillement physiologique et permet à chaque étape de la cascade de l'extravasation des cellules à quantifier. Dispositif 3D consiste en un compartiment supérieur dans lequel les cellules d'intérêt circulent sous contrainte de cisaillement, et un compartiment inférieur de puits statiques qui contiennent des facteurs chimiotactiques d'intérêt. Les deux compartiments sont séparés par des inserts poreux revêtu d'une monocouche de cellules endothéliales (EC). Un second insert en option avec les cellules du microenvironnement d'intérêt peut être placé immédiatement sous la couche CE. Un appareil d'échange de gaz permet à l'optimal tension de CO 2 pour être maintenu et fournit un point d'accès pour ajouter ou retirer des cellules ou des composés au cours de l'expérience. Les cellules de test circulent dans le compartiment supérieur à la contrainte de cisaillement souhaitée (débit) contrôlée par une pompe péristaltique. A la fin de l'expérience, les cellules circulantes et migré sont collectés pour des analyses plus poussées. Le dispositif 3D peut être utilisé pour examiner cellule rouler sur et l'adhésion à la CE sous la contrainte de cisaillement, transmigration en réponse aux gradients de chimiokines, la résistance au cisaillement, la formation de grappes, et la survie cellulaire. En outre, le second insert en option permet des effets de diaphonie entre la CE et les cellules du microenvironnement à examiner. Les applications de translation du dispositif 3D comprennent des tests de médicaments candidats que la migration de la cellule cible et prédire le comportement in vivo des cellules après injection intraveineuse. Ainsi, le dispositif de 3D roman est un outil polyvalent et peu coûteux d'étudier les mécanismes moléculaires qui interviennent dans extravasation cellulaire.

Introduction

extravasation des cellules est le processus par lequel les cellules circulantes quittent la circulation sanguine et est une composante essentielle de nombreuses réactions physiologiques dans l'organisme. Le processus est aussi important pour la régénération des tissus, comme par exemple, lorsque les cellules thérapeutiques mobilisés à partir de tissus dans les vaisseaux sanguins (ou injecté par voie intraveineuse) migrent à travers le système vasculaire et sortent de la circulation sur les sites de blessure ou de dégénérescence. Extravasation est également une composante essentielle de la pathogenèse de nombreuses maladies, y compris l'inflammation, le rejet immunitaire, l'auto-immunité, et la métastase des tumeurs.

Extravasation est un processus à plusieurs étapes complexe qui implique l'interaction de cellules avec des cellules endothéliales (EC) circulant dans des conditions d'écoulement physiologique. Le procédé consiste à (a) de roulement de la cellule, (b) l'adhésion ferme à la surface luminale des CE, et (c) la transmigration à travers la CE. Surtout, chaque étape de la cascade d'extravasation est régulée par un sous-ensemble de cell spécifique au type et des molécules spécifiques à l'espèce. Cependant, les mécanismes moléculaires détaillées qui régissent l'extravasation des sous-ensembles de cellules spécifiques sont pas bien comprises, en grande partie en raison de la difficulté technique de rappeler les conditions dans le sang. Le dispositif 3D roman décrit ici est conçu pour surmonter ces défis techniques et permettre d'effectuer des essais qui permettront d'améliorer notre compréhension de la biologie de la migration cellulaire.

Les molécules qui interviennent dans la migration cellulaire sont des cibles thérapeutiques importantes. Une compréhension détaillée des événements moléculaires qui contrôlent la migration des types cellulaires spécifiques aidera à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la promotion ou l'inhibition de l'extravasation. Par exemple, les interventions qui améliorent la migration des cellules souches thérapeutiques (qu'elles dérivent de tissus fœtaux adultes, néonatale ou même d') vers des sites de lésion ou de la dégénérescence serait d'une grande utilité dans la régénération tissulaire.Il ya un intérêt croissant pour la production in vitro de cellules souches thérapeutiques, y compris les cellules dérivées de sources pluripotentes, et dans des cellules ex vivo manipulés souches adultes (élargi, manipulé génétiquement et prétraité avec différentes enzymes) 1. Ainsi, il existe un besoin pour de nouvelles technologies à évaluer la qualité des cellules souches avant qu'ils ne soient utilisés à des fins thérapeutiques. Parmi les autres paramètres, les cellules doivent être en mesure de sortir efficacement la circulation, car les traitements pour les troubles multifocales peuvent nécessiter une administration intraveineuse des cellules souches 2. En effet, l'un des défis actuels de la biologie des cellules souches est de remédier à la très faible efficacité avec laquelle les cellules souches maison aux sites des lésions tissulaires 3-6, soulignant la nécessité de combler cette lacune dans notre compréhension de la migration des cellules souches. En revanche, les stratégies que la migration des cellules de bloc en ciblant des molécules spécifiques homing serait utile pour le traitement de l'enmaladies inflammatoires et auto-immunes ainsi que le cancer métastatique. Ainsi, la compréhension des mécanismes moléculaires qui interviennent dans les interactions entre les cellules circulantes et la CE au cours de la migration cellulaire et extravasation est pertinent pour la médecine translationnelle et la découverte de médicaments ainsi que de la science fondamentale.

Il ya actuellement un certain nombre de méthodes disponibles pour étudier les différents aspects de la migration cellulaire. Cependant, ces méthodes présentent des inconvénients qui peuvent être surmontés avec le nouveau dispositif 3D.

