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Modèles d’interaction gène-environnement pour démasquer les mécanismes de susceptibilité dans la maladie de Parkinson

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DOI :

10.3791/50960

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7 janvier 2014

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1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Dans cet article

Résumé

Les isozymes lipoxygénase (LOX) peuvent générer des produits qui peuvent augmenter ou diminuer la neuroinflammation et la neurodégénérescence. Une étude d’interaction gène-environnement pourrait identifier les effets spécifiques de l’isozyme LOX. L’utilisation du modèle 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) des dommages nigrostriatal dans deux lignées transgéniques déficientes en isozyme LOX permet de comparer la contribution des isozymes LOX sur l’intégrité dopaminergique et l’inflammation.

Résumé

L’activité de la lipoxygénase (LOX) a été impliquée dans des désordres neurodegenerative tels que la maladie d’Alzheimer, mais ses effets dans la pathogénie de la maladie de Parkinson (palladium) sont moins compris. Les modèles d’interaction gène-environnement ont l’utilité de démasquer l’impact de voies cellulaires spécifiques dans la toxicité qui peuvent ne pas être observées en utilisant uniquement un modèle de maladie génétique ou toxique. Pour évaluer si les isozymes distincts de LOX contribuent sélectivement au neurodegeneration PD-connexe, des souris transgéniques(c.-à-d. 5-LOX et 12/15-LOX déficientes) peuvent être contestées avec une toxine qui imite des dommages de cellules et la mort dans le désordre. Ici nous décrivons l’utilisation d’une neurotoxine, 1 methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), qui produit une lésion nigrostriatal pour élucider les contributions distinctes des isozymes de LOX au neurodegeneration lié au palladium. L’utilisation de MPTP chez la souris, et le primate non humain, est bien établie pour récapituler les dommages nigrostriatal dans le palladium. L’ampleur de la lésion causée par MPTP est mesurée par l’analyse hplc de la dopamine et de ses métabolites et l’analyse occidentale semi-quantitative de tache du striatum pour l’hydroxylase de tyrosine (TH), l’enzyme taux-limitante pour la synthèse de la dopamine. Pour évaluer les marqueurs inflammatoires, qui peuvent démontrer la sensibilité isozyme-sélective de LOX, la protéine acide fibrillaire glial (GFAP) et immunohistochemistry Iba-1 sont exécutées sur des sections de cerveau contenant le nigra de substantia, et l’analyse occidentale de tache de GFAP est exécutée sur des homogénats striatal. Cette approche expérimentale peut fournir de nouvelles informations sur les interactions gènes-environnement sous-jacentes à la dégénérescence nigrostriatale et à la MP.

Introduction

L’utilisation de modèles d’interaction gène-environnement fournit une approche pour imiter les facteurs de risque qui influencent probablement la maladie de Parkinson idiopathique (MP) et offre l’occasion de discerner des idées mécanistes qui sont peu susceptibles d’être élucidées par l’utilisation d’un système génétique ou toxique seul1,2. Ici nous illustrant ce point et décrivons l’application du modèle murin 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) de la dégénérescence nigrostriatale3 pour mieux comprendre la sélectivité de l’activité isozyme de la lipoxygénase (LOX) sur la neuroinflammation et la toxicité4. Tandis qu’un rôle pour des isozymes de LOX a été largement évalué dans les désordres périphériques5,6 aussi bien que la maladie de CNS comprenant la course7 et la maladie d’Alzheimer8,9, le rôle de la famille des isozymes dans la fonction nigrostriatal et la dégénérescence liée au palladium n’est pas bien compris et justifie l’étude. La neurotoxine MPTP démontre la dégénérescence préférentielle de la voie nigrostriatal et récapitule l’épuisement striatal de dopamine et la perte dopaminergiquenigrale de cellules qui sont à la base des affaiblissements moteurs dans des patients depalladium 10. Bien que ce modèle ne reproduise pas le cadre complet des comportements de non moteurs et moteurs et de la pathologie du corps de Lewy α-synucléine-positive, il a été utile d’élucider de nouvelles cibles mécanistes qui contribuent aux dommages nigrostriatal et pour les tests translationnels à un stade précoce, car c’est le modèle non invasif le mieux caractérisé disponible pour produire de manière fiable la mort cellulaire nigrale accompagnée d’une perte de dopamine striatale11-15. L’utilisation large de la souris MPTP, avec des paradigmes allant de aiguë, subaiguë à chronique16-18, a permis la normalisation du dosage pour entraîner des dommages nigrostriatal légers à graves19,20 avec activation de différents mécanismes de toxicité en fonction du schéma thérapeutique18,21,22. Par conséquent, cela permet de cibler une « fenêtre de lésion » qui peut entraîner une lésion nigrostriatale accrue ou réduite en fonction de l’agent thérapeutique ou du modèle transgénique utilisé23-25.

Les techniques utilisées pour évaluer les dommages et les preuves que ces méthodes fournissent sont également essentielles pour les études de biologie translationnelle et de découverte. Pour le modèle murin MPTP, les mesures établies pour évaluer la lésion sont la mesure des marqueurs du tonus dopaminergique striatal, y compris la dopamine et ses métabolites par HPLC, et l’analyse western blot de la tyrosine hydroxylase (TH), l’enzyme limitant le taux dans la synthèse de la dopamine, et les indicateurs d’événements dégénératifs tels que l’activation gliale à l’aide de l’analyse western blot et de l’immunohistochimie4. Bien que ce soient des procédures neurochimiques, biochimiques, et histologiques classiques, les techniques fournissent des lectures critiques et reproductibles sur l’ampleur des dommages dans la voie dopaminergique nigrostriatal, indiquent des mécanismes de toxicité, et se sont avérées être des outils précieux en comprenant des événements dégénératifs dans le palladium.

