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Méthodes de collecte de lait pour souris et Muntjac cerfs de Reeves

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DOI :

10.3791/51007

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19 juillet 2014

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1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Prion Research Center, Colorado State University

Dans cet article

Résumé

La collecte de lait sur des modèles animaux facilite diverses pistes de recherche : comprendre l’immunité passive, identifier les agents pathogènes responsables de la transmission verticale et, grâce à l’utilisation de souris transgéniques, voire la production commerciale de protéines présentes dans le lait maternel humain. Nous illustrons ici une méthode simple de collecte du lait chez les souris et le cerf muntjac de Reeves.

Résumé

Les modèles animaux sont couramment utilisés dans les laboratoires de recherche pour accomplir ce qui serait normalement considéré comme impraticable chez l’hôte natif d’un agent pathogène. La collecte de lait sur des animaux permet aux scientifiques d’étudier de nombreux aspects de la reproduction, notamment la transmission verticale, l’immunité passive, la biologie des glandes mammaires et la lactation. Obtenir des volumes de lait adéquats pour ces études est une tâche difficile, en particulier à partir de petits modèles animaux. Nous illustrons ici une méthode peu coûteuse et facile pour la collecte du lait chez les souris et le cerf muntjac de Reeves qui ne nécessite pas d’équipement spécialisé ni de formation approfondie. Cette méthode particulière nécessite deux chercheurs : l’un pour exprimer le lait et stabiliser l’animal, et l’autre pour recueillir le lait dans un récipient approprié à partir d’un modèle de Muntjac ou de souris. Le modèle de souris nécessite également l’utilisation d’un pipeteur P-200 et des pointes de pipette correspondantes. Bien que cette méthode soit peu coûteuse et relativement facile à mettre en œuvre, les chercheurs doivent être informés qu’une anesthésie de l’animal est nécessaire pour une collecte optimale du lait.

Introduction

Les modèles animaux donnent un aperçu de la pathologie de la maladie qui ne peut être obtenu par une analyse in vitro. De fournir les résultats les plus efficaces, il est important d'utiliser un modèle animal qui est étroitement liée à la maladie et des espèces d'intérêt. Par exemple, le muntjac de l'Reeves (Muntiacus reevesi), un petit cerf Asie 1,2, et les souris transgéniques exprimant la protéine prion des cervidés (CerTgPrP) 3 sont des modèles animaux utiles pour les espèces de cervidés. Les deux espèces sont polyestrous, permettant l'année élevage, et donc une source constante pour les tissus et les fluides liés à la grossesse pour étudier les mécanismes spécifiques à la biologie des cervidés. Études de lait ont une vaste gamme d'applications qui sont plus simplement (et peu coûteuse) accomplis dans des modèles animaux que chez les humains. Les chercheurs peuvent étudier lait et le colostrum comme une source potentielle de 1) la transmission de maladies infectieuses, 2) des immunoglobulines transférés de la mère à la progéniture dans le dévepement de l'immunité passive 4 et 3) la lactoferrine, une protéine présente dans le lait maternel humain impliqué dans l'immunité passive que les chercheurs tentent actuellement de produire commercialement 5.

Collecte une quantité importante de lait des petits animaux peut s'avérer être une tâche difficile. Rogers propose une approche de la collecte du lait de rats 6, qui a ensuite été utilisés chez la souris. Depeters et Hovey proposé deux procédés pour la collecte du lait, l'une utilisant un vide manuellement généré produite par une ampoule de pipette en caoutchouc à l'aide d'une pipette Pasteur, et un second nécessitant la construction d'une unité de traite, qui est ensuite fixé à une source de dépression (par exemple comme un robinet) pour récolter le lait de la souris 7. Nous proposons ici une méthode simple et peu coûteuse pour la collecte du lait de la souris et le muntjac le cerf de Reeves, qui nécessite un équipement de laboratoire seulement facilement disponibles et les compétences techniques de base. Notre méthode donne des volumes suffisants de lait pour diversapplications.

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Protocole

1. Protocole traite souris

Les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par IACUC.

