Cellules de mammifères autonome bioluminescentes pour la surveillance continue et en temps réel de la cytotoxicité

Résumé

Les cellules de mammifères exprimant la cassette du gène de bioluminescence bactérienne ( Lux) Produire de la lumière de manière autonome. La dynamique bioluminescentes résultant lors de l'exposition chimique a été démontrée pour tenir compte des effets du traitement sur la croissance cellulaire et le métabolisme, ce qui rend ces cellules un, outil peu coûteux en temps réel continue dépistage toxicité qui peut être facilement adaptée pour l'automatisation à haut débit.

Résumé

Basés sur les cellules de mammifères dans des essais in vitro ont été largement utilisés comme alternatives à l'expérimentation animale pour les études toxicologiques mais ont été limités en raison des coûts financiers et temporels élevés de la préparation d'échantillons en parallèle qui sont rendues nécessaires en raison de la nature destructrice des méthodes de dépistage luciférase à base de luciole . Cette vidéo décrit l'utilisation de cellules de mammifères autonome bioluminescentes, qui ne nécessite pas l'ajout destructrice d'un substrat luciférine, comme une méthode peu coûteuse et facile de surveiller les effets cytotoxiques d'un composé d'intérêt. Cellules de mammifère exprimant de manière stable la bioluminescence bactérienne plein (luxCDABEfrp) de la cassette du gène de produire de manière autonome un signal optique que des pics à 490 nm, sans l'addition d'un substrat de luciférine coûteux et susceptibles d'interférer, l'excitation par une source d'énergie externe, ou la destruction de l'échantillon qui est traditionnellement effectué au cours de la procédure d'imagerie optiques. Cette indépendance de la stimulation extérieure place la charge pour maintenir la réaction de bioluminescence uniquement de la cellule, ce qui signifie que le signal qui en résulte est détectée seulement au cours du métabolisme actif. Cette caractéristique rend la lignée cellulaire lux exprimant un excellent candidat pour une utilisation comme biosentinel contre les effets cytotoxiques parce que les changements dans la production de bioluminescence sont révélateurs d'effets négatifs sur la croissance cellulaire et du métabolisme. De même, le caractère autonome et le manque de destruction de l'échantillon requis permet l'imagerie répétée du même échantillon en temps réel tout au long de la période d'exposition aux substances toxiques et peuvent être effectuées sur plusieurs échantillons en utilisant l'équipement d'imagerie existant de manière automatisée.

Introduction

Aux États-Unis, les produits pharmaceutiques et autres produits destinés à la consommation humaine nécessitent une évaluation approfondie avant qu'ils soient approuvés pour utilisation par les consommateurs par la Food and Drug Administration. Le fardeau financier pour réaliser ce test est placé sur le développeur ^1, ce qui augmente considérablement le coût de développement de nouveaux composés et donc se traduit par une augmentation des coûts pour les consommateurs. Alors que traditionnellement une grande partie de ce dépistage a utilisé des sujets animaux pour agir comme mandataires pour des hôtes humains, ce qui s'est avéré être un grand fardeau....

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Récupérez un flacon de cellules bioluminescentes HEK293 de l'azote stock congelé liquide et les cultiver dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 0,01 mm acides aminés non essentiels, 1x antibiotiques antimycosiques et 0,01 mM pyruvate de sodium dans un T ₇₅ flacon de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO _2.
   Remarque: Les médias et les composants supplémentaires varient en fonction de lignées cellulaires et doivent donc être choisis en conséquence.
2. Actualiser moyenne tous les 2-3 jours jusqu'à atteindre ~ 80% de confluence. ....

Résultats

Dans cette étude, la dynamique des cellules autobioluminescent HEK293 ont été surveillés en continu sur une période de 24 heures en réponse à l'exposition aux antibiotiques (Figure 1). Les effets toxiques de cet antibiotique, qui est un membre de la famille de la bléomycine connus pour tuer les cellules vivantes en se liant à et cliver l'ADN ^13, ont été démontrés par l'intermédiaire d'une diminution de la production de bioluminescence par rapport aux cellules non traitées, qui.......

Discussion

Cette méthode illustre l'utilisation de cellules de mammifères autonome bioluminescentes comme un test de dépistage de la cytotoxicité in vitro qui permet aux cellules vivantes à être surveillés en permanence au cours de leur vie. Ce protocole est flexible et peut être modifié pour tenir compte des conditions expérimentales spécifiques selon les besoins. Par exemple, l'expérience présentée ici est approprié pour le suivi des effets toxiques aigus, mais peut être adapté pour évaluer les effets à.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
IVIS Lumina	PerkinElmer		D’autres modèles IVIS et lecteurs de plaques basés sur PMT peuvent également être utilisés
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		De nouvelles mises à jour de ce logiciel sont disponibles
75 cm2 flacons traités pour culture cellulaire	Corning	430641
plaques traitées pour culture tissulaire à 6 puits	Costar	07-200-83
Plaque noire à 24 puits	Greiner Bio-One	662174	plaques à 96 ou 384 puits peuvent être utilisées pour des applications à haut débit
Sérum salin tamponné au phosphate	Hyclone	SH30910
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM),	Hyclone	SH30284
Sérum fœtal bovin	Hyclone	SH3091003
Acides aminés non essentiels, 100x	Life Technologies	11140050
antibiotique-antimycosique, 100x	Life Technologies	15240062
Pyruvate de sodium, 100mM	Life Technologies	11360070
zéocine, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Tripsin, 0,05 %	Life Technologies	25300062

sans rouge de phénol