Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

Résumé

Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam ₃ CSK ₄ (Pam).

Résumé

Isolation de la microglie du tissu du SNC est un puissant outil d'enquête utilisé pour étudier la biologie de la microglie ex vivo. La présente méthode décrit en détail une procédure d'isolement de la microglie à partir de cortex de souris néonatales par agitation mécanique avec un agitateur rotatif. Cet isolement de la microglie méthode donne de la microglie corticales très pures qui présentent des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles indicatifs de la microglie de repos dans des conditions normales non pathologiques in vivo. Cette procédure préserve aussi l'immunophénotype de la microglie et la fonctionnalité biochimique tel que démontré par l'induction de changements morphologiques, la translocation nucléaire de la sous-unité p65 de NF-kB (p65), et la sécrétion de la cytokine marque de pro-inflammatoire, facteur de nécrose tumorale α (TNF-α ), sur le lipopolysaccharide (LPS) et Pam ₃ CSK ₄ (Pam) défis. Par conséquent, la procédure d'isolement présente préserve l'immunophénotype de repos et deux actimicroglie vée, en fournissant une méthode expérimentale d'enquêter sur la microglie biologie dans des conditions ex vivo.

Introduction

Cellules de la microglie, les macrophages de surveillance du parenchyme du système nerveux central, représentent environ 12% de la population cellulaire totale du cerveau des mammifères adultes. Les microglies sont issus de la vésicule ombilicale myéloïdes cellules précurseurs et de modification de la densité cellulaire et de morphologie dans différentes régions cytoarchitecturales dans le SNC adulte ^1-5. Dans un cerveau adulte en bonne santé, les microglies sont petites, ramifiées ou polaires cellules avec, des processus dynamiques fines. Contrairement aux périphériques macrophages morphologie, la microglie démontrent un repos, à profil bas phénotype dans les cerveaux sains qui peuvent apparaître comme l'inactivité cellulaire, mais des études in vivo d'imagerie montrent que les processus microgliales s'étendent dynamiquement et se rétractent pour surveiller leur microenvironnement dans une manière qui rappelle " l'échantillonnage et l'arpentage ^"6,7.

Les microglies sont fortement et de manière différentielle en réponse à des modifications environnementales et physiopathologiques dans le cerveau, de commutationd'un surveillant à un pays considéré comme leur repos et activées couramment étatiques effectrices, respectivement. Ce commutateur dans l'activation peut être médiée par l'engagement des récepteurs membranaires reconnaissance de formes (PRR), tels que les récepteurs Toll-like (TLR), qui répondent aux motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP), les lipoprotéines à savoir bactériennes et virales dérivés , des acides nucléiques, des hydrates de carbone et ^8-11. En plus de PAMP, PRR ont également été montré pour induire l'activation des microglies contre, des molécules stériles non pathogènes connus comme des modèles moléculaires danger / dommages-associé (atténue), qui représentent une perturbation dans l'homéostasie du système nerveux central, tels que les dommages cellulaires ^12-16. Une fois engagé, PRR initier une intracellulaire cascade qui se traduit par des changements dans la morphologie des cellules et l'expression des gènes de la microglie de signalisation, plus précisément, les microglies activées adapter un phénotype de amoeboid-like, la translocation de la p65 de NF-kB sous-unité (p65) dans le noyau de la cellule, et réguler à la hausse l' production et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, tels que facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l'interleukine-1 β (IL-1β), et aussi d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) ^{de 16 à 24.} Bien intégré dans la réponse immunitaire innée du système nerveux central, ces molécules sécrétées ont également été trouvés à augmenter le stress oxydatif neuronale, induisant de ce fait et en exacerbant la neurodégénérescence dans les états malades telles que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer ^25-29.