1. Séparation du barrage de Offspring

  1. Sélectionnez le barrage à traire. Choisissez un barrage avec une portée de 4 ou plus petits qui est de 8-12 jours après l'accouchement de fournir du lait maximale collection-même si la collecte est possible à tout point de temps après l'accouchement jusqu'à 21 jours.
  2. Séparer le barrage de sa litière au moins 2 heures avant la traite.
    Remarque: Si un désir de lait plus d'un barrage dans une période de temps donnée, il est acceptable pour abriter les barrages séparés dans la même cage avec une alimentation adéquate et d'eau.

2. L'administration de l'ocytocine, anesthésie et des yeux Lubrifiant

  1. Administrer 2 UI / kg par voie intrapéritonéale d'ocytocine (IP). L'ocytocine est une hormone qui agit sur les glandes mammaires de femelles en lactation à stimuler la libération de lait. L'ocytocine peut être acquise from un vétérinaire.
  2. Administrer un mélange anesthésique contenant 80-100 mg / kg de kétamine en association avec 5-10 mg / kg de xylazine IP. Par exemple, un mélange de 10 ml actions anesthésique peut être préparé à l'avance pour les souris pesant environ 30 g et comprendrait 0,1 ml de xylazine, 8,9 ml H 2 O, et 1,0 ml de kétamine. 0,25 ml anesthésie totale endormir une souris de cette taille environ 20-30 min, ce qui devrait donner suffisamment de temps pour la collecte du lait.
    Notes: Pour déterminer que l'animal a été anesthésié avec succès, la placer délicatement sur le ventre sur une surface solide; elle ne doit pas être en mouvement ses pieds ou de tenter de monter à ses pieds si elle est complètement anesthésié. Dans le cas d'une souris anesthésiée pas pleinement avec la dose initiale, le chercheur peut administrer un autre quart ou la moitié de la dose initiale du mélange anesthésique en fonction de la taille de la souris et / ou le niveau de sédation que la souris a déjà atteint . Toutefois, cela pourrait iUGMENTATION la probabilité d'une réaction indésirable à l'anesthésie, et peut également conduire à la souris étant anesthésiée plus profondément et / ou l'anesthésie pendant une période de temps plus longue.
    Remarque: Si la traite plus d'un barrage, il est nécessaire d'échelonner l'ocytocine et les injections anesthésiques en raison de la courte demi-vie de l'ocytocine et les temps de sédation de la kétamine et de xylazine.
  3. Appliquez une petite quantité de lubrifiant oeil au coin de chaque oeil et se propage à empêcher les yeux de la souris de se dessécher sous anesthésie.

3. Collecte de lait

La collecte du lait est plus facilement réalisée avec deux chercheurs: un chercheur de tenir la souris anesthésiée tout en exprimant manuellement le lait (dénommé R1), et un chercheur pour recueillir le lait (R2). Cette méthode peut également être effectuée avec une seule personne, si la souris est fixé sur une surface plane pour éviter un préjudice.

  1. R2 doit être équipé tampons à l'alcool stériles, un pip P-200Etman, une pointe de pipette propre pour chaque souris, et un récipient pour contenir le lait, comme un tube Eppendorf de 1,5 ml ou un cryovial 1,2 ml (voir tableau des matériaux).
  2. Comme l'ocytocine commence à prendre effet, la descente du lait sera visible dans la zone mammaire de la souris (voir la figure 1A). R1: Déballer un tampon à l'alcool stérile et essuyez délicatement la zone mammaire de la souris pour nettoyer la zone avant la traite. Exprimer manuellement le lait du trayon en utilisant le pouce et l'index pour masser doucement et presser le tissu mammaire dans un mouvement ascendant jusqu'à ce qu'un bourrelet visible de lait commence à se former à la base de la tétine.
  3. Appuyez sur le piston Pipetman P-200 à son premier arrêt pour libérer l'air de la pointe de la pipette et se préparer pour la collecte du lait.
  4. Placez la pointe de la pipette au sommet de la goutte de lait, et tirez doucement le lait dans la pointe de la pipette en libérant lentement la pression sur le piston. Prenez soin de ne pas mettre la pointe trop près de la tétine ou la peau (voirFigure 1B). Il n'est pas nécessaire de libérer complètement le piston car cela va tirer le lait tout le chemin vers le sommet de la pointe de la pipette et il sera difficile d'expulser le lait souvent visqueux dans le récipient de maintien.
  5. Expulser le lait dans le récipient à l'aide du pouce sur le piston au-delà de la première étape (voir figure 1C). Afin de faciliter l'expulsion de petits volumes, appuyez sur la pointe de la pipette contre le côté du tube de manière à ce qu'aucun liquide est perdue.
  6. Continuer à exprimer manuellement le lait de chaque trayon, se déplaçant dans le sens horaire ou antihoraire afin de ne pas sauter des trayons. Il est à la fois acceptable et utile de revenir sans cesse et exprimer le lait de la même tétine doit-il produire plus de lait que les autres.

