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Isolement de glandes multicellulaires viables à partir de tissus de la plante carnivore, Nepenthes

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DOI :

10.3791/50993

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22 décembre 2013

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1Laboratoire Agronomie et Environnement, Université de Lorraine, 2Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3aura optik

Dans cet article

Résumé

Les glandes des plantes sont des structures spécialisées responsables de la biosynthèse et de la sécrétion de nombreux composés impliqués dans les interactions avec l’environnement biotique. Pour permettre l’étude de leurs caractéristiques moléculaires et biochimiques, une technique de micropréparation mécanique a été mise au point afin d’isoler des glandes métaboliquement actives uniques, ici à partir de la plante carnivore Nepenthes.

Résumé

De nombreuses plantes possèdent des structures spécialisées qui sont impliquées dans la production et la sécrétion de composés et de protéines spécifiques de faible poids moléculaire. Ces structures sont presque toujours localisées à la surface des plantes. Parmi eux se trouvent des nectaires ou trichomes glandulaires. Les composés sécrétés sont souvent utilisés dans les interactions avec l’environnement biotique, par exemple comme attractifs pour les pollinisateurs ou dissuasifs contre les herbivores.

glandes uniques à plusieurs égards peuvent être trouvées chez les plantes carnivores. Dans les plantes dites sarracénies du genre Nepenthe, les glandes bifonctionnelles à l’intérieur du piège à fosse sécrètent d’une part le liquide digestif, y compris toutes les enzymes nécessaires à la digestion des proies, et d’autre part absorbent les nutriments libérés. Ainsi, ces glandes représentent un tissu spécialisé idéal prédestiné à étudier les mécanismes moléculaires, biochimiques et physiologiques sous-jacents de la sécrétion de protéines et de l’absorption des nutriments chez les plantes. De plus, en général, la biosynthèse des composés secondaires produits par de nombreuses plantes dotées de structures glandulaires pourrait être étudiée directement dans les glandes.

Pour travailler sur des structures aussi spécialisées, elles doivent être isolées efficacement, rapidement, métaboliquement actives et sans contamination par d’autres tissus. Par conséquent, une technique de micropréparation mécanique a été développée et appliquée pour des études sur le liquide de digestion des Nepenthes. Ici, un protocole est présenté qui a été utilisé pour préparer avec succès des glandes bifonctionnelles uniques à partir de pièges Nepenthes, sur la base d’une plate-forme de micro-échantillonnage mécanisée. Les glandes pourraient être isolées et directement utilisées pour l’analyse de l’expression génique par des techniques de PCR après la préparation de l’ARN.

Introduction

Les plantes produisent une grande variété de composés aux applications industrielles et pharmaceutiques diverses, allant de petites molécules de bas poids moléculaire à des polymères. Ces composés sont souvent produits et sécrétés par des structures hautement spécialisées, dont beaucoup sont localisées à la surface des plantes, comme les trichomes glandulaires ou les nectaires, ou en interne, comme les idioblastes ou les canaux à latex et à résine, respectivement. Toutefois, on connaît relativement peu de choses sur la biologie de ces structures sécrétoires spécialisées, bien que tous les types de ces glandes présentent de nombreuses caractéristiques indiquant un métabolisme actif. En particulier, les glandes des plantes carnivores telles que Nepenthes peuvent être considérées comme des systèmes modèles en biologie cellulaire végétale1.

Les plantes carnivores font l'objet de nombreuses études depuis 1875, date de la publication de l'ouvrage de Charles Darwin, *Insectivorous Plants*.2. Toutefois, ce n'est que ces dernières années que des recherches au niveau moléculaire ont été menées, et nos connaissances restent encore limitées. Par exemple, la composition protéique du liquide digestif chez les plantes carnivores du genre Nepenthes n'est pas encore complètement connu. Ce n'est que récemment que plusieurs protéines hydrolasiques ont été identifiées, ainsi que quelques-uns des gènes correspondants3. Dans les pièges à fosse de Nepenthes (Figure 1), des glandes pluricellulaires sont localisées au fond interne des urnes. Ces glandes produisent et sécrètent des enzymes digestives dans le liquide contenu dans l'urne, et absorbent les nutriments dissous provenant de ce liquide4. Ainsi, ces glandes bifonctionnelles représentent un microtissu unique jouant un rôle central dans la carnivorie de Nepenthes qui mérite d'être étudié en détail.

