Les isozymes lipoxygénase (LOX) peuvent générer des produits qui peuvent augmenter ou diminuer la neuroinflammation et la neurodégénérescence. Une étude d’interaction gène-environnement pourrait identifier les effets spécifiques de l’isozyme LOX. L’utilisation du modèle 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) des dommages nigrostriatal dans deux lignées transgéniques déficientes en isozyme LOX permet de comparer la contribution des isozymes LOX sur l’intégrité dopaminergique et l’inflammation.
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Article de méthode
Modèles d’interaction gène-environnement pour démasquer les mécanismes de susceptibilité dans la maladie de Parkinson
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’activité de la lipoxygénase (LOX) a été impliquée dans des désordres neurodegenerative tels que la maladie d’Alzheimer, mais ses effets dans la pathogénie de la maladie de Parkinson (palladium) sont moins compris. Les modèles d’interaction gène-environnement ont l’utilité de démasquer l’impact de voies cellulaires spécifiques dans la toxicité qui peuvent ne pas être observées en utilisant uniquement un modèle de maladie génétique ou toxique. Pour évaluer si les isozymes distincts de LOX contribuent sélectivement au neurodegeneration PD-connexe, des souris transgéniques(c.-à-d. 5-LOX et 12/15-LOX déficientes) peuvent être contestées avec une toxine qui imite des dommages de cellules et la mort dans le désordre. Ici nous décrivons l’utilisation d’une neurotoxine, 1 methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), qui produit une lésion nigrostriatal pour élucider les contributions distinctes des isozymes de LOX au neurodegeneration lié au palladium. L’utilisation de MPTP chez la souris, et le primate non humain, est bien établie pour récapituler les dommages nigrostriatal dans le palladium. L’ampleur de la lésion causée par MPTP est mesurée par l’analyse hplc de la dopamine et de ses métabolites et l’analyse occidentale semi-quantitative de tache du striatum pour l’hydroxylase de tyrosine (TH), l’enzyme taux-limitante pour la synthèse de la dopamine. Pour évaluer les marqueurs inflammatoires, qui peuvent démontrer la sensibilité isozyme-sélective de LOX, la protéine acide fibrillaire glial (GFAP) et immunohistochemistry Iba-1 sont exécutées sur des sections de cerveau contenant le nigra de substantia, et l’analyse occidentale de tache de GFAP est exécutée sur des homogénats striatal. Cette approche expérimentale peut fournir de nouvelles informations sur les interactions gènes-environnement sous-jacentes à la dégénérescence nigrostriatale et à la MP.
Introduction
L’utilisation de modèles d’interaction gène-environnement fournit une approche pour imiter les facteurs de risque qui influencent probablement la maladie de Parkinson idiopathique (MP) et offre l’occasion de discerner des idées mécanistes qui sont peu susceptibles d’être élucidées par l’utilisation d’un système génétique ou toxique seul1,2. Ici nous illustrant ce point et décrivons l’application du modèle murin 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) de la dégénérescence nigrostriatale3 pour mieux comprendre la sélectivité de l’activité isozyme de la lipoxygénase (LOX) sur la neuroinflammation et la toxicité4. Tandis qu’un ....
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Protocole
Remarque : Toutes les procédures et méthodes de soins aux animaux doivent être approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement. L’étude décrite ici a été réalisée conformément aux lignes directrices établies par l’IACUC de SRI International.
1. Acquisition et entretien de souris déficientes en LOX
- Achetez des souris déficientes en 5-LOX ou en 12/15-LOX et des témoins respectifs de la souche et du sexe à l’âge de 7 à 8 semaines et prévoyez plusieurs jours pour l’acclimatation à l’installation après l’arrivée. ....
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Résultats
Ce paradigme d’exposition de toxine peut produire un épuisement significatif et discernable de dopamine striatal de 20% chez les animaux MPTP- contre des animaux salin-injectés. Il est important de noter que différents lots de MPTP peuvent donner légèrement plus ou moins de lésion; ainsi, pour une meilleure précision, une expérience préliminaire chez des souris de type sauvage est recommandée avant utilisation en transgénique lorsqu’un nouveau lot de neurotoxine est utilisé. L’utilisation de lésions légères à modérées pe.......