Cependant, les mécanismes d'activation de la microglie dans les états pathologiques ne sont pas complètement compris. Par conséquent, l'isolement de la microglie est un puissant outil d'enquête dans ces processus biologiques, comme beaucoup de caractéristiques in vivo de l'activation de la microglie peut être récapitulé dans la culture. Plusieurs méthodes sont disponibles pour isoler les microglies, y compris l'isolement par un gradient de Percoll après digestion enzymatique de tissu du SNC ^30,31. Cependant, une digestion enzymatique peut modifierl'immunophénotype des cellules en réduisant la surface cellulaire antigène expression ^32, et les résultats dans le rendement de la cellule par animal inférieur que le procédé décrit ici. Plus précisément, nous présentons un rendement de microglies moyenne par chiot cortex de 7,5 x 10 ⁵ cellules, alors que précédemment rapporté méthodes de l'ensemble du système nerveux central d'isolement par un rendement de gradient de Percoll 3-5 x 10 ⁵ cellules ^30,33,34. La présente procédure contourne l'utilisation d'enzymes de digestion en isolant la microglie en fonction de leurs propriétés de faible adhérence, préservant ainsi l'immunophénotype des microglies et la fonctionnalité.

Dans la présente étude, nous décrivons l'isolement des cellules microgliales de cultures gliales mixtes issus de hétérozygotes CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP ^{+ / -),} néonatale et C57BL / 6 cortex de souris par agitation mécanique sur un agitateur rotatif, une extension de déjà Procédé publiée ^24,35. Nous utilisons la souche de souris ancien pour une visualisation facile des microglies, commeCes souris expriment la GFP sous le contrôle du locus endogène CX3CR1 - un promoteur spécifique des monocytes ^{de 36 à 38.} Cette méthode produit des cultures microgliales très pur avec un immunophénotype conservés ex vivo comme démontré par des changements morphologiques, la translocation nucléaire de p65, ainsi que la sécrétion de TNF-α en cas de contestation par le lipopolysaccharide bactérien (LPS) ou Pam ₃ CSK _4, TLR4 et TLR1 / 2 agonistes , respectivement.

Protocole

Avant de commencer ce protocole, recueillir des souriceaux nouveau-nés à jour postnatal 1-3 (P1-3) dans un récipient stérile imbriquée avec literie de cage d'origine pour la protection et la chaleur. Il est important de travailler rapidement et efficacement à travers ce protocole pour optimiser le rendement de la microglie. S'il vous plaît voir le tableau 1 pour la liste complète des réactifs.

Une. Préparation d'instruments, Culture Media, et plats

1. Préparer 10 ml / pup microglie complet Support (MCM; 1x Minimal Essential Medium Earle [MEM] supplémenté avec 1 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 0,6% v / v de D-(+)-glucose, 100 pg / ml pénicilline / streptomycine (P / S), 4% v / v de sérum bovin fœtal (FBS), 6% v / v de sérum de cheval), et ajouter à chaque flacon T-75 (1 flacon / chiot); bouchon et le lieu horizontalement dans un incubateur (37 ° C, 5% CO ₂₎ à s'équilibrer pendant 1 heure. Il est indispensable à l'équilibre de ce support dans la fiole (s) avant de commencer la dissection.
2. Prepare, aliquote, et chaude en 37 ° C MCM bain d'eau pour la dissection (6 ml / chiot) et dans un tube conique de MCM distinct pour la remise en suspension de cellules (2 ml / chiot). Préparer, aliquote, et le froid sur la glace Mincing Media (MM; HBSS complété par: 100 pg / ml P / S, 0,01 M HEPES; 3 ml / chiot), et de dissection Media (DM; MEM supplémenté avec 100 pg / ml P / S; 2 ml / chiot).
3. Stériliser les instruments chirurgicaux suivants par immersion dans de l'éthanol à 70% pendant 10 min: ciseaux # 1 (1; décapiter), pince # 1 (2; d'assurer le nez et supprimer cortex), ciseaux # 2 (1; non en biais; d'ouvrir cuir chevelu ), pince # 2 (1; d'enlever le cuir chevelu), pince # 3 (1; d'enlever crâne), pince # 4 (2; d'enlever méninges), ciseaux # 3 (1; pour hacher le tissu cérébral). Laisser sécher à l'air sur une compresse stérile.
4. Essuyez l'horizontale aéré poste de travail et la dissection microscope avec 70% d'éthanol.
5. Distribuer DM en 2, 100 mm boîtes de Pétri stériles pour capturer la tête (3 ml; 1 plat / 3 chiots) et la dissection (1 ml;1 plat / chiot; refroidi sur la glace avant la dissection). Distribuer MM dans une stérile, 100 mm boîte de Petri pour hacher le tissu cérébral (1 ml; 1 plat / chiot).