Anatomie des plantes carnivores, détail du piège de Nepenthes, étude botanique, mécanisme de piège, adaptation.
Figure 1. Nepenthes alata – piège. La partie inférieure du piège contient le liquide digestif et des glandes situées sur la paroi interne. Cliquez ici pour afficher l'image en taille plus grande.

En sciences végétales, de nombreuses approches expérimentales reposent sur des « échantillons massifs », car aucun tissu défini n'est étudié, mais plutôt des organes entiers. Par conséquent, leur homogénéisation et leur analyse ne peuvent fournir que des résultats dilués et proportionnels aux tissus et cellules individuels5. Pour résoudre ce problème, des techniques de micropréparation, comme la microdissection par capture au laser (LCM), ont été développées et utilisées avec succès afin de prélever des tissus végétaux spécifiques et d'analyser leurs contenus individuels6. Toutefois, la LCM présente souvent des limites lorsque des composants cellulaires instables et/ou rapidement dégradés, tels que l'ARN, sont ciblés. Dans ce cas, la nécessité d'une fixation préalable des tissus, procédure longue et souvent accompagnée d'une dégradation des biomolécules, constitue un inconvénient. De plus, en raison de la forte teneur en eau de nombreux tissus végétaux et de la résistance des parois cellulaires, la LCM échoue fréquemment à préparer directement à partir de tissus frais7. Toute approche visant à étudier les composants cellulaires présents dans les glandes sécrétrices, des gènes, des ARNm et des protéines aux composés secondaires et à leur biosynthèse, nécessite des techniques alternatives de préparation spécifique. Ainsi, des techniques spécifiques permettant d'isoler des cellules uniques ou même des glandes multicellulaires restant intactes après la préparation sont nécessaires.

Une méthode est présentée ici, utilisant une plateforme automatisée de microéchantillonnage dotée d'une visualisation microscopique directe. Cette technique est à la fois rapide et efficace pour la préparation de glandes individuelles provenant des urnes des espèces de Nepenthes. Ces glandes pluricellulaires sont bifonctionnelles, c.-à-d. qu'elles participent à la fois à la sécrétion et aux processus d'absorption ; elles sont sessiles, et des couches cellulaires non exposées s'imbibent pour former une endoderme. Des glandes entières peuvent être isolées sans tissu voisin et déposées de manière bien définie dans un tube PCR. Cette technique est utilisée pour étudier des gènes spécifiques ainsi que l'expression génique dans les tissus des glandes.

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Protocole

1. Préparation du matériel végétal

  1. Toutes les espèces de Nepenthes ont été cultivées soit dans les serres du MPI pour l’écologie chimique, soit dans le jardin botanique d’Iéna, en Allemagne.
  2. Pour la préparation du tissu sécrétant, prélevez un pichet et retirez le tiers supérieur, y compris le couvercle, le péristome et la zone glissante. Le pichet peut être utilisé frais ou congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80 °C.

