Collecte et identification d’helminthes de la faune

Résumé

Les animaux sauvages sont couramment parasités par un large éventail d’helminthes. Les quatre principaux types d’helminthes sont les « vers ronds » (nématodes), les « vers à tête épineuse » (acanthocéphales), les « douves » (trématodes) et les « ténias » (cestodes). Nous décrivons ici comment les helminthes sont collectés sur un animal vertébré et comment ils sont conservés et identifiés taxonomiquement.

Résumé

Les animaux sauvages sont généralement parasités par un large éventail d’helminthes. Les quatre principaux types d’helminthes sont les « vers ronds » (nématodes), les « vers à tête épineuse » (acanthocéphales), les « douves » (trématodes) et les « ténias » (cestodes). La méthode optimale pour collecter des helminthes est d’examiner un hôte mort depuis moins de 4 à 6 heures, car la plupart des helminthes seront encore vivants. Une nécropsie approfondie doit être effectuée et tous les organes principaux examinés. Les organes sont lavés sur un tamis de 106 μm sous l’eau courante et le contenu est examiné au stéréomicroscope. Tous les helminthes sont comptés et un nombre représentatif est fixé (soit dans de l’éthanol à 70 %, soit du formol tamponné à 10 %, soit dans de l’alcool-formol-acide acétique). Pour l'identification des espèces, les helminthes sont soit éliminés dans du lactophénol (nématodes et petits acanthocéphales), soit colorés (trématodes, cestodes et grands acanthocéphales) à l'aide de l'hématoxyline de Harris ou du carmin de Semichon. Les helminthes sont associés à l’espèce en examinant différentes structures (par exemple, les spicules mâles chez les nématodes ou le rostellum chez les cestodes). Les protocoles décrits ici peuvent être appliqués à n’importe quel animal vertébré. Ils nécessitent une certaine expertise pour reconnaître les différents organes et être capables de différencier les helminthes des autres débris tissulaires ou du contenu intestinal. La collecte, la conservation et la coloration sont des techniques simples qui nécessitent un minimum d’équipement et de réactifs. L’identification taxonomique, en particulier des espèces, peut prendre beaucoup de temps et nécessiter la soumission des spécimens à un expert ou une analyse d’ADN.

Introduction

Les vertébrés sont parasités par quatre grands groupes d’helminthes (vers). Deux de ces groupes, les trématodes et les cestodes appartiennent à l’embranchement des Plathelminthes. Les deux autres groupes sont les nématodes, ou vers ronds, (Nematoda) et les acanthocéphales, ou vers à tête épineuse (Acanthocephala). Beaucoup de ces parasites ont été documentés comme causes de morbidité et de mortalité chez les oiseaux et les mammifères sauvages^1,2.

La plupart des helminthes ont des cycles de vie complexes impliquant plus d’un hôte^1,2 . Par exemple, les trématodes ont un ou deux hôtes intermédiaires (généralement des invertébrés) et un hôte final. Tous les hôtes doivent être disponibles pour que le cycle se termine et donc pour que les helminthes adultes soient présents dans les hôtes finaux (qui sont le sujet de ce manuscrit). Il est donc important de garder à l’esprit que des fluctuations saisonnières peuvent se produire dans la prévalence et l’intensité de certaines espèces d’helminthes et qu’une surveillance à long terme est souhaitable pour capturer l’helminthe complet de l’auna d’un hôte particulier.

La méthode optimale pour collecter des helminthes est d’examiner un hôte qui a été euthanasié. Cela permet de collecter les helminthes pendant qu’ils sont encore vivants et de leur détendre et de se fixer correctement. Le matériel provenant d’hôtes morts depuis plus de 24 heures, ou qui ont été congelés et décongelés pour examen, est souvent de qualité inférieure et difficile à identifier. Les trématodes et les cestodes d’hôtes congelés ou formalisés sont souvent mal contractés et ont perdu des structures cruciales pour l’identification, comme les épines buccales des trématodes ou les crochets sur le scolex des ténias. Cependant, la réalité est que la plupart du matériel disponible à partir d’hôtes vertébrés de nos jours est congelé ou conservé.