Les modèles animaux:

Les modèles animaux, tels que des souris immunodéprimées et les souris génétiquement manipulées, ont été des outils utiles pour étudier la migration des cellules humaines in vivo. Cependant, un inconvénient important pour ces modèles est que les cellules humaines interagissent faiblement avec les molécules d'adhésion présentes sur les souris CE, en partie à cause des différences de séquences spécifiques d'espèces dans de nombreuses molécules de surface cellulaire. Ainsi, l'utilisation des rongeurs pour étudiermigration cellulaire humaine est peu susceptible de refléter authentiquement les événements de lits vasculaires spécifiques d'organes humains. En outre, dans des modèles in vivo ne sont pas adaptés pour le criblage à haut débit de candidats-médicaments. Le classique des modèles in vivo à l'aide d'étudier cellule homing ne discriminent pas entre les différentes étapes de la cascade d'extravasation, il est difficile d'identifier et de cibler de nouvelles molécules à tête chercheuse. L'approche de microscopie intravitale a été développé pour répondre à ce besoin et a été instructif, mais cette technique demande beaucoup de temps et de main-d'œuvre 7,8.

Dosages de transmigration statiques:

Transwell ou Boyden chambre essais migration des cellules de mesure à travers une membrane poreuse et sont largement utilisés dans les études sur la migration. Le test a l'avantage qu'il peut être utilisé pour étudier non seulement la motilité cellulaire et la matrice des interactions cellule-extracellulaire (MEC), mais aussi la migration chimiokine médiée par des cellulesà travers une monocouche CE cultivées sur des membranes poreuses. Malheureusement, le phénotype et la fonction des CE dans des conditions statiques diffèrent sensiblement de ceux sous flux physiologique 9,10. Ainsi, les événements chimiotactiques qui se produisent dans des dosages TRANSWELL ne fidèlement imiter les interactions entre les cellules migrantes et des CE au titre de la contrainte de cisaillement. En outre, l'étape de «roulement» de la cascade homing, ce qui ajoute une dimension supplémentaire de la sélectivité à l'ensemble du processus, ne se produit pas dans des essais statiques TRANSWELL. Ainsi, alors que cette technologie ne permettra l'évaluation quantitative de la migration cellulaire chimiokine induite à travers la monocouche CE, elle est limitée par son incapacité à fournir la contrainte de cisaillement qui imite le flux sanguin in vivo.

Des essais sous contrainte de cisaillement:

Mur contrainte de cisaillement est connue pour jouer un rôle important dans la régulation de la fonction CE 9,10. Les forces de cisaillement induisent une activation rapide des cascades de signalisation, transcLes facteurs de Ription, et l'expression différentielle des gènes dans l'affaire CE 11,12. Cette information a conduit au développement de la prochaine génération de tests d'adhésion - chambres à flux laminaire parallèles et capillaires - étudier roulement et l'adhérence des cellules à la CE dans des conditions de contrainte de cisaillement 7,13. Le facteur limitant pour ces tests est qu'ils peuvent mesurer seulement de roulement et l'adhérence, mais ne fait pas de différence entre une cellule adhérente qui irait à transmigrer et une cellule adhérente qui est «arrêté» sur la monocouche CE et ne serait pas transmigrer. De plus, ces tests ne peuvent pas mesurer la migration des cellules vers un gradient de chimiokine.

Plusieurs rapports ont décrit la capacité des cellules adhérentes à ramper sous une monocouche CE cultivées sur des lames de verre dans des conditions d'écoulement 14. Les limites de cette technique ramper comprennent: il analyse seulement un nombre limité de cellules, c'est non quantitative, il analyse cellulaire rampant sur la matrice et celL surface mais pas la migration vers un gradient chimiotactique, et il ne permet pas aux cellules transmigré à être isolés. Ainsi, bien que ce test a l'avantage de l'application de la contrainte de cisaillement à la monocouche CE, il ne peut pas quantifier la migration des cellules vers un gradient de chimiokine.

La technologie 3D roman décrit ici surmonte un grand nombre de ces lacunes en combinant la force de cisaillement (compartiment supérieur) avec un gradient de chimiokine statique (compartiment inférieur) et permet une évaluation quantitative de chaque étape de la cascade d'extravasation (Figure 1). Le dispositif peut également être utilisé pour étudier comment la diaphonie entre la CE et le microenvironnement influe sur la capacité de la CE à soutenir extravasation des cellules circulantes. Le protocole suivant décrit la méthode étape par étape pour l'utilisation du dispositif de chambre de flux 3D.

Protocole

1. Préparer les insertions supérieures et inférieures pour la croissance cellulaire en collagène Coating

  1. Calculer le nombre de plaquettes nécessaires pour l'expérience. Placez chaque insert dans une boîte de Pétri stérile séparée (35 x 10 mm) et stériliser par irradiation (11 Gy).
  2. Préparer la solution de collagène pour le revêtement de membranes: 50 pg / ml, 154 pi par insert (insérer Surface 1,54 cm 2).
  3. Placez quelques gouttes (~ 20 pi par goutte) de solution de collagène dans un cercle sur la surface de la membrane d'insertion (ne laissez pas la pointe de la pipette toucher la surface), puis ajouter délicatement le reste de l'aliquote pour former une forte baisse sur le surface de la membrane. S'assurer que la solution de collagène reste hémisphérique et ne s'écoule pas à partir de la surface de la membrane.
  4. Couvrir le plat de Pétri avec un couvercle et incuber pendant 1 heure à température ambiante sur une surface plane.
  5. Aspirer la solution de collagène et laver la membrane une fois en couvrant avec 160 pi de PBS.
  6. Aspirate le PBS et remettre le couvercle. Si vous utilisez le même jour, placez la boîte de Pétri dans un endroit sec à température ambiante. Sinon, placez le plat à 4 ° C et utiliser l'insert dans les 7 jours.

2. Culture cellules endothéliales sur les inserts supérieurs

  1. Préparer suspension CE dans le milieu de culture souhaitée. Assurez-vous que la viabilité cellulaire est> 98% et l'utiliser immédiatement.

Note: Pour veine ombilicale humaine CE (HUVEC), 4 x 10 5 cellules dans 160 ul par insert est utilisé.