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Protocole

Remarque : Toutes les procédures et méthodes de soins aux animaux doivent être approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement. L’étude décrite ici a été réalisée conformément aux lignes directrices établies par l’IACUC de SRI International.

1. Acquisition et entretien de souris déficientes en LOX

  1. Achetez des souris déficientes en 5-LOX ou en 12/15-LOX et des témoins respectifs de la souche et du sexe à l’âge de 7 à 8 semaines et prévoyez plusieurs jours pour l’acclimatation à l’installation après l’arrivée.
  2. Maintenir les souris dans un logement de groupe sur un cycle clair-foncé de 12 h et donner de la nourriture et de l’eau potable ad libitum.

2. Précautions, entreposage, préparation, décontamination et élimination du PMTP

Remarque: L’intoxication de MPTP de l’exposition intraveineuse chez l’homme a été montrée pour causer le parkinsonisme10; Mptp est très lipophile et peut facilement traverser la barrière hémato - encéphalique26. Des mesures de précaution devraient être prises pour assurer la manipulation, la désintoxication et l’élimination en toute sécurité. Son métabolisme implique de multiples étapes dont la conversion en 1-méthyl-4-phényl-2,3-dihydropyridinium par l’enzyme monoamine oxydase B(MAO-B)27. Les inhibiteurs de la MAO-B peuvent être utilisés en cas d’intoxication humaine accidentelle.

  1. S’assurer que le personnel a une formation appropriée en matière de sécurité et de manipulation avant d’utiliser le PMPP, tel que dicté par le comité de santé et de sécurité de l’établissement. Chaque institution peut établir et mettre en œuvre ses propres procédures opérationnelles normalisées pour l’utilisation du PMPP, en se fondant sur les recommandations détaillées énoncées dans la documentation17,22.
  2. Avant la préparation, enfilez l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris les éléments suivants : sarrau de laboratoire jetable ou combinaison complète, gants en double nitrile, masque chirurgical, couvre-cheveux, lunettes de sécurité et couvre-chaussures jetables. Un EPI approprié doit être porté pendant la préparation du MPTP, le paradigme d’injection et 72 h après l’injection lors de la manipulation des animaux et /ou de la litière.
  3. Effectuer des calculs avant la préparation. Les lignes directrices institutionnelles pour les volumes de dosage devraient être suivies; l’administration de 100-150 μl est généralement utilisée pour les souris de 25 à 30 g.
    1. Pour préparer une solution de MPTP à 3 mg/ml dans une solution saline, appliquez un facteur de correction (1.211 MPTP-HCl: base libre de 1.0 MPTP); la concentration de MPTP-HCl dans le véhicule salin est de 3,633 mg/ml.
    2. Préparer tout l’équipement, les fournitures et les réactifs nécessaires à la préparation du MPTP et à la décontamination potentielle des déversements avant de manipuler la neurotoxine.
  4. Retirez le flacon source MPTP-HCl de l’emplacement de stockage approprié.
    Remarque : Le MPTP doit être maintenu à RT dans un flacon fermé dans un contenant secondaire et entreposé dans une armoire verrouillée, étiquetée « MPTP ».
    1. Couvrir la zone entourant les écailles avec des tampons ou des serviettes en papier humidiées avec une solution d’eau de Javel à 10% pour réduire le risque de déversement de poudre. Gardez les mouchoirs et la solution d’eau de Javel à 10% à proximité par mesure de précaution.
    2. À l’aide d’une balance analytique située dans une hotte, peser 50 mg de MPTP-HCl dans un flacon en verre avec confinement secondaire contenant 10 % de tissu imbibé d’eau de Javel. Étiquetez le flacon en verre « MPTP » avec la concentration et la date.
    3. Fermez le flacon source et essuyez l’extérieur avec 10% d’eau de Javel.
  5. Ajouter lentement une solution saline stérile de 13,763 ml au flacon et fermer complètement pour le mélange. (La solution est de 3,633 mg / ml MPTP-HCl.)
    1. Dans la hotte, stériliser soigneusement la solution de MPTP par filtration à l’aide d’un filtre de 0,22 μm dans un flacon d’injection marqué dans un récipient secondaire contenant 10% de tissu imbibé d’eau de Javel. Nettoyez tout déversement avec du tissu imbibé d’eau de Javel.
    2. Jetez soigneusement les objets pointus et tranchants et les flacons dans un contenant de biorisque étiqueté de façon appropriée. Maintenir la solution de MPTP dans un flacon dans le récipient secondaire avec du tissu imbibé d’eau de Javel pour le transport vers la salle d’intervention animale.
      Remarque: ne pas autoclaver la solution de MPTP pour la stérilisation car sa vaporisation est un danger d’inhalation.
  6. Retournez le flacon source MPTP à son conteneur secondaire et placez-le dans un emplacement de stockage. Décontaminez la spatule, l’échelle analytique et la surface de la hotte pendant 10 min en utilisant 10% d’eau de Javel.