Les bases de données contenant des informations sur les séquences d’ADN des helminthes se développent rapidement et l’identification taxonomique est donc déjà possible pour de nombreuses espèces. Par conséquent, les helminthes doivent être conservés autant que possible pour d’éventuelles analyses d’ADN. Cependant, un ADN de bonne qualité n’est pas possible si les spécimens sont fixés dans du formol. Les méthodes décrites ici pour collecter et tuer les helminthes produiront du matériel adapté à l’extraction d’ADN et aux analyses génétiques.

Ci-dessous, nous décrivons des méthodes détaillées sur la façon de nécropsier les vertébrés (amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères ; les trématodes monogènes de poissons ne sont pas inclus) pour la collecte d’helminthes, suivies de procédures sur la façon de les conserver et de les traiter pour l’identification taxonomique.

Protocole

Les animaux utilisés dans les expériences suivantes ont été retrouvés morts sur la route.

1. Nécropsie animale et dépistage des principaux organes pour la collecte d’helminthes

1. Placez l’animal sur une surface plane et examinez toutes les ouvertures externes, y compris les oreilles, la cavité buccale et les yeux à l’aide d’une loupe, pour détecter la présence de nématodes (ronds) et de trématodes (plats et non segmentés) (voir la figure 1).
2. Si vous travaillez avec des oiseaux, lavez-les à l’eau du robinet pour humidifier les plumes avant de disséquer.
3. À l’aide d’une lame ou d’un couteau tranchant et à l’aide d’une paire de pinces à dissection, faites une incision sur la cavité abdominale en faisant attention de ne pas rompre les organes. Pour les tortues avec une carapace dure, utilisez une scie à main pour couper l’os au niveau du pont entre les pectorales et les abdominales.
4. Ouvrez la cavité thoracique comme ci-dessus ; pour les gros animaux, des coupe-os ou une petite scie à main peuvent être nécessaires pour couper les côtes.
5. Si vous travaillez avec des oiseaux, examinez les sacs aériens in situ avant de prélever des organes. Utilisez une loupe si nécessaire.
6. Examinez les deux cavités à la recherche d’ascaris filaires et de gros trématodes.
7. Avant de retirer le tractus gastro-intestinal de la cavité abdominale, attachez un fil près du début de l’œsophage et un autre à l’extrémité du gros intestin (rectum).
8. Séparez les organes thoraciques suivants dans des boîtes de Pétri (ou des plateaux en verre si les organes sont trop grands) pour un examen au stéréomicroscope (10-30X) : cœur et principaux vaisseaux sanguins, trachée et poumons.
9. Enlever le foie, la vésicule biliaire et le canal biliaire, le pancréas, la rate, les reins et la vessie et les examiner comme décrit à l’étape 1.8.
10. Retirez tout le système digestif et placez chaque section dans des plats/plateaux en verre.
11. Une fois les organes retirés, laver la cavité corporelle à l’aide d’un tuyau d’arrosage ou d’un flacon pulvérisateur rempli de solution saline à 0,9 % dans un tamis à mailles de 106 μm et examiner le contenu du tamis au stéréomicroscope pour détecter la présence de vers filaires ou de trématodes sanguins.
12. Ouvrez chaque section du tube digestif avec des ciseaux, grattez la muqueuse et examinez soigneusement la présence de gros parasites (>1 cm). Utilisez une loupe si nécessaire. Les trompes des acanthocéphales sont souvent profondément enracinées dans la paroi de l’intestin et peuvent devoir être soigneusement retirées du tissu à l’aide de pinces et/ou de petits ciseaux.
13. Placez chaque section ouverte sous l’eau courante et lavez tout le contenu dans un tamis de 106 μm comme décrit à l’étape 1.11.
14. Ouvrez le cœur et les principaux vaisseaux sanguins (pulmonaire et aorte), la trachée, l’urinaire et la vésicule biliaire et examinez le contenu de la même manière.
15. Coupez et séparez les organes solides tels que les poumons, le foie, les reins, la rate et le pancréas à l’aide d’une lame tranchante et d’une pince. Lavez-les à l’eau courante dans un tamis de 106 μm comme décrit à l’étape 1.11.
16. Notez les types de parasites trouvés, le nombre de chaque type et le(s) organe(s) dans lequel ils se trouvent. Les méthodes de fixation et de coloration sont énumérées ci-dessous.
17. Étiquetez les flacons/bocaux en plaçant un petit morceau d’une fiche simple écrite au crayon (l’encre et les fiches lignées « coulent » dans l’alcool et tachent les échantillons).