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Discussion
La conception de cette étude d’interaction gène-environnement nous a permis d’obtenir de nouvelles informations concernant la double nature de l’isozyme 5-LOX dans la voie nigrostriatal. En effectuant hplc pour mesurer les monoamines striatal après traitement salin ou MPTP dans les transgéniques dépourvus de l’isozyme 5-LOX et leurs littermates de type sauvage, nous avons pu noter que sa carence semble être protectrice dans des conditions toxiques (Figure 1), mais dans des conditions normales, l’absence .......
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Déclarations de divulgation
Il n’y a rien à divulguer.
Remerciements
Ces travaux ont été financés par le NIGMS 056062 des National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorhydrate de 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétra-hydropyridine (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | pour la modélisation |
| Solution de formaldéhyde à 4 % (paraformaldéhyde), tamponnée au phosphate (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | pour la fixation par immersion |
| Réactif ACS d’acide perchlorique, 70 % (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | pour l’extraction de l’acide |
| HPLCTris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | pour l’homogénéisation tissulaire |
| ÉthylènediaminoteAcide traacétique disodium dihydraté (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | pour l’homogénéisation tissulaire |
| Cocktail d’inhibiteurs de protéase | Sigma-Aldrich | P8340 | pour l’homogénéisation des tissus |
| Cocktail d’inhibiteurs de phosphatase | Sigma-Aldrich | P5726 | pour l’homogénéisation des tissus |
| Hydroxyde de sodium (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | pour le dosage des protéines de Lowry |
| Saccharose, biologie moléculaire, &ge ; 99,5 % (GC) ; | Sigma-Aldrich | S0389 | pour la cryoprotection |
| Solution saline tamponnée au phosphate, poudre, pH 7,4 (pour 0,01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | pour IHC |
| BCA Kit de dosage des protéines | Pierce/Thermo | 23225 | pour la détermination |
| des protéines Novex 12 % Tris-Glycine Mini Gels 1,0 mm, 12 puits | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | pour échantillon SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Tampon (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | pour SDS-PAGE |
| Novex Sharp Prestained Protein Standard ; | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protéique |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | pour SDS-PAGE |
| Dodécylsulfate de sodium, électrophorèse, 98,5 % (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | pour SDS-PAGE |
| Alcool méthylique, anhydre, réactif ; | MasterTech Scientific | SPM1057C | méthanol pour transfert |
| Chlorure de sodium (NaCl), réactif ACS | Sigma-Aldrich | S9888 | solution saline et tampons |
| Lait écrémé en poudre en poudre | Carnation | n/a | pour immunobuvardage |
| Ponceau S solution dans de l’acide acétique à 5 % ; | Sigma-Aldrich | P7170 | pour l’immunobuvardage |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), polyclonal ovin | Chemicon/Millipore | AB1542 | pour l’immunofluorescence ; |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), polyclonal de lapin | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | pour l’immunobuvard |
| Anti-&beta ; Actine, lapin | Sigma-Aldrich | A2066 | pour l’immunobuvardage |
| Protéine Acide Fibrillaire Anti-Gliale (GFAP), polyclonal de lapin | Chemicon/Millipore | AB5804 | pour l’immunofluorescence |
| Protéine Acide Fibrillaire Anti-Gliale (GFAP), souris monoclonale | Covance Inc. | SMI-22R | pour l’immunobuvard |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | pour l’immunobuvard |
| IgG anti-lapin de chèvre (H+L), peroxydase conjuguée ; | Fisher Scientific | 31462 | pour l’immunofluorescence |
| chèvre anti-mouton, peroxydase conjuguée | Pierce/Thermo | 31480 | pour l’immunofluorescence |
| chèvre anti-souris, peroxydase conjuguée | Pierce/Thermo | 31430 | pour l’immunofluorescence |
| SuperSignal West Pico Substrat chimiluminescent | Pierce/Thermo | 34078 | pour immunobuvard |