2. Dissection de tissu cérébral

1. Avant l'euthanasie, désinfecter doucement le cou et la tête du chiot avec 70% d'éthanol en utilisant un tissu de laboratoire. Avec des ciseaux # 1, euthanasier rapidement chiot en enlevant la tête; tête de capture en boîte de Pétri préalablement préparé. Euthanasier et compléter la dissection d'un chiot avant de procéder à l'animal suivant.
2. Transférer la tête dans le plat de dissection froide; sous microscope de dissection fixer la tête en pinçant le nez à l'aide pince # 1 (sinon, la tête peut être fixée en perçant la pince à travers la cavité de l'œil); cuir chevelu ouvert à l'aide de ciseaux # 2 par la création d'un Y-cut: commencer à partir de base de la tête et à un angle vers les yeux. Utilisez pince # 3 pour enlever délicatement le cuir chevelu en enlevant latéralement, exposer le crâne.
3. Utilisation pince # 3, retirez délicatement le tissu conjonctif à la base detête. Lorsque la base du crâne est exposé crâne soigneusement ouvert en enfilant un bras de pince entre le cerveau et le crâne (la suite de la fissure interhémisphérique); adhérence; tirez doucement vers le haut du crâne à déchirer.
4. Broyer le tissu conjonctif sous la face ventrale du cerveau à l'aide pince n ° 1, puis retirez cerveau en utilisant le même outil. Soulevez le cerveau de crâne à l'aide d'une force vers le haut sous la partie ventrale du cerveau.
5. Gardez le cerveau dans sa position anatomique: la face dorsale vers le haut pour visualiser les cortex sous le microscope de dissection; garantir le cerveau en place en insérant des conseils de pince à l'intersection du mésencéphale et du cortex; supprimer complètement méninges corticales avec pince n ° 4, puis passez à supprimer les méninges ventrales. Une fois les méninges ont été complètement enlevés, séparer les cortex du reste du cerveau à l'aide pince # 4., Il est essentiel d'éliminer complètement tissu méningé pour maximiser la pureté de la microglie et yield.

3. Brain Tissue Mincing

1. cortex de transfert précédemment préparés hacher plat; continuer à hacher étape utilisant une technique stérile au Cabinet de classe II de sécurité biologique.
2. Tissu Mince de cerveau à l'aide de ciseaux # 3; transfert tissu haché dans un tube de 15 ml conique;. Rincer ciseaux et hacher plat avec 1 ml de MM chacun, recueillir et distribuer des rinçages dans le tube de 15 ml conique contenant le tissu haché Cette étape de rinçage maximiser le rendement de la microglie en s'assurant que tout le tissu résiduel est transféré dans le tube conique. Laissez suspension de tissu non perturbée pendant 1-2 min, permettant tissu haché de régler au fond du tube. Ne pas dépasser 2 min que MM ne contient pas de nutriments essentiels.
3. Retirez délicatement et jeter 2 ml de surnageant avec générique 1000 pi micropipette avec une pointe de pipette standard, veillant à ne pas perturber le haché tissu réglé.
4. Ajouter 3 ml de MCM au-tissu haché; triturer le tissu avec force en utilisant un générique 1000 pi micropipette avec une pointe de pipette la norme n ° discernable tissu solide doit rester quand trituration est terminée.. Ajouter un autre 3 ml de MCM avec la même pointe de la pipette, la collecte de l'échantillon trituré résiduelle de la pointe de la pipette.