2. Microdissection du tissu du pichet

  1. La plate-forme de microéchantillonnage se compose d’un stéréomicroscope et d’un micromanipulateur, qui est directement fixé au corps du microscope et est actionné par un joystick 3D. Ici, un premier prototype d’aureka a été utilisé comme documenté (Figure 2A).
  2. Pour la dissection des glandes sécrétoires des pichets Nepenthes, utilisez une micropince et fixez-la au manipulateur (figures 2A et 2B).
  3. Pour l’extraction de l’ARN, traitez tous les instruments (lames de rasoir, pince à épiler, micromanipulateur, micropinces, lame d’objet) avec RNaseZAP.
  4. Préparez les tubes de prélèvement en ajoutant 9 μl d’eau exempte de nucléases et 1 μl d’inhibiteur de RNase dans un tube PCR pour l’extraction de l’ARN. Pour la PCR directe à partir d’échantillons de tissus, utilisez uniquement de l’eau exempte de nucléases (10 μl).
    1. Prenez le pichet frais ou congelé et retirez un morceau de tissu de1 à 2 cm contenant les glandes sécrétoires à l’aide d’une lame de rasoir et d’une pince à épiler. Lavez le mouchoir à l’eau ; ajouter 0,1 % de diéthylpyrocarbonate (DEPC) si l’ARN doit être extrait.
    2. Fixez le matériel végétal avec du ruban adhésif double face sur une lame d’objet (la surface recouverte de glande doit être tournée vers le haut, figures 2C et 2D) et fixez la lame avec du ruban adhésif sur une platine universelle, qui doit être appliquée avec une table mobile.
    3. Pour extraire les acides nucléiques, la préparation doit se faire sur de la glace. Prenez donc une boîte plate en polystyrène, placez la platine universelle contenant l’échantillon à l’intérieur et remplissez la boîte de glace. Ensuite, placez la boîte sous le microscope.
    4. Pour la préparation, le positionnement des glandes est très important. Les glandes sécrétoires sont partiellement recouvertes d’un capuchon de protection (Figure 3) et accessibles uniquement par la pince d’un côté. De plus, l’angle de l’échantillon par rapport à la pince doit être ajusté en inclinant la table de la platine universelle d’environ 135°, selon l’espèce de Nepenthes.
    5. La microdissection se fait sous contrôle visuel. Pour l’isolement des glandes, utilisez un filtre non UV, afin de limiter la dégradation de l’ADN et de l’ARN.
    6. Déplacez le micromanipulateur et la pince via le panneau de commande jusqu’au presse-étoupe sélectionné. Une fois la glande atteinte, placez chaque bras de la pince de chaque côté de la glande. Retirez la glande du tissu restant en fermant la pince (Figure 4A).
    7. Dirigez le presse-étoupe attaché à la pince loin de l’objet et vers le tube de prélèvement. Mettez les extrémités des pinces en contact avec la solution dans le tube (figure 4B). La libération de la glande par l’ouverture de la pince doit être bien observée, car les glandes ont tendance à coller sur la pointe de l’outil. Le tissu peut être stocké à -80 °C jusqu’à l’extraction par PCR ou ARN.

3. Amplification PCR directe à partir de tissus Nepenthes

  1. Pour prouver l’efficacité de la méthode de préparation, une approche PCR directement à partir du tissu glandulaire sans étape d’extraction d’ADN peut être réalisée.
  2. Pour l'amplification par PCR, utilisez des amorces spécifiques du gène, ici codant pour la séquence d'une protéine de type thaumatine (TLP) (en avant : 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', en arrière : 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
    1. Prélever 1 à 5 glandes dans un tube PCR contenant 10 μl d’eau sans nucléases. Pour une réaction de 50 μl, ajoutez 5 μl de tampon 10x Taq, 1 μl de désoxynucléosides triphosphates (dNTP), 3 μl 25 mM de MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) d’ADN polymérase Taq, 1 μl (100 pmol) de chaque amorce et 28,6 μl d’eau sans nucléases.
    2. Effectuez des réactions PCR dans un thermocycleur avec le programme suivant : dénaturation initiale à 94 °C pendant 3 min ; 35 cycles de dénaturation (94 °C pendant 30 sec), de recuit (59 °C pendant 30 sec) et d’extension (72 °C pendant 1 min) ; et une étape finale d’extension de 10 min à 72 °C.
    3. Prouvez l’amplification du produit PCR en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose. Par conséquent, utilisez 1,5 % (p/v) d’agarose et dissolvez-le dans 1 tampon TAE (40 mM de base Tris, 20 mM d’acide acétique glacial, 1 mM d’EDTA, pH 8). Faites chauffer la solution au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit dissoute. À 100 ml de solution d’agarose, ajouter 1 μl de bromure d’éthidium (10 μg/μl) pour une visualisation en aval. Faites fonctionner le gel dans 1 tampon TAE à 300 V, 115 mA pendant environ 20 min dans une chambre d’électrophorèse. La taille correcte de l’amplicon TLP doit être de 690 pb.