2. Préservation des helminthes

1. Pour les helminthes qui doivent être conservés pour des études génétiques ultérieures, placez-les directement dans de l’éthanol à 80-90 % (sans glycérine). L’éthanol doit être fabriqué en diluant 95 % d’éthanol, de préférence de qualité réactif (tableau 1). Ne laissez jamais ces spécimens être exposés au formol, car le formol dégrade l’ADN jusqu’à un état inutilisable.
2. Placez des trématodes vivants sur une lame de microscope en verre dans une goutte de solution saline, placez une lamelle en verre et passez la lame sur une flamme sans faire bouillir la solution saline.
   1. Déposez la lame dans une boîte de Pétri contenant de l’AFA (alcool-formol-acide acétique, voir tableau 1) et laissez flotter la lamelle.
   2. Fixer dans l’AFA pendant un à plusieurs jours, rincer à l’eau du robinet et transférer dans des flacons en verre de 5 ml (ou dans un flacon/bocal en verre plus grand selon la taille et la quantité de parasites) remplis d’éthanol à 70 % pour un stockage à long terme.
3. Fixez les trématodes morts dans de l’AFA ou du formol tamponné à 10 % pendant 48 heures, puis transférez-les dans un flacon/bocal rempli d’éthanol à 70 % pour un stockage à long terme.
4. Détendez les cestodes vivants dans une boîte de Pétri en versant de l’eau presque bouillante dessus, puis transférez-les dans un flacon/bocal rempli d’éthanol à 70 % pour un stockage à long terme.
5. Détendez les acanthocéphales vivants en les plaçant dans une boîte de Pétri pendant une à plusieurs heures dans l’eau du robinet d’un réfrigérateur (~4 °C) jusqu’à ce que la trompe soit complètement éversée (cela peut prendre jusqu’à 24 heures). Transfert dans un flacon/bocal rempli d’éthanol à 70 % ou d’AFA pour un stockage à long terme.
6. Traitez les cestodes et les acanthocéphales morts de la même manière que les trématodes morts (voir ci-dessus).
7. Tuer les nématodes vivants de petite taille (<5 mm) ou fragiles (p. ex. trichostrongylides, capillaires) dans de l’éthanol chaud (presque bouillant) à 70 % et conserver dans un flacon/bocal rempli d’éthanol à 70 % avec 5 % de glycérine (tableau 1) ajouté pour préserver les vers en cas d’évaporation.
8. Tuez (et éliminez) les nématodes de taille moyenne à grande (>5 mm) (p. ex. ascarides, spiruridés, oxyures, filaires) en les plaçant dans une boîte de Pétri avec de l’acide acétique glacial froid (tableau 1) et après 15 minutes, transférez-les dans un flacon/bocal rempli d’éthanol à 70 % et de glycérine à 5 %. L’acide acétique peut être utilisé à plusieurs reprises de cette manière.
9. Placez les nématodes morts directement dans un flacon/bocal rempli de 70 % d’éthanol et de 5 % de glycérine.