3. Administration du PMPP

  1. Préparez des cages jetables avec des couvercles perforés microisolateurs standard contenant des doublures filtrées en polyester marquées « MPTP » (moins le gril alimentaire à fil), des revêtements de cage jetables, des granulés alimentaires pré-humides et de l’hydrogel comme source d’eau. Peser tous les animaux et enregistrer le volume de 3 mg/ml de MPTP dans une solution saline nécessaire pour une injection de 15 mg/kg.
    Note: Les métabolites du MPTP sont détectables dans les excréments pendant 3 jours suivantl’injection28,29; cependant, les souris excrètent le n-oxyde de MPTP, un dérivé non toxique qui ne traverse pas les membranes en raison de sonhydrophilie 30.
    1. Porter tous les EPI énumérés ci-dessus et tenir les souris sur un tampon d’absorption jetable, injecter un véhicule salin ou une solution de MPTP pour une dose de 15 mg/kg dans la cavité intrapéritonéale (p.i.), tous les jours pendant 4 jours avec une seringue à tuberculine jetable de calibre 26.
    2. Ne récapitulez pas la seringue après utilisation; jeter dans un contenant d’objets pointus et tranchants biodanges de MPTP dédié et étiqueté. Maintenez 10 % d’eau de Javel et de tissus à proximité pour nettoyer tout goutte-à-goutte accidentel.
  2. Placez les animaux injectés avec mptp dans des cages jetables, jusqu’à 5 souris par cage, et maison sur des racks ouverts. N’utilisez pas de supports ventilés.
    1. Placez mptp utiliser des plaques sur rack contenant des souris et la porte de la salle de logement jusqu’à 72 h après la dernière injection.
      Remarque: assurez-vous que la température de la pièce de logement est comprise entre 22,2 et 24,4°C, car les souris souffrent d’hypothermie transitoire jusqu’à 12h après l’intoxication au MPTP. 31 ans
    2. Décontaminer la surface de travail avec de l’eau de Javel après chaque utilisation (voir l’étape 2.8), éliminer les restes de solution de MPTP en additionnant un volume équivalent à 10 % d’eau de Javel et jeter le contenu sous forme de déchets liquides présentant un biodurbaine.
    3. Jeter tous les EPI usagés dans un bac d’élimination dédié. Si nécessaire, vaporiser avec 10% d’eau de Javel avant de l’éliminer.
  3. Vérifiez régulièrement les animaux et rafraîchissez la source de nourriture et d’eau tous les jours pendant le paradigme d’injection et 72 h après la dernière injection. Remarque : bien qu’aucune contamination ne soit prévue dans la zone entourant immédiatement l’extérieur de la cage, cette région est traitée avec la solution d’eau de Javel par mesure de précaution (tel que décrit à l’étape 2.8). Des précautions doivent être prises lors de la manipulation de toutes les souris et de tout l’équipement pendant cette période.
    1. Trois jours après la dernière injection, jeter toutes les cages et doublures dans un sac de biorisque étiqueté de manière appropriée. Reprendre l’utilisation d’EPI régulier et d’un logement normal pour les animaux; enlever les plaques-étiquettes des portes et des étagères.

4. Récolte de tissus

  1. Euthanasier des animaux par luxation cervicale 7 jours suivant la dernière injection de MPTP. Disséquer immédiatement le cerveau sur la glace à l’aide d’une moisissure cérébrale pré-refroidie avec des fentes de 1 mm dans le plan coronal.
  2. Disséquer le striatum d’une tranche de cerveau antérieur de 2 mm d’épaisseur au niveau de la commissure antérieure.
    1. Enlevez les régions corticales et sous-corticales environnantes à l’aide d’un scalpel. Snap-gel tissu striatal de chaque hémisphère dans un tube de microcentrifuge séparé de 1,5 ml pour l’analyse neurochimique ou biochimique.
  3. Bloquer le mécèbre/cerveau postérieur dans le plan coronal au niveau de l’hypothalamus antérieur et du tissu d’immersion-fixer dans la solution aqueuse de formaldéhyde à 4%.

5. Traitement des tissus

  1. Procédé de biochimie
    1. Homogénéiser le tissu striatal d’un hémisphère à l’aide d’un perturbateur cellulaire ultrasonique dans un tampon de lyse Tris-EDTA de 200 μL (base tris 25mM, EDTA 1mM, cocktails inhibiteurs de protéase et de phosphatase 1:100) pour 10 impulsions à 10-12 Hz et centrifugé pendant 10 min à 4°C à 1000xg.
    2. Aspirez soigneusement le surnageant et reconstituez le culot dans un tampon de lyse de 150 μl. Les fractions sont utilisées pour l’analyse biochimique par SDS-PAGE et western blotting.
      Remarque: utilisez la protéase et le tampon contenant des inhibiteurs de phosphatase dans les 1 h suivant la préparation en raison de l’instabilité dans les solutions aqueuses.
  2. Procédé de neurochimie
    1. Utiliser le striatum disséqué d’un autre hémisphère à partir de chaque échantillon stocké à -80 °C pour la CLHP. Décongeler les tissus striatal dans des tubes de microfuges sur de la glace, ajouter de l’acide perchlorique (APC) de 500 μl et homogénéiser à l’aide d’un sonicateur.
      Remarque: Pour faire 100 ml d’APC 0,3N, mesurer 90 ml ddH2O, ajouter à un cylindre gradué de 100 ml, ajouter 2,58 ml de PCA à 70% et porter à 100 ml la marque. Cet échantillon de tampon peut être conservé à 4 °C jusqu’à un mois.
    2. Soniquez le tissu striatal dans 500 μl glacé 0.3N PCA, pour 10 impulsions à 10-12 Hz et placez sur la glace. Pour assurer l’homogénéité, soniquer des échantillons une deuxième fois pendant 10 sec, puis centrifuger pendant 12 min à 4°Cà 16 100xg.
    3. Décantant immédiatement le surnageant à 1,5 ml de tubes microcentrifuges et conserver à -80 °C. Sécher à l’air la fraction de pastille dans le capot.
    4. Maintenir le surnageant à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé pour la mesure de la dopamine et de ses métabolites, de l’acide 3,4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC) et de l’acide homovanillique (HVA) par CLHP avec détection électrochimique.
    5. Une fois sec, reconstituer la fraction de pastille en NaOH 0,5N (500 μL) et soniquer brièvement. Conserver la fraction de granulé reconstituée à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour la détermination de la protéine totale à l’aide de la méthode Lowry.
  3. Procédé d’immunohistochimie
    1. L’immersion-fix mid- et hind-brain bloque pendant la nuit dans une solution aqueuse de formaldéhyde à 4% et cryoprotecte dans des solutions de saccharose graduées (10% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS 0,01 M; NaCl 0,138 M, KCl 0,0027 M et ddH2O, pH 7,4) pendant 24 h, puis 30% dans pbs jusqu’à ce que le tissu s’enfonce) à 4 °C. Éponger brièvement les blocs cryoprotégés pour éliminer l’excès de solution de saccharose, congeler sur de la glace carbonique et conserver à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
    2. Sectionnement de microtome des blocs de cerveau contenant le milieu et l’arrière-cerveau dans un cryostat.
      1. Retirer les tissus de -80 °C, les équilibrer à -16 °C pendant 1 h dans le cryostat et les monter dans les milieux d’incorporation des tissus.
      2. Recueillir des sections coronales d’une épaisseur de 40 μm dans une solution cryoprotectrice (PBS 0,01 M avec 30 % de saccharose, éthylène glycol à 30 %, pH 7,4) à -16 °C. Recueillir les tissus en série dans 6 tubes de microcentrifugation de 1,5 ml à des intervalles de 240 um et les stocker à -20 °C.

