Une méthode innovante pour Exosome Quantification et Taille Mesure

La fonction exacte des exosomes circulant restée inconnue pendant une longue période de temps. Même maintenant le mécanisme de chemin d'accès complet des exosomes est pas entièrement comprise. Depuis exosomes portent des antigènes, des protéines et de l'ARN (ARNm et des miRNA) qui les concerne leur cellule d'origine des parents, leur fonction de cellule-cellule émetteurs de signalisation a essentiellement été donné la priorité.

De nombreux procédés différents ont été décrits dans la littérature pour l'isolement et la détection quantitative d'exosomes ^1,2. Toutefois, aucun consensus sur une «norme d'or» a été atteint. Pendant ce temps la majorité des scientifiques actifs dans le domaine de la recherche exosomes conviennent qu'une méthode cohérente de l'isolement est fortement justifiée pour atteindre un plus haut degré de comparabilité entre les différents rapports et études.

Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) est l'outil le plus commun et répandu pour l'analyse des exosomes ^3. FACS a benEFIT que, par marquage par fluorescence, des cellules d'origines différentes peuvent être comparés à une étape. Les inconvénients majeurs de FACS sont que cette méthode ne est pas assez sensible pour identifier les particules inférieures à 0,5 pm ^4, tandis que les exosomes sont généralement comprises entre 30 à 120 nm de diamètre ^5, encore moins de mesurer leur taille.

La microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à transmission (MET) d'autres outils d'analyse de taille de particule et la morphologie des exosomes. Toutefois, les deux SEM et TEM ont l'inconvénient que la préparation des échantillons est beaucoup de temps, les deux méthodes impliquent étapes de main-d'œuvre et chacun a un risque de génération artefact. Ni méthode est adaptée pour un débit d'échantillonnage élevée et la caractérisation de plusieurs milliers de particules individuelles d'un échantillon. En outre, une analyse quantitative de routine quotidienne clinique où les échantillons doivent souvent être analysé simultanément ou au moins dans une très courte période estdifficile à réaliser. De nouvelles techniques de production nous permettent maintenant d'analyser exosomes sans travaux préparatoires intensifs avant (SEM par exemple, de l'environnement). Ces techniques modernes sont encore assez gênant pour l'analyse de grandes suspensions de volume contenant exosomes afin de déterminer leur nombre moyen et la distribution de la taille ^6.

Une autre méthode très sensible pour la visualisation et l'analyse des exosomes est l'analyse de nanoparticules de suivi (NTA). Cette méthode tire parti de deux principes différents de la physique. Tout d'abord, des particules sont détectées par la lumière diffusée quand ils sont irradiés avec un faisceau laser. Le second phénomène est appelé mouvement brownien, selon lequel la diffusion des différentes particules dans une suspension liquide est inversement proportionnelle à leur taille. Dans ce dernier cas, le mouvement dépend aussi de la température et de la viscosité du liquide. Cependant, ce taux est directement liée à la taille des particules et est utilisé par NTA. Utilisation douceanalyse basée-ware, des images numériques de la lumière diffusée par les particules simples sont enregistrées. Lots de taches lumineuses dispersées et leur vitesse de déplacement fournissent des données qui facilitent la détermination du nombre total des particules et la distribution granulométrique. Cette technique est particulièrement puissant pour l'analyse des particules d'un diamètre moyen inférieur à 100 nm.

Taille et la concentration Les mesures sont effectuées avec le ZETAview brownien et Microscope Analyse électrophorèse Video Motion. Il se agit d'un dessus de bureau nanoparticule instrument d'analyse semi-automatique pour échantillons liquides (ci-après dénommé instrument de suivi des particules). Il se compose du suivi analyseur de particules ainsi que d'un ordinateur portable avec le logiciel utilisé pour l'analyse de données. Des échantillons biologiques hétérogènes sont comme convenant à ce procédé sous forme de suspensions homogènes de plus des particules inorganiques. Microscope de diffraction laser à l'aide d'une caméra vidéo est utilisée pour la détection de particules et de la observation de leur mouvement. Bien que l'axe de microscope est horizontal et centré dans le canal de cellule remplie d'une suspension contenant des exosomes, le faisceau laser est orienté verticalement. Les particules irradiés par la dispersion de la lumière laser, qui est enregistré sous 90 ° par une caméra vidéo numérique via le microscope (Figure 1). L'intensité de la lumière diffusée permet l'observation de particules de plus grand diamètre de 60 nm. Dans un tel réglage de la luminosité d'une particule ne est pas la seule indication de la taille des particules. Si aucun champ électrique est appliqué, le mouvement des particules ne suit le mouvement brownien et peut servir d'indicateur pour le calcul de la taille des particules. Cependant, l'appareil est également capable d'appliquer un champ électrique à travers le canal de la cellule. Lorsque soumis à ce champ, le potentiel, la polarité et le niveau de charge ionique des exosomes suspendus deviennent d'autres déterminants de la direction de leur mouvement. Velocity et le résultat de direction dans un mo électrophorétiquebilité histogramme.