4. Reprise anesthésique dans le barrage

  1. Dans la plupart des cas, il est fréquent que le barrage pour commencer à commencer à se réveiller pendant le processus de traite. Si ce n'est pas le cas, placez le barrage dans un cage indirectement sous une source de chaleur, comme une couverture de circulation chauffée, jusqu'à ce qu'elle commence à se réveiller.
    Remarque: Comme le barrage commence à se réveiller, garder une surveillance étroite de son activité jusqu'à ce qu'elle est capable de marcher sur sa cage elle-même.
  2. Une fois le barrage se déplace sur la cage sans lutte, placer son dos dans sa cage d'origine avec sa litière. Pas d'effets néfastes ont été constatés à l'égard de la capacité des petits à nourrir après la collecte du lait.

2. Protocole traite Muntjac

Les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par IACUC.

1. Séparation de la Biche de Offspring

  1. Sélectionnez la biche à traire. Les cerfs muntjac de Reeves donnent généralement naissance à un faon 2. Traire la biche le jour après l'accouchement afin de permettre la possibilité de faon d'avoir accès à des nutriments essentiels dans le colostrum 8.
    Remarque: Le faon cache habituellement et ne réapparaît pas au cours de la procedure; la séparation de la paire mère-progéniture n'est pas nécessaire.

2. L'administration de l'ocytocine, anesthésie et des yeux Lubrifiant

  1. Administrer 10 UI / kg de l'ocytocine par voie intramusculaire (IM). L'ocytocine est une hormone qui agit sur les glandes mammaires de femelles en lactation à stimuler la déception de lait. L'ocytocine peut être acquis auprès d'un vétérinaire.
  2. Administrer l'anesthésique BAM IM 11 contenant butorphanol 0,45 mg / kg, azapérone 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Une dose de mélange anesthésique BAM endormir un muntjac environ 20-30 min, ce qui donne suffisamment de temps pour la collection complète de lait. Une autre option pour l'anesthésie est midazolam à 1-2 mg / kg, ce qui endormir un muntjac environ 10-15 min. Bien que cela fournit suffisamment de temps pour la collecte du lait, ce anesthésique est métabolisé plus rapidement que les BAM et l'animal peuvent tenter de s'échapper à la fin de la période de temps plus courte.
    Remarque: Une réponse minimale à la douleur, Réflexes mineures en touchant les oreilles, suivies par la capacité de R1 à tenir le MJ sans lutte indique que l'animal a été anesthésié avec succès.
    Remarque: Dans le cas d'un muntjac pas pleinement anesthésiés avec de la dose initiale, le chercheur peut administrer un autre quart ou la moitié de la dose initiale du mélange anesthésique en fonction de la taille de l'animal et / ou le niveau de sédation, qui a déjà été atteint. Toutefois, cela pourrait augmenter le risque d'une réaction indésirable à l'anesthésie, et peut également entraîner la muntjac être plus profondément anesthésié et / ou anesthésié pour une période de temps plus longue.
  3. Appliquez une petite quantité de lubrifiant dans le coin de chaque oeil et la propagation de prévenir les yeux du muntjac de sécher sous anesthésie.

3. Collecte de lait

La collecte du lait est plus facilement réalisée avec deux chercheurs; un chercheur de tenir le muntjac anesthésié dansla tour tout en exprimant manuellement le lait (désigné par R1), et un second chercheur à garder la tête de la muntjac dans une position confortable et sûre et pour recueillir le lait (R2).