6. Immunoblotting

  1. Déterminer la concentration de protéines dans la fraction surnageante striatale (préparée comme décrit à la section 5.1) par analyse de bca.
  2. Calculer la dilution requise pour que chaque échantillon donne 10 μg par puits livré dans 20 μl de volume.
  3. Diluer la protéine surnageante avec 4X tampon Laemmli et tampon d’homogénéisation pour donner 10 μg de protéines dans 1X solution tampon Laemmli. Exemple de calcul :
    1. Déterminer la concentration finale de protéines et le volume requis. Dans ce cas, 10 μg dans 20 μl (0,5 mg/ml) est requis.
    2. Déterminer le volume final de la solution protéique nécessaire. Bien que 20 μl soit nécessaire pour le chargement, un volume supplémentaire doit être préparé (30 μl).
    3. Étant donné que le volume final et la concentration sont connus et que la concentration de la fraction surnageante protéique est connue (déterminée par le test BCA), calculer le volume du surnageant protéique requis à l’aide de l’équation suivante :
      Vsurnageant = (Vfinal x Cfinal)/C surnageant
      Ainsi, pour une concentration en protéines surnageantes de 1,5 mg/ml,
      Vsurnageant = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Vsurnageant = 10 μl
    4. Calculer la quantité de tampon Laemmli 4X requise pour obtenir une concentration de 1x dans 30 μl de volume (30 μl / 4 = 7,5 μl). Remarque: Le tampon Laemmli 4X doit être dilué à une concentration de 1X dans la préparation de l’échantillon.
    5. Calculer la quantité de tampon d’homogénéisation nécessaire pour amener le volume à 30 μl (et obtenir la concentration finale souhaitée de protéines de 0,5 mg/ml) :
    6. Préparer l’échantillon en tourbillonnant puis piper 10 μl de surnageant protéique dans 12,5 μl de tampon d’homogénéisation. Ajouter 7,5 μl de tampon Laemmli 4X pour une solution de travail d’échantillon de 30 μl et une concentration de 0,5 mg/ml.
  4. Préparer tous les échantillons en utilisant la procédure décrite, le vortex et l’ébullition pendant 5 min.
    Remarque: Utilisez des tubes à microcentrifugation à vis pour éviter les fuites et l’ouverture dues à la pression pendant l’ébullition.
  5. Après 5 min, placez immédiatement sur la glace. Charger 20 μl de solution de travail de l’échantillon par puits de gel (10 μg de protéines). Échantillons de protéines séparés par SDS-PAGE sur un gel de Tris-glycine à 12%.
    1. Utilisez une échelle protéique pré-colorée pour confirmer les poids moléculaires. Le tampon d’exécution est de 25 mM Tris-base, 192 mM de glycine, 0,1% SDS, et ddH2O, pH 8,3.
    2. Séparer les protéines par électrophorèse: courir à 80 V pour dégager les puits (10 min) et 125 V (environ 1 h; jusqu’à ce que l’échelle des protéines soit complètement séparée) pour résoudre les protéines.
  6. Effectuer le transfert de protéines en nitrocellulose à l’aide d’une membrane de nitrocellulose de 0,2 μm dans un tampon de transfert de trisglycine (tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS à 0,04 %, méthanol à 20 % et ddH2O, pH 8,3) pendant la nuit pendant 40 V à 4 °C.
  7. Laver les taches de nitrocellulose dans 1x Tris salin (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl en ddH2O,pH 7,4) pendant 10 min à RT. lncubate dans Ponceau S pendant 5 min puis rincer en ddH2O pour fournir une vérification approximative de la charge protéique équivalente. Numérisez l’image pour conserver l’enregistrement du bloc-notes et destain à l’aide de PBS.
    Remarque : Par ailleurs, la tache de lavage en Milli-Q ou en ddH2O contenant du HCl (0,2 %) pendant environ 5 min. Rechercher l’enregistrement. Enlever la tache Ponceau S de la membrane par l’étape d’incubation suivante (c.-à-d. placer dans le tampon de blocage).
  8. Bloquer les taches dans 5% de lait en poudre non gras dans TS pendant 1 h à RT et incuber 24h à 4ºC avec de l’anti-tyrosine hydroxylase de lapin (1:1000), del’anti-β-actine (1:200); anti-GFAP (1:1000) dans 5% lait-TS.
  9. Laver les taches 3 x 5 min dans le ST avec 0,05 % de Tween-20 et 1 x 5 min dans le ST, puis incuber dans un anticorps secondaire conjugué au HRP (1:5000 dans le ST contenant 5 % de lait), apparié à l’espèce du primaire, pendant 2 h à TA.
  10. Préparer le substrat chimioluminescent en utilisant des volumes égaux de solutions de luminol et de peroxyde et appliquer pendant 1-3 min. Dans une chambre noire, placez une tache dans un manchon en plastique pour l’exposition au film et exposez-le au film; le film est ensuite développé à l’aide d’un processeur automatique.
  11. Décapage à bandes avec tampon de décapage disponible dans le commerce à 37 °C pendant 30 min, laver 3 x 10 min dans le ST avec 0,05 % de Tween-20 et 1 x 10 min dans le SNT, puis reprobe pour le contrôle du chargement ou d’autres protéines d’intérêt.
  12. Quantifier les signaux par le logiciel Image J pour les mesures de densité optique et normaliser au contrôle de charge interne β-actine.