4. Extraction d’ARN à partir de petits échantillons de tissus et transcription inverse

  1. Effectuez les étapes suivantes sur de la glace. Pour l’extraction de l’ARN, deux méthodes d’extraction ont été utilisées, un Micro Kit pour l’extraction de l’ARN total et un Kit d’isolement de l’ARNm appliqué avec des billes magnétiques.
  2. Prélever au moins 30 glandes sécrétoires par micropréparation dans un tube PCR contenant 1 μl d’inhibiteur de RNase et 9 μl d’eau sans nucléase. Ensuite, lysez le tissu dans un thermocycleur pendant 10 min à 75 °C.
  3. Extraction de l’ARN total.
    1. Après la préparation, ajoutez 90 μl de solution de lyse à l’échantillon et incubez pendant 10 min à 75 °C. Ensuite, chargez le mélange réactionnel sur la colonne (fournie avec le kit) et procédez aux étapes de lavage décrites dans le manuel du fabricant.
    2. Éluer l’ARN deux fois avec une solution d’élution de 10 μl et poursuivre le traitement par DNase I.
    3. À 20 μl d’ARN extrait, ajoutez 2 μl de tampon 10x DNase I et 1 μl de DNase I (fournis avec le kit d’extraction d’ARN) et incubez 1 h à 37 °C. Arrêtez la réaction en ajoutant 2 μl de réactif d’inactivation DNase et incubez pendant 2 min à température ambiante. Après une étape de centrifugation pendant 1,5 min à vitesse maximale, l’ARN peut être transféré dans un tube frais sans RNase. Déterminez la concentration en ARN de chaque échantillon à l’aide d’un spectrophotomètre. Les échantillons doivent être conservés à -80 °C.
  4. Extraction de l’ARNm à l’aide de billes magnétiques.
    1. Ajustez le volume de l’échantillon à 100 μl avec un tampon de lyse/liaison (fourni dans le kit) et incubez pendant 10 min à 75 °C. Ajoutez 20 μl de billes magnétiques fournies avec un surplomb Oligo (dT)25 et mélangez la réaction pendant 5 min à température ambiante. L’ARNm se lie par la queue poly(A) au surplomb Oligo (dT)25 des billes.
    2. Effectuez les étapes de lavage de l'ARNm lié aux billes magnétiques en suivant le protocole du fabricant. Les solutions peuvent être éliminées à l’aide d’un aimant. Remettre les billes en suspension dans un tampon Tris-HCl de 20 μl 10 mM (pH 7,5).
    3. Éliminez les contaminations de l’ADN génomique en traitant l’échantillon avec 2U (1 μl) de DNase (2 μl de tampon 10x DNase et 17 μl d’eau sans nucléase) pendant 1 heure à 37 °C. Ensuite, la solution enzymatique est éliminée par l’aimant et les billes sont remises en suspension dans 20 μl de tampon Tris-HCl de 10 mM. Il n’est pas possible de mesurer la concentration en ARN puisqu’il est attaché aux billes. Les échantillons doivent être conservés à -80 °C.
  5. Pour la transcription inverse, utilisez un kit de synthèse d’ADNc. Les réactions ont été effectuées en suivant le protocole du fabricant.
    1. Pour la transcription inverse de l’ARN total, ajoutez 1 μl (100 pmol) d’amorce Oligo (dT)20 ou 1 μl (0,4 μg) d’hexamères aléatoires, 1 μl d’inhibiteur de RNase et 1 μl 10 mM de dNTP Mix à 1 μg d’ARN et ajustez le volume à 14 μl avec de l’eau sans nucléases. Incuber à 65 °C pendant 5 min, puis placer les échantillons sur de la glace. Ajoutez 1 μl de DTT 0,1 M, 1 μl de transcriptase inverse et 4 μl de tampon 5x RT. Les réactions sont incubées pendant 55 min à 50 °C, suivies d’une étape d’inactivation à 70 °C pendant 10 min. Après la transcription inverse, les échantillons peuvent être stockés à -20 °C.
    2. Pour les ARNm liés à des billes magnétiques, remplacez le tampon Tris-HCl par le premier mélange réactionnel (1 μl d’inhibiteur de RNase, 1 μl de 10 mM de dNTP Mix et 12 μl d’eau sans nucléases) et incubez pendant 5 min à 65 °C. En raison du surplomb Oligo (dT)25 des billes, il n’est pas nécessaire d’ajouter une amorce Oligo (dT)20 ou des hexamères aléatoires aux échantillons. Ensuite, suivez le protocole ci-dessus (étape 4.5.1).
    3. Mesurez la concentration d’ADNc à l’aide d’un spectrophotomètre. Conservez les échantillons à -20 °C.