Bien que la recherche d'une méthode optimale pour analyser exosomes isolés ya un problème, un autre se trouve dans l'isolement d'exosomes efficace de différents supports, tels que le sang, l'ascite, l'urine, le lait, le liquide amniotique ou le support de la cellule. Différentes méthodes ont été décrites à ce jour, qui sont basées sur ^une ultracentrifugation, réactifs de séparation industriels (tels que Exoquick) ^7, des billes magnétiques pour antigène employant séparation ⁸ ou ⁹ étapes ultrafiltration.

Dans ce protocole, nous démontrons l'ensemble du processus d'isolement de exosomes par ultracentrifugation et montrons comment analyser l'exosomes résultant contenant la suspension par l'intermédiaire de l'instrument de suivi de particules. Considérations particulières relatives à l'analyse des exosomes dérivés de plasma moyennes ou de la culture de cellules humaines sont fournis.

REMARQUE: Les expériences présentées dans cet ouvrage ont été approuvés par le comité d'éthique institutionnel de l'Université de Düsseldorf.

1. Préparation Exosome

1. Prélever le sang entier dans trois tubes de citrate par ponction veineuse (total de 9 ml). Verser le sang dans un tube Falcon de 15 ml.
2. Centrifuger l'échantillon à 1 500 xg pendant 20 min à 4 ° C pour initier la séparation des cellules du plasma. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml de faucon.
3. Centrifuger l'échantillon à 2800 g pendant 20 min à 4 ° C pour éliminer toutes les cellules du plasma (plasma acellulaire; PCP). Transférer la PCP à des tubes d'ultracentrifugation, 1 ml par tube.
4. Centrifuger à 100 000 xg pendant 90 min à 4 ° C à épuiser exosomes. Retirer 900 pi de surnageant. Remettre en suspension le culot dans 100 pl les restant dans le tube d'ultracentrifugation. Ajouter 900 ul de PBS.
5. Centrifuger à nouveau 100 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Retirer 900 pi de supernatant. Re-suspendre le culot avec les 100 pi restants.
6. Transfert 5-20 ul de remise en suspension dans 40 ml d'eau distillée. Filtrer la suspension à travers un filtre de 450 nm à séparer exosomes de particules plus grosses. Utilisez cette suspension finale pour la mesure des particules.

2. Procédure de démarrage de l'instrument de suivi des particules

1. Lancez le programme en double-cliquant sur l'icône du logiciel-. Cliquez sur les différents onglets de logiciels ("Cell Check", "Mesure", "Analyse") pour basculer entre eux à travers le protocole.
2. Suivez les instructions à l'écran pour une mise en oeuvre automatique de la procédure de démarrage. Cochez les cases à la fois pour le contrôle de qualité de la cellule et de l'alignement automatique.
   NOTE: Chacune de ces étapes peuvent être répétées séparément si nécessaire par le bouton (A) ou (B) en appuyant sur l'onglet "contrôle de cellule".
3. Ouvrez l'entrée et l'orifice de sortie de l'instrument NTA et injecter 10 ml d'eau distillée avec une seringue dans le canal de la cellule à travers l'orifice d'entrée. Fermer l'orifice de sortie comme la dernière quantité d'eau est injectée. Placer un récipient sous l'orifice de sortie pour recueillir la solution de déchets. Se assurer que la cellule de mesure est exempte de bulles d'air et ne pas seringue bulles d'air dans le système. Fermez immédiatement l'orifice d'entrée.
4. Effectuer le contrôle de la qualité de la cellule en cliquant sur "OK". Le logiciel affiche les résultats de la qualité de cellule après quelques secondes.
5. Si les particules sont encore visualisées sur l'écran Live View du logiciel ou si le résultat du contrôle de la qualité ne est bon ou mauvais, répétez l'étape 2.3 jusqu'à ce que les particules restantes sont retirés de la cellule de mesure. Répéter aussi l'étape 2.3 après chaque mesure pour éviter l'accumulation de particules. Si répéter l'injection d'eau distillée et le contrôle de la cellule ne produit pas un «bon» résultat, passez à 2,9.
6. Préparer une suspension uniforme de contrôle contenant 200 nm de taille polystyrene particules à être utilisés pour aligner les foyers du laser et microscope. Ajouter une goutte de la suspension concentrée, fournie par le fabricant de l'instrument, à 500 ml d'eau distillée pour obtenir la concentration requise de telle sorte que 600 ± 100 particules par écran sont affichées en temps réel dans la carte.
7. Injecter la suspension d'alignement dans l'instrument NTA comme décrit dans l'étape 2.3. Appuyez sur "OK" pour démarrer l'alignement automatique, une routine automatisée à travers lequel le système va automatiquement trouver la position optimale des deux foyers.
8. Quand un message apparaît indiquant que le système est maintenant prêt pour des expériences, cliquez sur OK pour démarrer la mesure.
9. Occasionnellement, nettoyer le canal de la cellule entre les expériences manuellement par rinçage de la cellule avec une solution à 30% d'éthanol. Nettoyez le canal chaque fois que le logiciel affiche un rapport d'erreur automatique.