4. La culture de cellules corticales

1. Centrifugeuse le tissu haché pour sédimenter les cellules (215 xg, 5 min; RT; centrifugeuse clinique avec balancement seau rotor). Retour culot de cellules de l'enceinte de sécurité biologique, enlever et jeter le surnageant; remettre en suspension doucement le culot cellulaire (2 ml / tube; MCM), ajouter la remise en suspension des cellules de la préalablement préparé flacon T-75; plafonner le ballon et le placer horizontalement dans un humidifiée, norme incubateur de culture de tissu (à 37 ° C, 5% CO _2). Laisser les cellules incuber pendant 24 heures.
2. Après 24 h, tapotez doucement ballon contre paume de la main pour perturberdébris de tissu. Voir les cellules avant et après tapotement pour assurer une élimination complète du débris. Set ballon vertical; enlever et jeter les médias; ajouter MCM frais au fond du flacon (12 ml; 37 ° C); bouchon et remettez-les dans l'incubateur, horizontalement.
3. Vérifiez cellules quotidien de contamination et pour surveiller la croissance.
4. A environ 17-21 jours in vitro (DIV), les cellules microgliales seront prêts pour la récolte de la culture des cellules gliales mixtes. Pour déterminer si les cellules sont prêtes, examiner les cellules sous un microscope à contraste de phase inversée. Microglies sont prêtes pour la récolte quand à ~ 40% de confluence. Ils apparaissent comme de petites cellules, lumineux, sphériques, de plus en plus comme une monocouche sur d'autres cellules gliales.

5. Isolation des microglies de mixte gliales Culture

1. Pour isoler la microglie, frappez vigoureusement ballon contre un banc de laboratoire. Cette agitation permet la microglie séparées des autres cellules gliales en raison des propriétés de faible adhérence de la microglie.
2. Joint T-75 casquettes de ballon avec Parafilm et faire tourner les cultures mixtes gliales (200 rpm; 37 ° C, 5 h). utilisant un agitateur rotatif nonhumidified température contrôlée Ne pas laisser les cellules de secouer pendant plus de 5 heures d'inspecter visuellement. que les microglies ont soulevé la surface du flacon après 5 h, à l'aide d'un microscope à contraste de phase inversée. microglies sont lumineuses, sphérique, flottant cellules. Il y aura une couche résiduelle d'astrocytes et les oligodendrocytes qui adhèrent au fond de la fiole.
3. Recueillir milieu surnageant contenant la microglie dans un tube à centrifuger conique stérile; microglie de granulés (215 xg, 5 min; balancer seau rotor).
4. Remettre en suspension le culot de la microglie dans chaud microglie du milieu de croissance (MGM; MEM supplémenté avec: pyruvate 1 mM de sodium, 0,6% v / vglucose, 1 mM de L-glutamine, 100 pg / ml de P / S, 5% v / v de FBS; ~ 2 ml / flacon), déterminer la concentration des cellules en utilisant un hémocytomètre, et la plaque 1 x 10 ⁵ cellules / puits dans un format de plaque à 24 puits surplastique ou bordereaux stériles de couverture de verre (500 pl / puits; MGM). le rendement de la microglie moyenne utilisant cette procédure est de 7,5 x 10 ⁵ cellules / chiot cortex.
5. 24 heures après placage, supprimer tous les médias et les cellules réalimentation avec frais MGM (37 ° C) pour éliminer les cellules et les débris flottants. Cette étape est essentielle à la survie cellulaire et de maintenir la microglie au repos. Les cellules peuvent être utilisés pour l'expérimentation immédiatement après réalimentation.

6. Exemple Traitements

1. Exposer les cellules à 10 ng / ml de Pam ₃ CSK ₄ (Pam), 10 ng / ml de lipopolysaccharide (LPS) ou le contrôle du véhicule; incuber pendant 2 ou 24 heures dans un incubateur humidifié (37 ° C, 5% de CO _2).