5. PCR en temps réel

  1. Pour les analyses avec PCR en temps réel, utilisez l’ARN total extrait avec le Micro Kit et un SYBR Green QPCR Master Mix. Pour garantir un nombre égal de transcrits, ajustez la concentration d’ADNc de chaque échantillon à la même valeur après la transcription inverse.
  2. En plus des échantillons, insérez des réactions de contrôle. Utilisez un contrôle sans modèle pour détecter la contamination des réactifs et pour vérifier la qualité de vos amorces. Pour vérifier l’absence d’ADN génomique, exécutez un contrôle non RT. Les deux réactions doivent être négatives (pas de signal de fluorescence) dans la PCR en temps réel.
  3. Pour garantir un niveau de transcrit égal entre les différents échantillons, utilisez au moins un gène de référence. Ici, des paires d'amorces conçues codant pour une actine (avant : 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', inverse : 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') et un 18SrRNA (avant : 5'-CTTGATTCTATGGGTGGTGGTG-3', inverse : GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3') ont été utilisées. Comme gène cible, le TLP (avant : 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', inverse : 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3') a été choisi. La taille de chaque fragment amplifié était d’environ 100 pb.
  4. Pour une réaction de 25 μl, ajoutez 12,5 μl de 2x SYBR Green QPCR Master Mix, de l’ADNc (≥20 ng), 400 nM de chaque amorce et 30 nM du colorant de référence passif ROX (fourni avec le kit). Ajustez le volume de l’échantillon à 25 μl avec de l’eau sans nucléase.
  5. Les réactions ont été réalisées dans un thermocycleur QPCR avec le programme suivant : dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min pour activer la polymérase ; 40 cycles de dénaturation (95 °C pendant 30 sec), de recuit (61 °C pendant 60 sec) et d’extension (72 °C pendant 1 min) ; suivi de la courbe de dissociation (95 °C pendant 60 sec, 55 °C pendant 30 sec, 95 °C pendant 30 sec). La courbe de dissociation est nécessaire pour déterminer l’absence de dimères d’amorce, qui peuvent être détectés par un pic supplémentaire.
  6. Déterminez l’efficacité (E) de chaque réaction de PCR en utilisant la méthode de Liu et Saint8. L’efficacité peut être déviée de la partie linéaire de la courbe d’amplification. Ici, le nombre d’amplicon relatif (Rn, A) d’un point de cycle (CPA) est lié à la quantité d’amplicons (Rn, B) d’un autre cycle (CPB).
  7. Analysez les résultats de la PCR en temps réel à l’aide de l’outil logiciel d’expression relative (REST 2009, http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html) ou d’un logiciel similaire. Utilisez le programme pour calculer le rapport d’expression d’un gène dans un échantillon traité par rapport à un contrôle.