3. Mesure de l'échantillon

1. Rincer le canal avec de l'eau distillée avant eamesure de l'échantillon ch (comme décrit à l'étape 2.3).
2. Injecter la suspension de exosomes (préparé dans la section 1) pour le canal, comme décrit dans l'étape 2.3.
3. Ajustez les principaux paramètres suivants dans le logiciel selon vos besoins:
   1. Sensibilité. Afin de trouver la plage de sensibilité optimale, cliquez sur le bouton "nombre de particules par rapport Sensibilité" pour afficher une courbe pour les particules mesurées par écran pour les différents niveaux de sensibilité. Choisir un niveau de sensibilité avant de la pente maximale de la courbe. Un niveau de sensibilité plus élevée permet la visualisation de petites particules plus mais augmente également les questions liées au bruit de fond.
   2. Luminosité minimale. Choisissez un éclat de départ de 20 pour la mesure de exosome utiliser cette fonction comme un filtre. Réglementer ce paramètre jusqu'à particules fortement la lumière de diffusion sur vierges. Réglementer le bas pour amplifier faiblement diffusant artefacts. Varier la luminosité au besoin tout au long de l'expérience.
      NOTE: Les particules qui légersScatter trop fortement chevaucher et peuvent être exclues de l'analyse par erreur.
   3. Min et Max Taille. Définissez un filtre numérique pour éliminer le bruit de pixel et la dispersion indésirable de particules surdimensionnées en régulant la taille minimum et maximum. Utilisez une gamme de 10 à 500 pixels pour la mesure des exosomes.
   4. Shutter. Régler la période de temps pendant laquelle l'appareil est ouvert à 1/300 sec.
4. Vivez paramètres lus:
   1. Basculer entre un appareil photo numérique et une vue modus analogique à tout moment en cliquant sur le bouton "Live-image".
   2. Tout au long de l'expérience, surveiller la barre d'intensité de diffusion, qui indique l'état de saturation de l'échantillon en tant qu'indicateur de couleur codé. Ne pas analyser les exosomes si la barre de diffusion est rouge. Dans ce cas, diluer l'échantillon afin d'éviter ce phénomène. Si la condition expérimentale interdit une manipulation de la suspension de l'échantillon, réguler à la baisse de la sensibilité ou de réguler à la hausse la luminosité dans le logiciel-settings pour améliorer les résultats de mesure.
      REMARQUE: Lorsque les échantillons avec une concentration extrêmement élevée de particules sont analysés la dispersion va fusionner particules individuelles et ils sont comptés comme une seule particule.
   3. Notez le nombre de particules comptées dans le champ de vision de l'écran.
5. Cliquez sur l'onglet "Mesure".
6. Choisissez réglages dans le «options d'exécution" tableau.
   1. Avant chaque acquisition, sélectionnez «mouvement de contrôle» pour un test de la dérive des particules à cocher répétée. Effectuer le test au moins une fois avant de commencer toute l'analyse. Si la dérive est supérieure à 20 um / sec, attendre avant de continuer la mesure de sorte que l'échantillon se arrête de couler.
   2. Sélectionner le nombre d'expériences (5) et le retard temporel entre eux (0).
   3. Effectuer un "spécimen de chèque» si nécessaire. Ce test fait partie de l'alignement automatique de la procédure de démarrage et peut être répétée après que nécessaire.
   4. Enfin, cliquez sur le bouton "d'acquisition vidéo de fonctionner". Dans la nouvelle fenêtre, définir le nombre de cycles (15) et le nombre de positions de mesure (11).
      REMARQUE: La tête de laser et du microscope peut être déplacé à analyser le nombre de particules à 11 positions différentes. Selon la demande expérimentale, décider si l'expérience doit être effectuée sur une seule position ou sur différents postes.
      1. Confirmez la durée minimale d'une particule doit être suivi doit être considérée comme une particule individuelle par la résolution de la vidéo (faible). A des résultats plus faibles de résolution dans une durée de suivi plus courte.
      2. Sélectionnez un nom de fichier et cliquez sur "OK" pour démarrer la mesure.