  1. Prenez les boîtes de Pétri avec des inserts revêtus de collagène préparés à la section 1, ne pas retirer les inserts de la vaisselle. Placez quelques petites gouttes de la suspension cellulaire (environ 20 pi par goutte) dans un cercle sur la surface de la membrane enduite de collagène (ne pas laisser la pointe de la pipette contact de la surface), puis ajouter délicatement le reste de la suspension de cellules pour former une forte baisse. Assurez-vous que la suspension cellulaire reste hemis pherical et ne s'écoule pas à partir de la surface de la membrane.
  2. Remplacer les couvercles et placer soigneusement les plats dans un 5% de CO 2 incubateur de culture cellulaire et incuber (sans agitation) à 37 ° C pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de se fixer sur la membrane.
  3. Ajouter lentement 5 ml de milieu de culture de chaque boîte de Petri en sorte que l'insert reste sur le fond de la boîte et est complètement recouvert par le support. Remplacer les couvercles et placer soigneusement les plats de retour dans l'incubateur. Culture des cellules à 37 ° C pendant la nuit.
  4. Utilisez la même méthode pour préparer le second (facultatif) insert inférieur avec des cellules qui représentent le micro-environnement local, qui sera placée sous l'insert contenant la couche CE.

Remarque: si les inserts inférieurs sont inclus dans les expériences, les inserts supérieurs et inférieurs sont d'abord reliés les uns aux autres avant de placer les inserts dans le dispositif 3D (figure 4B).

e "> 3. Assemblez la chambre d'écoulement périphérique 3D

  1. Visser les plaques supérieure et inférieure, connecter les plaques de l'unité d'échange de gaz en utilisant un tube, placer le dispositif assemblé dans un sac en plastique propre, et stériliser le sac et son contenu par irradiation (11 Gy).
  2. Enlevez un plateau-plateau de l'incubateur de culture cellulaire, la placer dans une hotte de culture de tissus stériles, pulvérisation avec de l'éthanol à 70%, essuyer, puis recouvrir le plateau avec une grande serviette stérile.
  3. Placez le sac en plastique irradié dans le capot, retirez le périphérique dans le sac et le placer sur le plateau incubateur stérile. Connecter le dispositif à la pompe péristaltique avec la tubulure prévue. Programme de la pompe pour une vitesse optimale de 0,2 ml / min.

Remarque: Pour raccorder la pompe à la prise de courant, extruder le cordon électrique à travers le trou dans la face arrière de l'incubateur. Utilisez fiche de voleur autour du cordon afin de s'assurer que le trou est hermétique.

  1. La place 5-7 ml de milieu de culture désirées dans un tube stérile 15 ml (pour le "entrée").

4. Premier de la chambre d'écoulement périphérique 3D

  1. Déconnecter la tubulure d'entrée de la prise en tirant l'aiguille métallique de la tubulure (utiliser de petites serviettes stériles pour maintenir la stérilité de la tubulure). Utilisation de l'aiguille métallique reliée à la tubulure en tant que "entrée" et l'extrémité coupée du tube en tant que "sortie". Placez l'entrée de l'aiguille métallique dans le tube de 15 ml avec les médias; placer la sortie dans le tube de vide ml 15.
  2. Mettre la pompe de sorte que le flux est réglé dans le sens antihoraire et la vitesse d'écoulement de 0,2 ml / min. Permettre à la pression négative pour attirer le fluide à partir du tube d'admission de 15 ml dans le tube et d'arrêter la pompe lorsque le support atteint la fin du tube immédiatement avant qu'il se connecte à l'appareil (figure 2, arrêt n ° 1).
  3. Dévisser les plaques supérieure et inférieure de l'appareil. Retirez délicatement la plaque supérieure et le lieu 1,500 - 1,550 l de médecineUM (soit le milieu seul ou en plus des chimiokines expérimentales) dans les puits inférieurs. Vérifiez que le support contient également suffisant pour former une demi-sphère qui atteint environ 1 - 2 mm au-dessus de la plaque inférieure.
  4. Transférer l'insert préparé à partir de la boîte de Petri dans les puits de la plaque inférieure à l'aide des pinces stériles, en s'assurant qu'aucune bulle sont piégés sous les inserts. Aspirer tout support qui apparaît sur la surface de la plaque inférieure de sorte que la plaque reste sèche. Placer la plaque supérieure en arrière sur la plaque inférieure et re-connecter les plaques à l'aide des vis.
  5. Tournez immédiatement à la pompe péristaltique et permettre au milieu de circuler à travers le dispositif 3D. Élever l'extrémité de sortie du dispositif et de maintenir la chambre dans cette position, pour empêcher la formation de bulles à l'intérieur de l'espace entre les plaques.
  6. Laisser le milieu de remplissage de la chambre et la tubulure reliant la chambre à l'unité d'échange de gaz. Arrêtez immédiatement la pompe avant que le milieu atteigne le gaz eunité de Xchange (Figure 2; Arrêt n ° 2). Placer 3 ml de milieu dans l'unité d'échange de gaz, tourner sur la pompe, et de permettre aux bulles d'air de s'échapper à travers l'unité d'échange de gaz. Élever l'unité d'échange de gaz pour permettre au moyen de remplir le tube sortant de l'unité d'échange de gaz et d'arrêter la pompe lorsque le produit arrive jusqu'à 2-3 cm avant la fin de la tubulure de sortie (figure 2, l'arrêt # 3).
  7. Connecter l'aiguille métallique entrée vers la sortie à l'aide de petites serviettes stériles. Reprogrammer la pompe de sorte que les flux de fluide dans le sens inverse (sens horaire) vers l'unité d'échange de gaz et d'assurer toutes les bulles d'air sont éliminées une fois qu'ils atteignent l'unité d'échange de gaz. Vérifiez qu'aucune bulle d'air dans le système.
  8. Reprogrammer la pompe de sorte que le fluide circule dans le sens antihoraire. Ajouter 100 pl de la suspension cellulaire de test à l'unité d'échange de gaz. Fermer le couvercle de l'unité d'échange de gaz, placer le plateau avec l'arrière du système de travail dans l'incubateur, et permettent aux cellules de test pour circulantdans le dispositif électronique 3D à 37 ° C pendant le temps souhaité.