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Résultats

Pour la préparation de glandes individuelles à partir de tissus de cuves de Nepenthes, une technique de microdissection mécanisée a été mise au point et appliquée. La plateforme de micropéparation doit être équipée de microforceps fixés au micromanipulateur, qui sont à leur tour commandés par un panneau de contrôle. Les glandes individuelles, visibles au microscope, peuvent être ciblées à l’aide des forceps qui saisissent le tissu glandulaire et l’extraient mécaniquement (Figure 4A).

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Discussion

Pendant longtemps, l’étude des structures sécrétoires des plantes, en particulier des trichomes, a été réalisée essentiellement sur l’anatomie et était purement descriptive. Il existe un grand nombre de publications de ce type, comme le résument les critiques du11 septembre. Nos connaissances biochimiques et moléculaires sur les structures sécrétoires des plantes sont encore limitées, malgré quelques travaux précoces remarquables , par exemple sur les trichomes glandulaires à la menthe, montrant que l...

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Déclarations de divulgation

Nous n’avons rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions l’équipe de la serre du MPI-CE au Jardin botanique de l’Université Friedrich Schiller d’Iéna, pour la culture des plantes et Wilhelm Boland et la Société Max Planck pour leur soutien.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RNAqueous-Micro KitLife Technologies GmbH, AllemagneAM1931Isolement de l’ARN total, 50 échantillons
Dynabeads mRNA DIRECT Micro KitLife Technologies GmbH, Allemagne610115 ml Dynabeads Oligo (dT)25
DynaMagn-2Aimant Life Technologies GmbH, Allemagne12321D
SuperScript CellsDirect cDNA Synthesis SystemLife Technologies GmbH, Allemagne18080-20025 réactions
RNaseOUTLife Technologies GmbH, Allemagne10777-019Inhibiteur de la RNASE, 5 000 unités
Hexamères aléatoires (0,4 &mu ; g/&mu ; l)QIAGEN GmbH, Allemagne79236100 &mu ; l
10 mM dNTP Mix, qualité biologie moléculaireFermentas GmbH, AllemagneR01921 ml
Taq ADN polymérase, (recombinante)Fermentas GmbH, AllemagneEP0402Livré avec 10x tampon Taq (avec KCl ou (NH4)2SO4) et 25 mM MgCl2
TURBO DNaseLife Technologies GmbH, AllemagneAM22381 000 unités
AgaroseCarl Roth GmbH Co. AllemagneT846.3
GeneRuler Échelle d’ADN bas de gamme, prête à l’emploiFermentas GmbH, AllemagneSM119350 &mu ; g
Brilliant II SYBR Green QPCR Master MixAgilent Technologies, Inc., États-Unis600828Kit unique
RNaseZAPSigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneR2020
Lame de rasoirCarl Roth GmbH Co., AllemagneCK08.1
Pince à épilerCarl Roth GmbH Co., Allemagne2801.1 / 2855.1
Spectrophotomètre GE NanoVueGE Healthcare Europe GmbH, Allemagne28-9569-62
Mastercycler gradientEppendorf AG, Hambourg, Allemagne5331 000.010
Mx3000P Système de PCR en temps réelStratagene, États-Unis401403
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis ChamberBiometraDiscontinued
Micromanipulateuraura optik gmbhaurekaÉquipé d’une micropince
StéréomicroscopeCarl Zeiss Microscopie, Iéna, AllemagneSteREO Lumar.V12Équipé d’un jeu de filtres AxioCam
Lumar 01Carl Zeiss, Microscopie, Iéna, Allemagne485001-0000-000Filtre UV
Lumar Jeu de filtres 09Carl Zeiss, Microscopie, Iéna, Allemagne485009-0000-000Filtre non UV

Références

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Mots-clés

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