   4. Interprétation des résultats

   1. Voir les résultats et les paramètres suivants affiche après la mesure sur l'onglet "Résultats": (1) le nombre total de particules tracées, (2) Nombre moyen d'une partieicles par position, et (3) la concentration de particules.
      1. Voir le tableau résultat de la moyenne pour le rapport numérique de la taille des particules (diamètre, surface et volume) au pourcentage du nombre de particules, ainsi que les valeurs de la moyenne et de la différenciation standard.
      2. Utiliser la table d'analyse de crête si plus d'un pic existe dans l'analyse graphique. Ce tableau montre la répartition des particules plus petites que la première respectivement deuxième pic.
   2. Voir le graphique calculée après la mesure de voir une distribution de particules par taille. Utilisez les icônes dans le mode d'affichage et au-dessus du graphique pour modifier les paramètres.

L'échantillon utilisé pour cette démonstration montre un réglage optimal pour la mesure avec une sensibilité de 85%, avant de la pente maximale de la courbe de sensibilité (figure 2). La luminosité, le min / max des valeurs ont été choisis comme recommandé dans le protocole. Une concentration de 5,3 particules / ml x 10 6 a été mesurée, tandis que la taille moyenne des particules était de 0,149 um, la plupart d'entre eux étaient 0,137 um.

Les valeurs reçues après la mesure peuvent être enregistrées dans un rapport avec un format de fichier .pdf ou .txt pour l'exportation dans une base de données. Le graphique peut être ajustée préféré comme décrit dans le protocole (article 4). La séquence vidéo est également enregistré et peut être utilisé pour plus tard hors ligne nouvelle analyse. Cependant, dans une telle analyse hors-ligne, les paramètres pré-acquisition de l'appareil photo ne peuvent pas être modifiées rétrospectivement.

Afin de trouver les paramètres optimaux pour une mesure, nous décrivons ici èmee optimisation des réglages de l'appareil sur l'exemple d'un 100 nm de taille standard de polystyrène. L'influence de deux paramètres, la sensibilité et min / max sur la distribution de taille d'image vidéo et la taille des particules est discuté en détail. Tous les autres paramètres sont résumés dans le tableau 1.

Une impression visuelle de l'impact de la sensibilité (allant de 50 à 94) analogiques et numériques sur des images est visualisée sur la figure 3. Les informations quantitatives dérivée à partir des images est présentée en figure 4, en fonction des paramètres du tableau 1, Min = Taille 5 Taille et Max = 200. Une relation typique du nombre de particules détectées par rapport sensibilité est représenté sur la figure 4A. Entre 50 et 90, le nombre de particules détectées a augmenté avec sensibilité et augmenté de façon spectaculaire pour les sensibilités> 90. Une gamme de sensibilité optimale a été observée entre 66 et 86 (A). les distributions de tailles des particules obtenues avec difréglages de sensibilité dif- sont montrés sur la figure 4B. Les distributions de taille de particule représentent la moyenne de trois mesures individuelles. Pour une sensibilité trop faible (sensibilité = 62, courbe rouge) à seulement quelques particules ont été analysés dans les statistiques résultant plutôt pauvres. Le nombre de particules analysées augmenté avec sensibilité et atteint un optimum entre 70 (courbe jaune) et 86 (courbe tan). Augmenter encore le fil de la sensibilité à une dégradation de la distribution de taille de particule avec le nombre de particules tombant et la distribution de taille de décalage vers des tailles plus petites (sensibilité = 94, la courbe bleue). La figure 4C montre l'évolution du diamètre de x50 à base de nombre (50% les particules sont plus petites que ce diamètre) en fonction de la sensibilité. Dans l'intervalle beige, le RSD de la taille des particules est inférieure à 8% et correspond à l'intervalle optimal dans A. Les régions rouges indiquent RSD> 8% à la suite de mauvaises statistiques (sensibilité trop bas) ou large distributions avec passage à de plus petites tailles (sensibilité trop élevée).