| CL-XPosure Film 7 po x 9,5 po | Pierce/Thermo | 34089 | pour immunobuvard, |
| Restore Western Blot Stripping Buffer ; | Pierce/Thermo | 21059 | pour immunobuvard |
| Acide citrique monohydraté, réactif ACS, &ge ; 99,0 % ; | Sigma-Aldrich | C1909 | pour IHC |
| Sérum d’âne normal | Millipore | S30-100ML | pour IHC |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | pour IHC |
| Albumine sérique bovine (BSA), lyophilisé | Sigma-Aldrich | A3294 | pour IHC |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | pour IHC |
| IgG anti-Lapin Âne, Alexa Fluor 568-labellisé ; | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | pour IHC |
| Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC ; | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | pour IHC |
| VECTASHIELD Hard-Set Medium avec DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | pour IHC |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | pour IHC |
| VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) ; | Vector Laboratories | PK-4001 | pour IHC ; 10 & micro ; l chacune des solutions A et B pour 1 ml de PBS (selon les instructions) |
| Kit de substrat de peroxydase DAB, 3,3'-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | pour IHC ; par 5 ml de ddH2O froid, ajouter 2 gouttes de solution mère tampon, 2 gouttes de DAB et 1 goutte de H2O2 (H2 O2 est ajouté immédiatement avant utilisation) |
| Peroxyde d’hydrogène, 30 | 216763 | Sigma-Aldrich | pour l’étape de trempe dans IHC |
| Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | pour |
| solution de violet de crésyle IHC, force régulière ; | FD Neurotechnologies | PS102-01 | Contre-coloration pour Iba1 IHC |
| 95 % Éthanol, alcool réactif | Sigma-Aldrich | R8382 | déshydratation pour IHC |
| 100 % Éthanol absolu | Mallinckrodt | 7019-10 | déshydratation pour IHC |
| Acide acétique | Sigma-Aldrich | A6283 | décoloration pour IHC |
| Xylène | Sigma-Aldrich | 534056 | nettoyant pour IHC |
| DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | support de montage pour DAB IHC |
| O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium ; | Milieu d’encastrement | MasterTech Scientific | EMOCTCS |
| Permanganate de potassium | Sigma-Aldrich | 223468 | pour décontaminer la solution DAB |
| Chlorhydrate de dopamine | Sigma-Aldrich | H8502 | HPLC |
| 3,4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | |
| l’acide homovanillique HPLC (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | pour HPLC |
| Acide perchlorique (PCA) - 70 % | Sigma-Aldrich | 244252 | pour HPLC |
| Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté | Sigma-Aldrich | 71504 | pour HPLC |
| Acide citrique monohydraté | Sigma-Aldrich | C1909 | pour HPLC |
| 1-Acide octanesulfonique sel de sodium (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | pour HPLC |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | pour HPLC |
| Acétonitrile | EMD | AX0145-1 | pour HPLC |
| Eau distillée déminéralisée de qualité HPLC (ddH2O) | Millipore | pour HPLC | |
| 0.22 µ ; m Membrane GSTF | Millipore | pour filtration | |
| Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | insert en polystyrène avec fond en maille polyester, pour |
| perturbateur de cellules à ultrasons IHC (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | |
| Microcentrifugeuse | Eppendorf | 5414R | |
| ESA MD-150 colonne en phase inverse ; | ESA | ||
| (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | |
| (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | |
| Cellule | de garde ESA | Coulochem III | |
| Cellule | d’analyse ESA | 5020 | |
| Logiciel Chromeleon | Dionex | ||
| Eclipse E400 | Nikon | E400 | Microscope photo/fluorescent |
| Cage à souris jetable | Ancare | N10HT | |
| Tête de microfiltre | Ancare | N10MBT | |
| Souris déficientes en 5-LOX | The Jackson Laboratory 004155 | ||
| Souris déficientes en 12/15-LOX | The Jackson Laboratory | 002778 |
Références
- Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
- Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment intera....
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Réimpressions et autorisations