3. Identification taxonomique des helminthes

1. Préparez l'hématoxyline de Harris en dissolvant l'hématoxyline dans de l'alcool et en dissolvant le sulfate d'ammonium et d'aluminium dans de l'eau avec de la chaleur. Mélangez les deux solutions et portez à ébullition.
   1. Ajouter l’iodate de sodium et faire bouillir pendant 2-3 min. Filtrer la solution (papier filtre 541) une fois qu’elle est revenue à température ambiante.
2. Colorer excessivement les trématodes, les cestodes et les acanthocéphales en les laissant dilués dans de l'hématoxyline de Harris (1:10) ou du carmin de Semichon pendant la nuit (voir tableau 1).
   1. Décolorez à l’aide d’éthanol acide à 70 % jusqu’à ce que les organes soient visibles (cela peut prendre entre quelques secondes et plus d’une heure et doit être observé de près).
   2. Arrêtez la décoloration en transférant les échantillons dans de l’éthanol basique à 70 % pendant au moins 30 min. Ensuite, déshydratez-les en une série d’éthanols gradués (80 %, 95 %, 100 %) et éliminez-les dans du xylène ou du salicylate de méthyle.
   3. Montez les spécimens sur une lame de microscope après avoir ajouté une goutte de baume du Canada et une lamelle couvre-feuille. Laisser sécher toute la nuit.
3. Éliminer les nématodes et les acanthocéphales petits à moyens pendant 15 à 30 minutes dans des montages temporaires de lactophénol sur une lame de microscope avec une lamelle.
   1. Utilisez 80 % de phénol jusqu’à 60 min pour les grands nématodes (ascarides et spiruridés) et les acanthocéphales. Examiner au microscope optique (40-400X) l’évaluation de structures plus petites (spicules mâles et crochets).
4. Utilisez les approches suivantes pour l’examen de structures spéciales.
   1. Pour les cestodes, coupez le scolex et placez-le sur une lame de microscope dans du lactophénol et de la « courge » avec une lamelle pour mesurer et compter les crochets rostellaires (voir Figure 1B).
   2. Pour les nématodes, coupez l’extrémité antérieure et montez en face sur une lame de microscope dans quelques gouttes de lactophénol (sans lamelle) ou dans de la gelée de glycérine pour un montage permanent (avec lamelle) et observez les pièces buccales au microscope optique (35-400X) (voir figure 1D).
   3. Coupez la queue des grands nématodes et montez-la au lactophénol sur une lame de microscope à l’aide d’une lamelle pour observer la morphologie des papilles ventrales et des spicules des mâles au microscope optique (voir la figure 1D).
5. Identifier les parasites des espèces à l’aide d’une combinaison de littérature primaire et de références taxonomiques standard telles que :
   1. Trématodes : Yamaguti (1958, 1971)^3,4 et Gibson et al. ^{5 à 7}
   2. Acanthocéphales : Yamaguti⁸
   3. Cestodes : Yamaguti⁹, Schmidt¹⁰, et Khalil et al. ¹¹
   4. Nématodes : Yamaguti¹² et Anderson et al. ¹³

4. Dépôt d’helminthes dans la collection nationale de parasites des États-Unis

1. Déposer des spécimens représentatifs d’helminthes à la U.S. National Parasite Collection (USNPC). Ceci est obligatoire pour la plupart des revues parasites. Après la soumission, chaque espèce d’helminthe se voit attribuer un numéro d’accession pour l’inclusion dans les manuscrits.
2. Incluez les informations suivantes lors de la soumission des échantillons : 1) Nom scientifique du parasite ; 2) les informations sur l’hôte (espèce, coordonnées de longitude/latitude de l’emplacement géographique) ; 3) organe trouvé chez l’hôte ; 4) le nom de la personne qui a prélevé les spécimens et la date de la collecte ; 5) le type de fixateur, de teinture ou de matériau de clarification/montage utilisé ; 6) l’emplacement d’autres collections (numéros de musée et d’acquisition) si des spécimens supplémentaires sont soumis ailleurs ; et 7) des informations sur la publication et la revue. Ces données doivent également être envoyées avec les échantillons et sous pli séparé.
3. Emballez les échantillons dans des récipients solides avec un matériau absorbant résistant aux chocs. Collez des bouchons à vis sur les flacons en verre et placez chaque flacon dans un sac en plastique séparé. Enveloppez les diapositives dans du papier et placez-les dans une boîte à diapositives avec un matériau absorbant les chocs entre elles.
4. Expédiez les spécimens et une lettre séparée contenant des informations sur les spécimens à : U.S. National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350.