Remarque: Nettoyer le cordon électrique de la pompe à l'éthanol 70% et le placer à l'intérieur de l'incubateur.

5. Mettre fin à l'essai et de recueillir des échantillons pour essai

  1. Retirez le plateau avec le système de travail de l'incubateur et le placer dans la hotte. Arrêter la pompe, débrancher l'entrée et à la sortie, et placez les extrémités dans vides stériles tubes de 15 ml.
  2. Mettre la pompe et recueillir la suspension de cellules à partir du système; lieu de la suspension cellulaire sur de la glace, le cas échéant, jusqu'à son utilisation.
  3. Démonter la chambre en retirant les vis et soulevant la plaque supérieure. Retirer les inserts de la plaque inférieure et les transférer sur des boîtes de Pétri.

Note: Les inserts peuvent être colorées de visualiser et de compter les cellules in situ (cristal violet 0,05% en dH 2 O) ou la trypsine pour recueillir la CE pour de plus amplestest.

  1. Retirez le support et les cellules des puits inférieurs dans des tubes et centrifuger pendant 5 min à 210 x g. Retirer le surnageant, laver et remettre en suspension les cellules comme souhaité, et traiter les cellules selon les objectifs expérimentaux spécifiques (voir plus loin).

Résultats

La moelle osseuse murine dérivée ligne CE STR-12 a été cultivé sur des plaquettes avec des pores de 5 um. Le taux de croissance CE a été contrôlée au microscope lors que la CE était de 100% de confluence, les inserts ont été transférés dans les puits dans le compartiment inférieur de l'appareil 3D. Immédiatement avant de placer les inserts, les puits de la compartiment inférieur ont été remplis de milieu de culture seul (témoin négatif) ou avec un milieu additionné de stroma dérivée de cellules facteur-1 (SDF-1, 5 ng / ml et 50 ng / ml). Par la suite, le dispositif 3D a été assemblé et la chambre était remplie de fluide tel que décrit dans le protocole. Les cellules d'essai doit être diffusé dans le compartiment supérieur de l'appareil ont été fraîchement récoltées cellules de la moelle osseuse murine (3,5 x 10 6 cellules par chambre). Une contrainte de cisaillement défini de 0,8 dyn / cm 2 est appliquée en réglant le débit de la pompe péristaltique à 0,2 ml / min. Le système de travail ensemble est ensuite placé dans le 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C et la CElls ont été autorisés à circuler et d'interagir avec la monocouche CE pendant 4 heures. Au bout de ce temps, les cellules circulantes ont été prélevés, la chambre a été démonté, et les inserts ont été retirés, comme décrit dans le protocole. Les cellules transmigré ont été récoltés dans les puits inférieurs, lavées, remises en suspension dans un milieu frais, et transférés aux cultures de méthylcellulose complétées par des facteurs de croissance hématopoïétiques pour cellulaire (CFC) essai de formation de colonies (figure 3). Comme prévu, nous avons trouvé un nombre significativement plus élevé de CFC avait migré à travers la monocouche CE dans les puits contenant 50 ng / ml SDF-1 que de puits contenant 5 ng / ml SDF-1 ou milieu seul.

Comme nous l'avons décrit précédemment, aucun des cours en techniques in vitro disponibles pour étudier la migration des cellules sont capables de tester l'effet du micro-environnement local sur la capacité de la CE à soutenir extravasation des cellules migrantes. Pour illustrer comment cela peut être réalisé avec le dispositif 3D, nousextravasation examiné de cellules hématopoïétiques circulant à travers une couche de CE et d'une couche de cellules stromales de la moelle osseuse. Pour cela, un deuxième insert (en bas) contenant une couche de cellules stromales est juxtaposée à la pièce supérieure contenant la monocouche CE dans la plaque inférieure (figure 4). L'expérience a ensuite été réalisée comme décrit ci-dessus et les cellules transmigré ont été récoltées à partir des puits et comptés. Les résultats ont démontré que l'insertion d'une couche supplémentaire de cellules stromales sous la monocouche CE augmenté de façon significative la migration des cellules hématopoïétiques vers SDF-1 (figure 4). Ce résultat est cohérent avec l'idée que le micro-environnement local contribue au recrutement de cellules circulant dans le tissu.

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Figure 1. Dispositif de chambre de flux 3D. A: Le dispositif 3D scellé hermétiquement est composé de deux compartiments séparés par une membrane poreuse jetable (PM). CE sont cultivés sur la membrane, qui forme alors une barrière entre les compartiments supérieur et inférieur. Des contraintes de cisaillement déterminées sont appliquées au compartiment supérieur du dispositif 3D par médias perfuser à l'aide d'une pompe péristaltique de perfusion constante. Cellules circulantes sont soit sans interaction (NIC), d'interagir avec la CE transitoire ('roll »; RC), ou adhérer à la CE (AC). Une sous-population de cellules adhérentes transmigre à travers la couche de la CE au compartiment statique inférieure du dispositif (TM) B:. Une vue de dessus dessin (panneau supérieur) du dispositif 3D. La vue en coupe horizontale (panneau inférieur) montre la position de la membrane supérieure (rouge), la membrane inférieure (vert) et le fond du puits (bleu) C:. L'isometric vue illustre les parties intégrantes du dispositif: quatre vis, un bloc acrylique haut, un joint de la chambre haute, supérieure et membranes inférieures, en bas o-ring, et un bloc de fond acrylique 3 et D:. une photographie de l'écoulement 3D chambre reliée à une pompe péristaltique et d'une unité d'échange de gaz. Le système est assemblé dans une hotte stérile, puis transféré dans un incubateur de culture cellulaire.