7. Neurochimie

  1. Les tissus à analyser sont préparés de la manière décrite ci-dessus à la section 5.2. Veuillez vous référer au tableau 1 pour la recette de la phase mobile.
    Remarque : Tous les réactifs doivent être purs ≥99,0 % et de qualité CLHP. Assurez l’intégrité du tampon avec de la verrerie propre et dédiée et des barres d’agitation. Le tampon de phase mobile doit être utilisé dans les sept jours suivant la préparation.
    1. Peser le phosphate dihydrogène et l’acide citrique, ajouter 1 L deddH2Oet mélanger dans un cylindre gradué de 2 L. Filtrer la solution à travers une membrane GSTF de 0,22 μm.
      Remarque: Cela maximise l’extraction des contaminants dans le phosphate et l’acide citrique, ce qui aide à minimiser les courants de fond.
    2. Ajouter l’AOS suivi de l’acétonitrile et de la solution d’EDTA. Ajouter la clhp ddH2O à environ 1900 ml avant d’ajuster le pH à 3,0 avec de l’acide phosphorique.
    3. Ajouter la clhp ddH2O à la marque de 2 L, puis verser dans une fiole de 2 L. Ajouter une barre d’agitation dédiée et dégazer la phase mobile en l’agitant sous vide pendant > 10 min.
  2. Préparer les normes pour la dopamine, et DOPAC et HVA pour les courbes standard. Les solutions d’origine des étalons sont préparées à 1 mg/ml dans 0,3 N PCA.
    1. Peser 12,4 mg de dopamine-HCl, et ajouter 10,0 ml de 0,3 N PCA pour faire 1 mg/ml de dopamine.
    2. Peser 10,0 mg de DOPAC et ajouter 10,0 ml de 0,3 N PCA pour obtenir 1 mg/ml de DOPAC.
    3. Peser 10,0 mg d’HVA et ajouter 10,0 ml d’APC de 0,3 N pour obtenir 1 mg/ml d’AVP.
  3. Préparez des solutions standard de travail à partir des solutions de stock. Les étalons à cinq points sont utilisés pour générer une courbe de concentration.
    1. Pour la mesure de la dopamine striatale, préparer des concentrations standard de 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml et 200 ng/ml.
    2. Pour le DOPAC striatal, préparer des concentrations standard de 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml et 40 ng/ml.
    3. Pour l’HVA striatal, préparer des concentrations étalons de 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml et 80 ng/ml.
    4. Générer des étalons à cinq points : diluer 1 mg/ml de solution mère de dopamine à 5 μg/ml à l’aide de 0,3N PCA. Diluer la solution mère dopac à 1 mg/ml à 1 μg/ml à l’aide de l’APC à 0,3N, et diluer la solution mère d’HVA à 1 mg/ml à 2 μg/ml à l’aide de l’APC à 0,3N.
    5. Transpercer 1 ml de dopamine à 5 μg/ml, 1 ml de DOPAC à 1 μg/ml et 1 ml d’HVA à 2 μg/ml dans une fiole jaugée de 25 ml et porter le volume à 25 ml avec 0,3 N PCA.
      Note: Les étalons mixtes dans la fiole jaugée contiennent la concentration la plus élevée des étalons à cinq points: 200 ng/ml de dopamine, 40 ng/ml de DOPAC et 80 ng/ml de HVA.
    6. Transférer 1 ml des étalons mélangés dans des tubes microcentrifugés propres de 1,5 ml. Effectuez une dilution en série 1:1 quatre fois pour générer les étalons à quatre points suivants.
      1. Par exemple, à 250 μl des étalons mixtes, ajouter 250 μl de tampon d’échantillon et de vortex à fond pour produire des étalons mélangés à 50 % des concentrations initiales; répéter le processus jusqu’à ce que les dilutions souhaitées soient atteintes.
  4. Préparer le système HPLC (pompe, échantillonneur automatique, colonne en phase inverse (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Purgez la pompe avec de la phase mobile fraîche pour remplacer toute la solution précédente dans le système HPLC et les bulles d’air piégées avec une phase mobile fraîche. Refroidir l’échantillonneur automatique à 4 °C. Réchauffer la colonne à 35 °C, ce qui réduit la pression totale.
    1. Réglez la tension à -150 mV et 220 mV pour les première et deuxième électrodes du détecteur électrochimique, respectivement. Équilibrer le système pendant au moins 2 h, et idéalement pendant une nuit, avec la phase mobile à un débit de 0,2 ml/min.
      Remarque: Pendant l’équilibre les cellules devraient être sur, et la lecture de ligne de base surveillée. Une lecture stable indique que le système est prêt à l’emploi. Pendant les deux heures de la phase d’équilibre, laissez la phase mobile entrer dans un conteneur à déchets au lieu de le recirculer. Passé cette période, la phase mobile peut être recyclée du jour au lendemain pour l’équilibration.
    2. Une fois l’équilibrage terminé, régler le débit de phase mobile à 0,6 ml/min. Injecter 20 μl de chacune des normes en cinq points.
  5. Décongeler les échantillons striatal sur la glace et injecter 2 x 20 μl de chaque échantillon dans le système HPLC. Utilisez des étalons au début et au hasard dans chaque ensemble d’échantillons striatal.
  6. Utilisez le logiciel pour analyser la zone sous les pics de dopamine, DOPAC et HVA produits par les normes et les échantillons. Identifier les analytes par temps de rétention et mesurer en comparant la surface sous crête à celle de la courbe à 5 points pour son étalon correspondant.
  7. Préparer la fraction de granulés comme décrit à la section 5.2.3. Effectuer un test de protéines lowry sur la pastille striatale. Remarque : Ce test mesurera la quantité de protéines présentes dans les échantillons striatal en mg/ml; cette information est utilisée pour déterminer la concentration de ng/mg d’analyte.