7. Analyser microglies pour la fonctionnalité Ex vivo par immunofluorescence imagerie et Immunocytochemistry

1. Après traitement, on récolte les cellules des milieux de culture dans des tubes de microcentrifugation (1,5 ml) et centrifuge utilisant une micro de table (2 min; 900 xg) pour effacer les médias. Transférer le surnageant dans un tube de centrifugeuse propre; dosage immédiatement, ou conserver à -20 ° C jusqu'au moment de servir. Analyser la concentration de TNF-α dans les cellules du surnageant de culture par ELISA kit disponible dans le commerce de la souris de TNF-α.
2. Laver les cellules avec du tampon phosphate salin (PBS), et fixer les cellules avec 4% (p / v) de paraformaldéhyde / 4% (p / v) de sucrose / PBS pH 7,4 (PFA 4%, 15 min; RT). Après la fixation, laver les cellules avec du PBS pendant 5 min en agitant doucement sur un agitateur orbital.
   1. Immunofluorescence / immunocytochimie. Après fixation et de lavage PBS, processus microglies pour immunocytochimie. Toutes les étapes effectuées en agitant doucement. Perméabiliser les cellules dans PBS contenant 0,1% de triton X-100, des cellules de bloc dans PBS/10% de sérum de chèvre normal pendant une heure. Incuber les cellules O / N à 4 ° C avec des anticorps de lapin anti-NF-kB (sous-unité p65, 1/1, 250) ou de lapin anti-anticorps Iba-1 (1/750) dans du tampon de blocage. Visueliser complexe antigène: anticorps après incubation avec fluorescence chèvre anti-lapin conjugué anticorps IgG secondaire (1 h; 1/1, 000). Éliminer l'anticorps secondaire non lié par lavage avec du PBS contenant 0,1% de triton X-100 (3 x 5 min).
   2. Cellules contre des taches avec 4 ',6-Diamidino-2-phénylindole / PBS (DAPI; 0,1 pg / ml). Afin de visualiser le noyau de la cellule Tous les microglies provenant de CX3CR1-GFP ^{+ / -} souris expriment la GFP. Utiliser un filtre de longueur d'onde de 350 nm pour visualiser le DAPI, un filtre de longueur d'onde 488 nm pour visualiser la GFP, et un filtre de longueur d'onde 594 nm pour visualiser p65 et Iba-1 immuns.
3. Monter le couvercle glisse en utilisant une solution aqueuse de montage et de visualiser la microglie en utilisant la microscopie à fluorescence.

Résultats

Le maintien de l'immunophénotype et la fonctionnalité de la microglie ex vivo lors de l'isolement est essentiel d'être en mesure d'utiliser ces cellules comme un modèle d'enquête pour la biologie de la microglie. Afin de démontrer la préservation de la microglie immunofunctionality succès en utilisant la présente méthode, on a isolé à partir de la microglie corticales nouveau-nés (P3 CX3CR1-GFP ^{+ / -} et des souris C57BL / 6) et des cultures traitées soit avec du LPS ou Pam.