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Figure 2. Une représentation schématique du système de dispositif 3D. Le dessin montre les trois arrêts nécessaires pour assembler le système. Le milieu de culture est aspiré à partir de l'orifice d'entrée par la pression négative créée par la pompe péristaltique. L'écoulement du fluide est coupée par arrêt N ° 1 pour permettre aux inserts d'être placés dans l'appareil. Après la chambre est fermée, la pompe est Switched en marche et l'enceinte est aussitôt remplie d'un fluide pour empêcher le séchage des cellules cultivées sur les inserts. Arrêt n ° 2 permet milieu pour être placé dans l'unité d'échange de gaz. Arrêter ° 3 permet l'écoulement soit arrêté pour la connexion de l'entrée et la sortie. Le flux peut être orienté dans une direction dans le sens horaire ou anti-horaire pour éliminer les bulles d'air à travers l'unité d'échange de gaz à l'aide d'un interrupteur situé sur la pompe.

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Figure 3. Le dispositif 3D supporte transmigration SDF-1 médiée par des progéniteurs hématopoïétiques dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique. A: Trois dispositifs (contenant chacune trois puits dans le compartiment inférieur) ont été assemblés et fonctionnent en parallèle. Medium seul ou milieu contenant SDF-1 à 5 ou 50 ng / ml ont été ajoutés aux puits compartiment inférieur. Murin bocellules de la moelle NE ont été autorisés à circuler dans les dispositifs de 4 heures. Par la suite, chaque appareil a été démonté et les cellules qui avaient transmigré vers SDF-1 (jaune) ont été recueillies à partir des puits inférieurs, compté, et cultivé dans de la méthylcellulose complétée par des facteurs de croissance hématopoïétiques (GF). Quatorze jours plus tard, les colonies ont été marqués sous le microscope B:. Le nombre de progéniteurs (cellules formant des colonies, CFC) récupérée à partir des compartiments inférieurs est montré en moyenne ± SD de trois puits par condition. * P <0,05.

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Figure 4. L'effet du microenvironnement sur ​​les interactions entre les cellules hématopoïétiques et des cellules endothéliales. A: L'illustration montre la position d'une seconde membrane poreuse avec st culturefibroblastes romal (SF) sous la membrane supérieure avec la CE. D'autres abréviations sont comme décrit pour la figure 1A B:.. L'membrane supplémentaire (insert inférieur) avec SF culture a été inséré sous la membrane supérieure C: Trois dispositifs (contenant chacun 3 puits) ont été exécutés en parallèle. Medium seul ou milieu contenant SDF-1 à 50 ng / ml SDF-1 a été ajouté aux puits de compartiment inférieur. Les chambres de commande négatives omises SC, SDF-1, ou les deux. les cellules de la moelle osseuse ont été autorisés à circuler pendant 4 heures à 37 ° C. Par la suite, chaque appareil a été démonté et les cellules transmigré ont été recueillies à partir des puits de compartiment inférieur et compté. Le nombre de cellules transmigré récupérés est présenté comme la moyenne ± SD de trois puits par condition. * P <0,05.

Discussion

Le dispositif 3D peut être une technologie utile pour la recherche dans divers domaines, notamment la biologie des cellules souches, la biologie vasculaire, l'hématologie, l'oncologie, l'auto-immunité et l'inflammation. Le dispositif 3D sera particulièrement utile pour les chercheurs qui étudient les cellules hématopoïétiques, mésenchymateuses, neurales, et d'autres souches d'étudier les mécanismes moléculaires régulant chaque étape de la cascade de l'extravasation des cellules souches. Les chercheurs qui étudient la migration des cellules peuvent également utiliser cet appareil pour étudier les différents mécanismes de migration des T et des lymphocytes B, les monocytes, les neutrophiles, éosinophiles, des cellules NK et d'autres cellules migratrices. En biologie vasculaire, l'appareil sera utile pour évaluer l'effet du micro-environnement local sur la capacité de la CE à soutenir le recrutement de cellules et d'imiter la barrière hémato-encéphalique in vitro. Pour les chercheurs se concentrant sur la pathogenèse de la maladie, le dispositif peut être utilisé pour étudier la migration des cellules T cytotoxiques dans le pancréas au cours du diabète de type I, le migration des éosinophiles dans les poumons des patients asthmatiques, la migration des neutrophiles, monocytes et lymphocytes dans les sites d'inflammation dans une variété de troubles, le recrutement des cellules de blesser les sites de guérison, l'interaction des cellules T cytotoxiques avec la néovascularisation, et le recrutement des lymphocytes T cytotoxiques dans les tumeurs.

Le dispositif 3D roman sera également un outil utile pour la science translationnelle et pour le développement préclinique de médicaments et de dépistage. Par exemple, le dispositif peut être utilisé pour optimiser la préparation des suspensions cellulaires thérapeutiques administrées par voie intraveineuse, pour tester le recrutement de cellules thérapeutiques pour les tissus blessés contre les tissus normaux, et d'examiner le rôle de l'organe spécifique ou endothélium des tissus et microenvironnement dans cette processus. Pour le développement de médicaments, le dispositif pourrait être utilisé pour tester des médicaments candidats que les cellules tumorales cibles et bloquer chaque étape de la cascade d'extravasation, pour tester les cellules qui migrent comme une drogue livrery véhicule des sites tumoraux, pour tester des médicaments qui régulent la fonction de l'endothélium spécifique d'un organe humain ou le microenvironnement spécifique du tissu local, et de tester des combinaisons de médicaments qui régulent les différentes étapes de la cascade homing. Enfin, lorsqu'il est converti en un système à haut débit, l'appareil peut être utilisé pour le criblage de petites molécules, des peptides, et des anticorps qui molécules cibles de médiation du trafic de la cellule.