8. Immunohistochimie

  1. Double immunofluorescence GFAP/TH
    1. Retirer les tubes contenant le mécène sectionné du congélateur à -20 °C et les amener à RT. Retirer les sections de tissu contenant du substantia nigra de la solution cryoconservatrice dans un plateau contenant du PBS.
    2. Placez des sections de tissu dans des inserts en polystyrène avec des fonds en maille de polyester pour l’immunochimie flottante. Laver 3 x 5 min en PBS.
    3. Transférer des sections sur une plaque de 96 puits avec une solution de bloc de 180 μl (5 % de sérum d’âne normal, 1 % de PVP, 1 % de BSA et 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS) dans chaque puits. Incuber 40 min à TA.
      Remarque: Toutes les étapes de lavage et d’incubation sont effectuées avec une légère agitation sur le shaker.
    4. Transférer des sections vers des puits contenant la solution d’anticorps primaires (180 μl par puits). Incuber dans un cocktail d’anticorps primaires, anti-GFAP pour lapin (1:1000) et anti-TH pour moutons (1:400) dilués dans du PBS avec 1 % de BSA et 0,3 % de TX-100, pendant 24 h à 4 °C. IgG de l’espèce primaire sert de contrôle immunostaining négatif.
    5. Incuber dans un cocktail d’anticorps secondaires (1:200 âne anti-lapin 568 et 1:200 FITC âne anti-mouton dans pbs avec 0,1% TX-100). Utilisez du papier d’aluminium pour protéger la solution de la lumière pendant la préparation et l’incubation; incuber à TA pendant 2 h.
      1. Pour un témoin négatif, incuber des sections en IgG de l’espèce primaire diluées à la même concentration que celle utilisée pour les anticorps primaires.
      2. Laver 2 x PBS et 1 x TS pendant 5 min chacun à RT. Monter des sections de tissu sur des lames plus dans un milieu de montage avec une tache de Hoechst et une lamelle de couverture.
    6. Incuber dans un cocktail d’anticorps secondaires (1:200 âne anti-lapin 568 et 1:200 FITC âne anti-mouton dans pbs avec 0,1% TX-100). Utilisez du papier d’aluminium pour protéger la solution de la lumière pendant la préparation et l’incubation; incuber à TA pendant 2 h.
    7. Laver 2 x PBS et 1 x TS pendant 5 min chacun à RT. Monter des sections de tissu sur des lames plus dans un milieu de montage avec une tache de Hoechst et une lamelle de couverture.
    8. Protéger les lames de la lumière et de l’oxydation jusqu’à l’imagerie en les stockant dans une boîte à glissière à 4 °C.
    9. Analysez d’abord le témoin négatif pour déterminer le niveau de fond de fluorescence, puis évaluez l’immunoréactivité positive à l’aide de la microscopie fluorescente.
  2. Immunohistochimie Iba1 avec précipitation chromagène
    1. Retirer les tubes contenant le mécène sectionné du congélateur à -20 °C et les amener à RT. Retirer les sections de tissu contenant du substantia nigra de la solution cryoconservatrice dans un plateau contenant du PBS.
    2. Placer des sections de tissu dans des inserts en polystyrène pour l’immunochimie flottante. Laver les sections 3 x 5 min dans du PBS et placer les sections directement dans une plaque de 12 puits contenant de l’acide citrique monohydraté préchauffé de 10 mM, pH 9,0, 80 °C pendant 30 min, pour la récupération de l’épitope.
    3. Plaque froide 20 min à RT. Retournez les sections aux inserts et lavez 3 x 5 min dans pbs.
    4. Transférer des sections sur une plaque de 96 puits contenant une solution bloquante de 180 μl (10 % de sérum de chèvre normal, 1 % de BSA dans du PBS) par puits, et incuber 40 min à TA.
    5. Transférer des sections dans des puits contenant 180 μl d’anticorps primaires dilués (1:1000 dans 1 % de BSA-PBS). Incuber pendant la nuit à 4 °C.
    6. Transférer des sections vers des insertions. Laver 3 x 5 min PBS et appliquer l’anticorps secondaire biotinylé (1:200 dans le sérum-PBS normal à 1,5%) pendant 1 h à droite.
    7. Préparer la solution ABC 30 min avant utilisation. Laver 3 x 5 min PBS et transférer en solution ABC pendant 1 h à RT.
    8. Préparer la solution de DAB dans la hotte. Laver 2x 5 min en PBS et 1x 5 min en TS, et incuber des sections dans DAB.
      1. Développer pendant 3-4 min. Le contrôle négatif doit rester de couleur claire.
        Remarque: effectuez cette étape dans la hotte car le DAB est un cancérogène connu. Une solution de permanganate de potassium 0,2 M dans leddH2O pour la décontamination doit être maintenue à proximité en cas de gouttes accidentelles.
    9. Rincer brièvement lessections en ddH2 O, puis en TS 3 x 5 min. Montez des sections sur des glissières plus et séchez à l’air pendant la nuit dans la hotte.
    10. Décontaminer les déchets de DAB d’un volume égal de permanganate de potassium de 0,2 M dans leddH2O,vortex et incuber dans une hotte pendant la nuit avant de les stocker dans une poubelle DAB étiquetée de manière appropriée dans la hotte.
      Remarque : La solution d’eau de Javel n’élimine pas les propriétés mutagènes du DAB.
      1. Décontaminer les articles à réutiliser (c.-à-d. les inserts en polystyrène) et les laver avec du détergent.
    11. Déshydrater/contre-tache légèrement avec du cresyl violet (CV). Toutes les étapes de déshydratation/lavage sont de 3 min : éthanol 70%, 95%, 100%, 95%,ddH2O,CV (30 secondes), ddH20 x 2, éthanol à 95% + acide acétique glacial (0,1%) x 2, éthanol à 100 % et xylène.
    12. Lamelle de couverture dans un milieu de montage distyrène-toluène-xylène et sèche dans la hotte.
    13. Observez une immunoréactivité positive au microscope optique. IgG de l’espèce primaire sert de contrôle immunostaining négatif.