Les réglages de Taille Min et Max Taille des filtres sont appliqués aux images numériques afin d'éliminer les particules avec des tailles de spot inférieure à Min Taille et plus grand que Max Taille. En raison de la capacité à diffuser la lumière, une particule crée un endroit d'une certaine taille sur une image numérique. La taille de la tache est mesurée en nombre de pixels (px). Quand une particule diffuse la lumière très bien (par exemple, les particules> 200 nm ou d'agrégats), la taille du spot est assez grand, par exemple,> 500 px. La taille du spot est assez faible (par exemple, <10 px) pour les petites particules (par exemple, <20 nm) en fonction du matériau de particules. Taille du spot (px) ne peut pas être échangé avec la taille des particules (nm) car ils ne sont pas identiques et il n'y a pas de relation directe entre ces deux variables. Une optimisation de Min et Max Taille permet à l'utilisateur de filtrer les objets indésirables tels que des agglomérats (Max) ou petite tailleobjets tels que bruit de fond (Min Taille). L'influence de Min / Max Taille de la distribution de taille de particule d'une taille standard 100 nm est représentée sur la figure 4D (sensibilité = 82). Lorsque l'intervalle est réglé sur petits spots (par exemple, min = 1, max = 52; courbe orange), le nombre de particules analysées est réduite et le diamètre de x50 à base de nombre est légèrement déplacée vers de plus petites tailles. Un cadre pour les taches plus grandes (min = 40, max = 1,000; courbe rouge) se traduit par une distribution de taille de particules large décalé vers de plus grandes tailles. Pour obtenir le nombre total égales de particules, les limites de l'intervalle de deux distributions orange et rouge ont été ajustées pour correspondre à 80 particules. La distribution avec des paramètres optimaux (min = 5, max = 200; courbe tan) se compose de 360 ​​particules.

Une série d'expériences ont été effectuées avec succès exosomes isolées par ultracentrifugation et mesurées par le NTA en utilisant le système présenté. Les données résultantes ont été trèscohérente et confirmé un niveau élevé de reproductibilité. Autres méthodes d'isolement doivent montrer des résultats similaires. Cependant, l'étape de dilution a été identifié comme une étape particulièrement critique et son impact sur le nombre total de particules calculées doit être réévalué.

Figure 1. Schéma de la configuration de la NTA. L'axe de microscope / vidéo et le faisceau laser sont orientés orthogonalement par rapport à l'autre, se croisant à la section transversale du canal de la cellule. La lumière diffusée par les particules est affiché dans le "live-view" fenêtre du logiciel. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Impact de la sensibilité en mode analogique et de l'image numérique. Visualisation des particules sur l'écran en direct de vue se affiche pendant sensibilités entre 50 et 94 pour les deux analogique (rangée du haut) unD Digital (rangée du bas) vues. Lorsque la sensibilité est trop faible, à seulement quelques particules sont détectées (à gauche). Au sensibilité optimale les particules apparaissent comme des points simples et isolés les uns des autres (au milieu). À un particules de sensibilité relativement élevés fusionner conduisant à une mauvaise qualité d'image (à droite). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Influence de la sensibilité min et maxi de taille pour un échantillon contrôle à 100 nm de particules de polystyrène (A) Terrain de la sensibilité en fonction du nombre détecté de particules. l'intervalle optimal est de 66 à 86, préalablement à la pente maximale de la courbe. Distributions (B) de la taille des particules obtenues avec plusieurs réglages de sensibilité (62-94); graphiques pour trop faible (62) ou trop haute (94) la sensibilité ne tiennent pas compte de la distribution de taille de particule de 100 nm échantillon témoin de polystyrène. (C) Nombre de diamètre sur la base de x50 par rapport à la sensibilité; l'erreur de x50 dans l'intervalle beige est inférieure à 8%, l'intervalle optimal est de 66 à 86. (D) Effet de la taille minimum et maximum de la distribution de taille de particule; paramètres optimaux (min = 5 et max = 200) capturent la distribution correcte pour l'échantillon de contrôle. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. Résumé des paramètres pré- et post-acquisition pour le réglage de l'instrument de suivi de particules.

Ce travail a été soutenu par les fonds institutionnels du Département de chirurgie cardiovasculaire de la Faculté de médecine de l’HHU. Les coûts de publication de cette étude ont été pris en charge par Particle MetrixGmbH.