Détails techniques et astuces

Roulement et l'adhérence sous flux sont les étapes critiques dans la cascade d'extravasation et contribuent de manière significative à l'efficacité de la migration cellulaire in vivo. Notamment, ces mesures ne contribuent pas à des essais statiques in vitro. Cependant, les dosages de transmigration statiques sont utiles comme témoins négatifs en expériences testant les effets de la contrainte de cisaillement sur la survie cellulaire et la fonction, y compris la capacité de la CE à soutenir les interactions faible affinité (roulement) et une bonne adhérence.

Le choix du support pour les expériences dans le dispositif 3D est important. Médias contiennent différents facteurs de croissance qui peuvent influer sur la survie des cellules circulantes, en particulier pendant les périodes d'incubation. En outre, les concentrations de Ca 2 + et Mg 2 +, qui peuvent influencer les interactions adhésives dans des conditions d'écoulement physiologique, varier considérablement dans les milieux de culture commerciale. Autres détails techniques qui devraient être prises en compte lors de la planification des expériences avec le dispositif 3D sont discutés ci-dessous.

Sélection de la monocouche CE

La signature de la CE à la surface cellulaire est influencée par divers paramètres, y compris les espèces et les tissus d'origine et les conditions de culture de cellules, ce qui devrait être pris en compte dans la conception expérimentale. Certains couramment utilisée CE comprennent poumon dérivé microvasculaire CE (LDMVEC), dérivées de moelle osseuse CE (BMDEC), CE (brain-derived BDEC), et HUVEC.Les propriétés de la CE varient aussi avec leur origine. Par exemple, BMDEC expriment constitutivement sélectines et VCAM-1, qui sont responsables de roulement et l'adhérence, tandis que BDEC, LDMVEC et HUVEC n'expriment pas ces molécules dans des conditions normales. Par conséquent, inserts revêtus de BDEC, LDMVEC et HUVEC peuvent être prétraités avec le TNF α (10 ng / ml, 4 heures) ou d'autres facteurs pour imiter l'inflammation et induire l'expression de molécules à tête chercheuse.

Test de diaphonie avec le micro-environnement local

Il ya un intérêt croissant pour comprendre comment le micro-environnement local régule les fonctions du CE et participe à l'extravasation des cellules. Nos résultats démontrent que l'insertion d'une monocouche de cellules stromales sous la monocouche CE augmente considérablement extravasation des cellules circulantes. Cette constatation démontre que la diaphonie entre la CE et le stroma améliore la capacité de la CE pour soutenir extravasation des cellules circulantes. Moreover, l'insertion de cellules de différents micro-environnements (par exemple, cellules souches mésenchymateuses, des fibroblastes de poumon, des cellules tumorales, les astrocytes) pourrait permettre d'imiter lits vasculaires spécifiques. En particulier, une combinaison de CE et astrocytes dérivé du cerveau pourrait être une approche utile pour imiter la barrière hémato-encéphalique. De même, les cellules obtenues à partir de patients, ou des cellules normales manipulées in vitro, pourraient contribuer à imiter un microenvironnement spécifique malade.

Dans nos études, nous avons utilisé des inserts inférieurs avec des cellules stromales cultivées à 50% de confluence. Bien que la densité optimale des cellules du microenvironnement sur les inserts dépendra des objectifs de l'étude, ce qui peut être facilement manipulée et contrôlée.

Sélection d'un taux de contrainte de cisaillement

La contrainte de cisaillement de 0,8 dyn / cm 2 a été utilisé ici parce que cela a été démontré par Von Andrian et al. être la contrainte de cisaillement dans la microvasculatur de moelle osseusee, où les cellules progénitrices hématopoïétiques sortent de la circulation et les tissus pénètrent dans les conditions physiologiques normales 15. En revanche, les niveaux élevés de stress de cisaillement sont observés dans les grands navires, où extravasation des cellules est limité. Par conséquent, les taux de stress de cisaillement élevées pourraient être utilisés comme des contrôles supplémentaires pour les expériences examinant extravasation de divers types de cellules.

La survie des cellules sous la contrainte de cisaillement dépend de plusieurs facteurs, notamment le type de cellule et les traitements de cellules ex vivo (Gontcharova et al., Observations non publiées), et doit donc être soigneusement évalué au cours de l'essai. la sensibilité des cellules à différents niveaux de contrainte de cisaillement (résistance à la contrainte de cisaillement) peut être évaluée par la programmation de la pompe péristaltique à augmenter le taux de contrainte de cisaillement par incréments de 0,8 dyn / cm 2 à 6 dyn / cm 2. Lors de ces essais, les cellules peuvent être prélevés périodiquement à partir de la chambre d'échange de gaz pour surveiller la mort cellulaire en utilisant commedit comme exclusion du bleu trypan, annexine V et PI coloration, et l'expression de marqueurs de l'apoptose.

Si les expériences sont conçues pour tester la résistance de cisaillement des cellules modifiées ex vivo ou des cellules dérivées de parenchyme, il est recommandé que les contrôles positifs supplémentaires, telles que les cellules transmises par le sang, sont incluses dans les expériences.

Sélection de la taille des pores de la pièce rapportée et le revêtement ECM

Les inserts sont disponibles avec plusieurs tailles de pores (3, 5 et 8 pm). Le choix de la taille des pores va dépendre de la taille et les propriétés des cellules d'essai en circulation, ce qui est également le cas pour les essais statiques TRANSWELL. Inserts avec une taille de pores (8 pm) sont recommandés pour tester extravasation de grandes cellules comme les cellules tumorales d'origine épithéliale. Leucocytes ou de cellules souches hématopoïétiques sont plus souvent testés avec 5 inserts pores um et 3 inserts pores um Il vaut mieux réserver pour tester extravasation de scellules maller. Toutefois, la taille de la cellule d'essai seul n'est pas le seul facteur important et nous vous recommandons de tester inserts avec plusieurs tailles de pores.