9. Statistiques

  1. Évaluer les différences entre les moyens au moyen d’une analyse de variance à sens unique (ANOVA) pour comparer les différences entre le génotype et par L’ANOVA bidirectionnelle pour comparer les différences entre le génotype et le traitement toxique. Utiliser l’analyse post hoc HSD de Tukey lorsque des différences sont observées par des tests ANOVA(p≤0,05).
    Remarque : les expériences (avec n = 6-9 souris/groupe) sont effectuées au moins deux fois pour assurer la reproductibilité.

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Résultats

Ce paradigme d’exposition de toxine peut produire un épuisement significatif et discernable de dopamine striatal de 20% chez les animaux MPTP- contre des animaux salin-injectés. Il est important de noter que différents lots de MPTP peuvent donner légèrement plus ou moins de lésion; ainsi, pour une meilleure précision, une expérience préliminaire chez des souris de type sauvage est recommandée avant utilisation en transgénique lorsqu’un nouveau lot de neurotoxine est utilisé. L’utilisation de lésions légères à modérées pe...

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Discussion

La conception de cette étude d’interaction gène-environnement nous a permis d’obtenir de nouvelles informations concernant la double nature de l’isozyme 5-LOX dans la voie nigrostriatal. En effectuant hplc pour mesurer les monoamines striatal après traitement salin ou MPTP dans les transgéniques dépourvus de l’isozyme 5-LOX et leurs littermates de type sauvage, nous avons pu noter que sa carence semble être protectrice dans des conditions toxiques (Figure 1), mais dans des conditions normales, l’absence ...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par le NIGMS 056062 des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorhydrate de 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétra-hydropyridine (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896pour la modélisation
Solution de formaldéhyde à 4 % (paraformaldéhyde), tamponnée au phosphate (PFA)American MasterTech ScientificBUP0157pour la fixation par immersion
Réactif ACS d’acide perchlorique, 70 % (PCA)Sigma-Aldrich244252pour l’extraction de l’acide
HPLCTris BaseSigma-AldrichT1503pour l’homogénéisation tissulaire
ÉthylènediaminoteAcide traacétique disodium dihydraté (EDTA)Sigma-AldrichE1644pour l’homogénéisation tissulaire
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseSigma-AldrichP8340pour l’homogénéisation des tissus
Cocktail d’inhibiteurs de phosphataseSigma-AldrichP5726pour l’homogénéisation des tissus
Hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma-AldrichS5881pour le dosage des protéines de Lowry
Saccharose, biologie moléculaire, &ge ; 99,5 % (GC)  ;Sigma-AldrichS0389pour la cryoprotection
Solution saline tamponnée au phosphate, poudre, pH 7,4 (pour 0,01 M PBS)Sigma-AldrichP3813pour IHC
BCA Kit de dosage des protéinesPierce/Thermo23225pour la détermination
des protéines Novex 12 % Tris-Glycine Mini Gels 1,0 mm, 12 puitsInvitrogen/Life TechnologiesEC60052BOXpour échantillon SDS-PAGE
NuPAGE LDS Tampon (4x)Invitrogen/Life TechnologiesNP0007pour SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  ;Invitrogen/Life TechnologiesLC5800protéique
GlycineSigma-AldrichG7126pour SDS-PAGE
Dodécylsulfate de sodium, électrophorèse, 98,5 % (SDS)Sigma-AldrichL3771pour SDS-PAGE
Alcool méthylique, anhydre, réactif  ;MasterTech ScientificSPM1057Cméthanol pour transfert
Chlorure de sodium (NaCl), réactif ACSSigma-AldrichS9888solution saline et tampons
Lait écrémé en poudre en poudreCarnationn/apour immunobuvardage
Ponceau S solution dans de l’acide acétique à 5 %  ;Sigma-AldrichP7170pour l’immunobuvardage
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), polyclonal ovinChemicon/MilliporeAB1542pour l’immunofluorescence  ;
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), polyclonal de lapinPel-Freez BiologicalsP40101-0pour l’immunobuvard
Anti-&beta ; Actine, lapinSigma-AldrichA2066pour l’immunobuvardage
Protéine Acide Fibrillaire Anti-Gliale (GFAP), polyclonal de lapinChemicon/MilliporeAB5804pour l’immunofluorescence
Protéine Acide Fibrillaire Anti-Gliale (GFAP), souris monoclonaleCovance Inc.SMI-22Rpour l’immunobuvard