Résultats

À l’aide des méthodes décrites ci-dessus, une étude des helminthes du musaraignon masqué, Sorex cinereus, a été menée dans le comté de Missoula, dans le Montana, entre 2007 et 2011. Un total de 56 musaraignes ont été capturées à l’aide de pièges en fosse et examinées dans les 2 heures suivant la mort. La prévalence globale d’infection s’élevait à 96 % ; seules 2 musaraignes étaient dépourvues de parasites. Quinze espèces d’helminthes ont été identifiées, comprenant 9 espèces de cestodes et 6 espèces de nématodes...

Discussion

Il est extrêmement difficile d’identifier les parasites helminthiques, même de genre, sur la base d’un matériel pauvre. Les cestodes et les trématodes, en particulier, ont tendance à mourir et à se détériorer assez rapidement après la mort de l’hôte. La taxonomie des cestodes dépend grandement du nombre, de la taille et de la forme des crochets rostellaires, qui sont souvent perdus dans les matériaux congelés. Il en va de même pour certains trématodes avec des épines autour de la ventouse buccale, tels que les échinostom...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fixant
Alcool-Formoline-Acide acétique (AFA)	Fisher Scientific	A407-1 (éthanol) F75F-1GAL (formaldéhyde) BP2401500 (acide acétique glacial)	Éthanol 85 % (85 ml) + formaldéhyde 37 % (10 ml) + acide acétique glacial (5 ml)
Éthanol pour la destruction et la conservation à long terme	Fisher Scientific	A407-1	Éthanol 100 % (70 ml) + eau distillée (30 ml)
Éthanol pour la fixation et l’étude de l’ADN	Fisher Scientific	AC61511-0010	Éthanol 80-90 % (80-90 ml) + eau distillée (20-10 ml), respectivement
Formalin Buffered	Fisher Scientific	SF100-4	Formalin 10 % (10 ml) + eau distillée (90 ml)
Alcool glycériné	Fisher Scientific	A407-1 (éthanol) AC15365-1000 (glycérine)	Éthanol 70 % (95 ml) + glycérine (5 ml)
Éclaircissant, colorant et montage
Éthanol pour déshydrater pendant la coloration	Fisher Scientific	A407-1	Éthanol 80 %, 95 %, 100 % (80 ml, 95 ml, 100 ml) + eau distillée (20 ml, 5 ml, 0 ml)
Lactophénol	Fisher Scientific	R400-27-Phénol
	Fisher Scientific	A931I-1 (phénol) A407-1 (éthanol)	Phénol 100 % (80 ml) + éthanol 100 % (20 ml)
Harris' Hématoxyline	Fisher Scientific	S25347 (hématoxyline) A407-1 (éthanol) A567-500 (sulfate d’ammonium et d’aluminium) S25553 (iodate de sodium)	Hématoxyline (5 g) + éthanol 100 % (50 ml) + sulfate d’ammonium et d’aluminium (100 g) + iodate de sodium (0,37 g) + eau distillée (1 000 ml)  ;   ;
Semichon' s carmin acétique	Fisher Scientific	BP2401500 (acide acétique glacial) S25236 (carmin) A407-1 (éthanol)	Acide acétique glacial (100 ml) + carmin (1,5 g) + eau distillée (100 ml). Faites chauffer au bain-marie bouillant pendant 15 min et laissez refroidir. Filtrer pour faire une solution mère. Mélanger 1:2 avec 70 % d’alcool pour la coloration.
Xylene	Fisher Scientific	X4-4	À utiliser uniquement sous une hotte chimique.
Salicylate de méthyle	Fisher Scientific	S25437-Éthanol
basique	Fisher Scientific	A407-1 (éthanol) S25159A (hydroxyde d’ammonium concentré)	Éthanol 70 % (100 ml) + hydroxyde d’ammonium (0,1 ml)
Éthanol acide	Fisher Scientific	A407-1 (éthanol) SA9233-100 (acide chlorhydrique)	Éthanol 70 % (99,5 ml) +  ; acide chlorhydrique (0,5 ml)
Baume du Canada	Fisher Scientific	B10-100	-