Dans nos premières études, nous avons testé différents ECM pour leur capacité à soutenir la croissance de la CE sur les inserts et à résister au stress de cisaillement pour> 4 heures. L'ECM testés comprenaient Matrigel, poly-D-lysine, la fibronectine, la laminine, collagène de type I, hydrogel, Meta-kératine I, II, III, IV et extracellulaire. Les meilleurs résultats de croissance CE ont été obtenus avec extracellulaire, la fibronectine et le collagène. Cependant, dans nos mains, extracellulaire à 0,8 g / cm 2 réduit de manière significative la transmigration des cellules de test à travers la membrane. Par conséquent, nous utilisons maintenant la fibronectine (5 ug / cm 2) ou de collagène (5 ug / cm 2) pour le revêtement des inserts. Cependant, le choix optimal de l'ECM sera probablement influencée à la fois par le type de CE et les propriétés transmigratoires des cellules d'essai. Une expérience préliminaire doit être effectué pour tester la Integrité de la monocouche CE cultivé sur ECM sélectionné. Par exemple, placer des inserts pré-enduits monocouches avec la CE dans des boîtes de Pétri remplies de milieu de culture, placez les plats sur un agitateur pour créer la contrainte de cisaillement (valeur faible), et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 12 heures. L'intégrité de la CE après une exposition à la contrainte de cisaillement peut être évaluée en utilisant la coloration au cristal violet.

Sélection des concentrations cellulaires de test optimales

La capacité des cellules de test à la sortie de la circulation dépend de plusieurs caractéristiques propres à chaque type de cellule. Pour générer des résultats statistiquement significatifs, la densité cellulaire circulation doit être optimisé pour s'assurer qu'un nombre suffisant de cellules migrent dans les puits de contrôle positif. Par conséquent, nous vous recommandons d'effectuer les premiers tests avec une gamme de densités cellulaires (par exemple 10 3 / ml à 10 7 / ml) pour comprendre la relation entre le nombre de cellules chargées dans le système etle nombre de cellules qui subissent la transmigration.

En outre, la concentration de circulation optimal peut être différent pour le même type de cellules obtenues à partir de différentes sources. Par exemple, les cellules CD34 + sont une population hétérogène de cellules contenant à la fois des cellules souches hématopoïétiques et engagés progéniteurs lignée spécifiques. Ils peuvent être obtenus à partir de la moelle osseuse, sang périphérique mobilisé, et sang de cordon ombilical. Les cellules CD34 + provenant de ces trois sources possèdent des capacités différentes à tête chercheuse et la greffe 16-18, si les conditions de l'essai de ces cellules dans le dispositif 3D doivent être optimisés avant une étude à grande échelle.

Sélection des temps de circulation optimale des cellules

Le temps de circulation optimale doit être déterminée de façon empirique pour chaque type de cellule. Le temps minimum requis pour la circulation pourrait être extrapolé à partir des résultats des essais de migration statiques, mais cela peut être eXtended lorsque les cellules sont soumises à une contrainte de cisaillement. Des études pilotes d'essais des temps de circulation entre 4 et 96 heures est recommandée.

L'unité d'échange de gaz

Le but principal de l'unité d'échange de gaz est de maintenir la concentration optimale de CO 2 dans le milieu circulant à travers le dispositif 3D, similaire aux réglages dans les incubateurs de culture de tissus standards. L'unité d'échange de gaz peut également être utilisé pour l'ajout de cellules de test et de composés et pour la collecte des sondes et des échantillons au cours du test.

L'évaluation du nombre de cellules de test

Cellules circulantes peuvent être échantillonnés à différents moments au cours de l'expérience à travers l'unité d'échange de gaz. A la fin de l'expérience, les cellules restantes dans la circulation pourraient être collectées à partir de la sortie. Lorsque le dispositif 3D est démonté à la fin de l'expérience, les cellules transmigré peuvent être récoltées à partir des puits inférieurs et recueillies fou une analyse plus approfondie. Si les cellules d'entrée sont sans étiquette, les cellules transmigré peuvent être colorées au bleu trypan et des cellules vivantes / morts dénombrées au microscope. Alternativement, les cellules d'entrée peuvent être étiquetés avec l'un des nombreux "tracker" colorants cellulaires disponibles pour l'imagerie des cellules vivantes avant de les charger dans l'appareil 3D, dans ce cas, le récoltés transmigré cellules doivent être lysées pour la quantification de la fluorescence.

Sélection de la taille optimale de l'échantillon

Pour permettre une analyse statistique, un échantillon doit être sélectionné qui fournira environ 80% de puissance pour détecter la différence hypothétique dans les variations en pourcentage moyennes entre les deux groupes lors du test à un niveau de signification de 0,05 en utilisant un test t bilatéral. Basé sur notre expérience avec des cellules de la moelle osseuse, nous utilisons trois puits par condition expérimentale pour les expériences de périphériques 3D. Toutefois, la taille optimale de l'échantillon varie avec le but de l'expérience et doit être déterminé empirically. Plusieurs tests de régression statistique, recto verso t-tests et des analyses de variance peuvent être utilisés pour vérifier la pertinence statistique des résultats.

Sélection des chimiokines

Comme pour tous les tests de transmigration, le choix de chemoattractant sera dictée par les propriétés des cellules de test et l'objectif de l'étude. SDF-1 est un facteur chimiotactique bien établie pour les cellules hématopoïétiques. Dans nos mains, une concentration de 50 ng / ml SDF-1 était optimale pour stimuler l'extravasation des os des cellules progénitrices hématopoïétiques issues de la moelle. Nous utilisons aussi C3a et bFGF comme chemoattractants de cellules souches mésenchymateuses 19. Cependant, nous recommandons titrant chacun chimiokines et cross-titrage des combinaisons de chimiokines pour identifier la plage de concentration optimale avant une étude à grande échelle. Pour certains types de cellules, une combinaison de facteurs chimiotactiques peut être bénéfique. Si chimiokines pour les cellules d'essais spécifiques sont inconnus ou inaccessibles, conmédias ditioned de lymphocytes stimulés, les fibroblastes et d'autres cellules peuvent être utilisés comme une source de chemoattractants.