Tween-20Sigma-AldrichP1379pour l’immunobuvard
IgG anti-lapin de chèvre (H+L), peroxydase conjuguée  ;Fisher Scientific31462pour l’immunofluorescence
chèvre anti-mouton, peroxydase conjuguéePierce/Thermo31480pour l’immunofluorescence
chèvre anti-souris, peroxydase conjuguéePierce/Thermo31430pour l’immunofluorescence
SuperSignal West Pico Substrat chimiluminescentPierce/Thermo34078pour immunobuvard
CL-XPosure Film 7 po x 9,5 poPierce/Thermo34089pour immunobuvard,
Restore Western Blot Stripping Buffer  ;Pierce/Thermo21059pour immunobuvard
Acide citrique monohydraté, réactif ACS, &ge ; 99,0 %  ;Sigma-AldrichC1909pour IHC
Sérum d’âne normalMilliporeS30-100MLpour IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP)Sigma-AldrichP5288pour IHC
Albumine sérique bovine (BSA), lyophiliséSigma-AldrichA3294pour IHC
Triton X-100Fisher ScientificBP151-01pour IHC
IgG anti-Lapin Âne, Alexa Fluor 568-labellisé  ;Invitrogen/Life TechnologiesA10042pour IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  ;Jackson ImmunoResearch713-095-147pour IHC
VECTASHIELD Hard-Set Medium avec DAPIVector LaboratoriesH-1500pour IHC
Normal Goat SerumMilliporeS26-100MLpour IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  ;Vector LaboratoriesPK-4001pour IHC ; 10 & micro ; l chacune des solutions A et B pour 1 ml de PBS (selon les instructions)
Kit de substrat de peroxydase DAB, 3,3'-diaminobenzidineVector LaboratoriesSK-4100pour IHC ; par 5 ml de ddH2O froid, ajouter 2 gouttes de solution mère tampon, 2 gouttes de DAB et 1 goutte de H2O2 (H2 O2 est ajouté immédiatement avant utilisation)
Peroxyde d’hydrogène, 30216763Sigma-Aldrichpour l’étape de trempe dans IHC
Rabbit anti-Iba1Biocare MedicalsCP290Apour
solution de violet de crésyle IHC, force régulière  ;FD NeurotechnologiesPS102-01Contre-coloration pour Iba1 IHC
95 % Éthanol, alcool réactifSigma-AldrichR8382déshydratation pour IHC
100 % Éthanol absoluMallinckrodt7019-10déshydratation pour IHC
Acide acétiqueSigma-AldrichA6283décoloration pour IHC
XylèneSigma-Aldrich534056nettoyant pour IHC
DPX MountantSigma-Aldrich06522support de montage pour DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  ;Milieu d’encastrementMasterTech ScientificEMOCTCS
Permanganate de potassiumSigma-Aldrich223468pour décontaminer la solution DAB
Chlorhydrate de dopamineSigma-AldrichH8502HPLC
3,4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC)Sigma-Aldrich850217
l’acide homovanillique HPLC (HVA)Sigma-AldrichH1252pour HPLC
Acide perchlorique (PCA) - 70 %Sigma-Aldrich244252pour HPLC
Dihydrogénophosphate de sodium monohydratéSigma-Aldrich71504pour HPLC
Acide citrique monohydratéSigma-AldrichC1909pour HPLC
1-Acide octanesulfonique sel de sodium (OSA)Sigma-AldrichO8380pour HPLC
EDTASigma-AldrichE1644pour HPLC
AcétonitrileEMDAX0145-1pour HPLC
Eau distillée déminéralisée de qualité HPLC (ddH2O)Milliporepour HPLC
0.22 µ ; m Membrane GSTFMilliporepour filtration
Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477insert en polystyrène avec fond en maille polyester, pour
perturbateur de cellules à ultrasons IHC (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
MicrocentrifugeuseEppendorf5414R
ESA MD-150 colonne en phase inverse  ;ESA
(Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
(Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
Cellulede garde ESACoulochem III
Celluled’analyse ESA5020
Logiciel ChromeleonDionex
Eclipse E400NikonE400Microscope photo/fluorescent
Cage à souris jetableAncareN10HT
Tête de microfiltreAncareN10MBT
Souris déficientes en 5-LOXThe Jackson Laboratory 004155
Souris déficientes en 12/15-LOXThe Jackson Laboratory002778
échelle American  % agent américain pour la découpe du cryostat pour l’acide pour Pompe HPLC Échantillonneur automatique HPLC Détecteur électrochimique

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Mod les de la maladie de Parkinsonisozymes de la lipoxyg naseprovocation la neurotoxine MPTPanalyse du taux de dopamineanalyse par Western blotmarquage immunohistochimiqued tection de la tyrosine hydroxylaseprot ine gliale fibrillaire acideimmunohistochimie Iba 1

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