Discussion

La présente procédure offre une méthode efficace pour l'isolement de la microglie corticaux de souris néonatales. Cette procédure a un double avantage de 1) la préservation immunophénotype microglie et la fonctionnalité, telle que déterminée par l'imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA, et 2) permettant la microglie à échéance à la présence d'autres cellules gliales (astrocytes et oligodentrocytes) avant l'isolement, ce qui peut faciliter les interactions cellule-cellule importantes pendant...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Glucose	Sigma	G8270	Préparez une solution mère à 20 % avec de l’eau MilliQ ; filtrez stériliser ; conservez à 4 ° ; C; Durée de conservation : 3-6 mois. Utilisé pour faire MCM et MGM.
Pyruvate de sodium 100 mM (100x)	Hyclone	SH30239.01	Conserver à 4 ° ;C. Utilisé pour fabriquer MCM et MGM.
Pénicilline/Streptomycine 10 000 unités/ml (100x)	Gibco	15140-122	Conserver à -20 ° ;C. Utilisé pour faire MCM, MGM, MM et DM.
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	Conserver à -20 ° ;C. Utilisé pour faire MCM et MGM.
Sérum fœtal bovin (défini)	Hyclone	SH30070.03	Filtrer stériliser ; conserver à -20 °C. Utilisé pour fabriquer MCM et MGM.
Minimum Essential Medium Earle’s (MEM)	Cellgro	15-010-CV	sans L-glutamine. Contient des sels d’Earle. Utilisé pour faire MCM, MGM et DM.
Sérum de cheval	Gibco	16050	Filtrer stériliser ; conserver à -20 ° ;C. Utilisé pour faire MCM et MGM.
Solution Saline équilibrée de Hanks (HBSS)	Cellgro	21-021-CV	Sans calcium ni magnésium. Conserver à 4 ° ;C. Utilisé pour faire MM.
HEPES 1 M	Gibco	15630-031	Magasin à 4 ° ;C. Utilisé pour faire MM.
T-75 Fiole	Corning	430641
4',6-Diamidino-2-phénylindole, dilactate (DAPI)	Invitrogen	D3571	Utilisé pour colorer le noyau cellulaire.
Lapin anti-Iba1	Wako	019-19741	Utilisé à une dilution de 1/750 pour la coloration ICC d’Iba1.
Lapin anti-NF&kappa ; B (p65)	Abcam	7970	Utilisé à une dilution de 1/1 250 pour la coloration ICC pour p65.
Alexa Fluor 594 Chèvre anti-Rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11012	Utilisé à une dilution de 1/1 000 pour la visualisation du complexe antigène :anticorps dans la CCI.
Pipette sérologique jetable 10 ml	Fisher Scientific	13-678-11E
Tube à centrifuger jetable 50 ml	Fisher Scientific	05-539-8
Tube à centrifuger jetable 15 ml	Fisher Scientific	05-539-12
Boîte de Pétri stérile en polystyrène	Fisher Scientific	875713	100 mm x 15 mm
Ciseaux : Metzembaum droit (ciseaux #1)	Roboz Surgical	RS-6010	1 ; 5 po ; utilisé pour enlever la tête
Ciseaux : Vannas (ciseaux #2)	Fine Science Tools	15000-08	1 ; non incliné ; tranchant de 2,5 mm ; utilisé pour ouvrir le cuir chevelu
Ciseaux : Student Vannas (ciseaux #3)	Fine Science Tools	91501-09	1 ; courbé ; utilisé pour hacher le tissu cérébral
Forcep : Dumont #7 (pince #1)	Fine Science Tools	91197-00	2; Utilisé pour sécuriser le nez et enlever les cortex  ;
Pince : Dumont #2 (pince #2)	Outils de science fine	11223-20	1 ; utilisé pour enlever le cuir chevelu
Forcep : Dumont #3 (forcep #3)	Outils de science fine	11231-30	1 ; utilisé pour enlever le crâne
Forcep : Dumont #5a (forcep #4)	Outils de science fine	11253-21	1 ; utilisé pour enlever les méninges
Tableau de l’équipement spécifique
Microscope à dissection stéréo zoom  ;	Le	Olympus SZ4060	est placé à l’intérieur d’une armoire à flux laminaire-horizontal
Armoire à flux laminaire-horizontal	Nuaire	NU-201-330
Armoire de sécurité biologique	Labconco	3440001	Classe II
enveloppe d’eau CO2 Incubateur	VWR	97025-836	réglé à 37 ° ; C, 5 % CO2
Godets pivotants	Fisher Scientific	75006441	À utiliser avec Rotor
Rotor pivotant	Fisher Scientific	75006445	Max Rayon : 19,2 (cm)
Centrifugeuse Sorvall Legend RT+ (centrifugeuse clinique)	Fisher Scientific	75-004-377	Avec rotor pivotant
Micro 17 microcentrifugeuse ( microcentrifugeuse de table)	Fisher Scientific	S98645	Avec rotor d’un microlitre (24 x 1,5/2,0 ml ; # de chat : 75003524)  ;   ;