Sélection des paramètres lecture

La polyvalence de l'appareil 3D va étendre le type d'expériences de transmigration qui peuvent être effectuées, et le succès des expériences dépendra de réflexion approfondie et la conception des paramètres de lecture. En règle générale, les cellules recueillies à partir du compartiment supérieur (circulant) et le compartiment inférieur (statique) doivent être testés pour la viabilité en même temps que le comptage des cellules. Certaines cellules possèdent une faible tolérance à la contrainte de cisaillement physiologique observé dans le système microvasculaire. Dans ce cas, le nombre de cellules mortes sera augmentée dans le compartiment supérieur. Le nombre de cellules adhérentes arrêtés (ou piégés) sur la couche CE peut être évalué par immunohistochimie de marqueurs exprimés spécifiquement par les cellules de test. Des anticorps spécifiques pour CD31 et FvW peuvent être utiliséspour détecter les CE et pour permettre une discrimination entre les cellules de test et la CE. En outre, l'intégrité de la monocouche CE doit être surveillée à la fin de chaque test.

Les types d'analyses effectuées avec les cellules recueillies dépendra objectifs expérimentaux les enquêteurs, mais pourraient inclure des changements d'analyse de l'expression des gènes par microarrays et qPCR, l'expression des molécules de surface par analyse FACS, l'activation des voies de signalisation par FACS et Western blot, et le facteur sécrétion par ELISA. Un énorme éventail de tests fonctionnels sont possibles sur les cellules recueillies in vitro, comme en témoigne notre propre travail dans lequel nous cultivé les cellules de la moelle osseuse transmigré pour dénombrer les cellules progénitrices hématopoïétiques (Figure 3). Les échantillons recueillis pourraient également être testés dans une variété d'essais in vivo.

Un paramètre important qui peut aider à prédire le comportement des cellules d'essai in vivo est la tendancerence de certaines cellules à former des agrégats sous différents taux de cisaillement. Par exemple, les cellules thérapeutiques qui subissent la formation d'agrégats dans le dispositif 3D pourraient avoir une plus grande tendance à former des amas Après administration intraveineuse et causer une obstruction vasculaire aiguë in vivo (Gontcharova et al., Observations non publiées). Formation d'agrégats pourrait être surveillé au microscope par échantillonnage des cellules de test pendant ou après la fin de l'expérience de l'appareil 3D.

Déclarations de divulgation

Cascade LifeSciences Inc. possède les droits exclusifs de brevet n ° US 7,927,867 B2 "Dispositif d'évaluation dans la migration cellulaire in vitro dans des conditions d'écoulement et les méthodes de leurs usages». SKK est un inventeur de la technologie de l'appareil de la chambre de flux 3D et un co-fondateur scientifique et actionnaire de Cascade LifeSciences Inc.

Remerciements

Nous remercions Chuck Scott et Victor McKnight de la CBS Scientific Company Inc. ( www.cbsscientific.com ) pour l'assistance technique et la fabrication de la chambre 3D, l'unité d'échange de gaz et inserts. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (subventions R21DK067084 et R43CA141782 à SKK).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactif/Matériau
Tube PVC (alésage 1,42, paroi 0,8)Watson-Marlow Limitid981.0142.000
Chambre 3DC.B.S.ScientificFC-1000
Échangeur de gazC.B.S.ScientificFCR-1000
InsertsC.B.S.ScientificFCI-1005U
Collagène Bovin, Type IBD Biosciences354231
Acide chlorhydrique 0.1MVWRBDH3200-1
PBSInvitrogen14190
HUVECLonzaCC- 2517
EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)LonzaCC - 3124
Solution neutralisante de trypsineLonzaCC-5002
TrypsineLonzaCC-5012
HEPESLonzaCC-5024
SDF-1R7D System460-SD
Extracel Trial 2.5 KitGlycosam ByosystemsGS211
Fibronectine, humaine , natureBD Biosciences356008
Poly-D-lysineMilliporeA-003-E
BD MatrigelBD Biosciences354277
Cerveau humain Cellules endothéliales microvasculairesScienCell1000
Milieu cellulaire endotélial (ECM) pour cellules cérébralesScienCell1001
Trypan BlueStemCells Tecnologies7050
TNF-alfa, 10 &mu ; gInvitrogenPHC3015
VCAM-1, souris anti-humaine, CD106-FITCSouthern Bioteck9519-02
Coloration à l’iodure de propidium SolutuionBD Pharmingen# 556463 Sang
de cordon humain congelé CD34+ cellulesStemCellCB007F
Sang de cordon humain congelé CD34+ cellulesZenbioSER - CD34-F
MethoCult GF M3434StemCells TecnologiesGFM3434
Souris Méthylcellulose média completR& DHSC007
Anti-Von Willibrand Factoranticorps abcamC# ab11713
Boîte de Petry (35 x 10 mm)VWRCA25373-041
Tubes de 15 mlVWR Fisher21008 - 918
Fioles de culture tissulaire 75cm2VWRBD353136
Cristal violetSigmaC-3886-25G
Pince à dissection, courbeVWR82027-384
1 000 &mu ; l Pointes de pipetteVWR83007-380
1 - 200 &mu ; l Pointes de pipetteVWR37001-530
Equipment
Pompe péristaltiqueWatson-Marlow Limitid403U/VM3

Références

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Mots-clés

Monocouche de cellules endoth lialesContr le de pompe p ristaltiqueFraction vasculaire stromaleEssai de migration cellulaireAnalyse du gradient de chimiokinesUnit d change gazeuxRev tement d insert poreux

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