  1. Selon l'anesthésique utilisé, la traite doit être effectuée soit 1) dans leurs stylos à fournir un endroit sûr pour eux devraient-ils se réveiller au cours de la procédure (midazolam induite) 2) ou dans une antichambre d'une literie à maintenir la propreté (BAM- induite).
  2. R1 et R2 doivent être équipés d'une gaze imbibée d'éthanol et 15 ml de plusieurs tubes coniques en polypropylene pour maintenir le lait.
  3. Comme l'ocytocine commence à prendre effet, la descente du lait sera visible dans la zone mammaire du muntjac. R1: Désinfecter les mains gantées et des doigts, ainsi que l'ensemble du pis et les trayons de l'animal individuel avec de la gaze imbibée d'éthanol. R2: Maintenez la tête du muntjac dans une position sûre et confortable pour permettre une facilité de respiration et aider à prévenir la régurgitation rumen. Tenez les cl tubes de prélèvement ose à la tétine étant traire sans le toucher pour éviter la contamination potentielle.
  4. Exprimez-lait d'une tétine en utilisant le pouce et l'index pour presser doucement le tissu mammaire dans un mouvement ascendant jusqu'à ce que la tétine est gorgé de lait, et rouler doucement le lait du trayon et dans le tube que R2 tient (voir la figure 2 ).
  5. Remarque: Le lait sort dans un flux, il est donc important pour R2 pour que le tube de prélèvement placé de sorte que peu ou pas de lait sera gaspillée.
  6. Le pis de l'muntjac est divisé en quadrants. R1: Continuer à exprimer le lait de chaque quadrant jusqu'à ce que le lait ne coule plus facilement. Si le lait ne peut pas être exprimé d'une tétine, exprimer de toutes les autres tétines avant de revenir à la première. Il est à la fois acceptable et utile de revenir sans cesse et exprimer le lait de la même tétine doit-il produire plus de lait que les autres.

4. Reprise anesthésique dans le Doe

t "> Il est commun pour une lapine induite midazolam à commencer à se réveiller au cours du processus de traite. Dans la plupart des cas, la biche va tenter de s'échapper avant tout le lait a été exprimé. retenue mineure est utilisé dans un effort pour augmenter le lait rendement, mais la sécurité et le confort des deux chercheurs et la biche sont tout aussi importants.

  1. Administrer atipamezole à 2,5 mg / mg medetomadine voie sous-cutanée pour l'inversion rapide de BAM anesthésié biche.
    Remarque: Avec les deux types d'anesthésique, il est nécessaire de maintenir une surveillance étroite de la biche jusqu'à ce qu'elle est capable de marcher sur son propre sans trébucher et de tomber, et est capable de manger et de boire sans crainte d'aspiration ou d'étouffement. Pas d'effets néfastes ont été constatés en ce qui concerne la capacité de la faon d'allaiter après la collecte du lait.

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Résultats

Souris

De nos expériences, nous avons déterminé qu'il est possible de collecter environ 100-400 pi de lait d'une souris de laboratoire, en fonction de plusieurs variables. Ces variables comprennent: 1) le temps mis de côté pour la collecte, 2) la dose d'ocytocine administrée, 3) combien de chiots barrage est actuellement infirmière et 4) le montant de la post accouchement de temps. Nos études ont montré que le rendement le plus élevé est obtenu lorsque les barrag...

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Discussion

Souris

Il ya plusieurs facteurs à prendre en considération lors de la collecte de lait d'une souris, y compris 1) le temps mis de côté pour la collecte, 2) la dose d'ocytocine administrée, 3) combien de chiots barrage est actuellement infirmière et 4) le montant de temps qui s'est écoulé depuis la mise bas au moment de la collecte. En utilisant des études précédentes que les lignes directrices, nous avons décidé d'optimiser les conditions pour la production d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces expériences ont été financées par la subvention NIH #RAI093634A. Nous exprimons notre immense gratitude à Jenny Powers, DVM, PhD, pour son aide dans la traite du muntjac.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériaux— ;
Kétamine de souris (KetaVed 100 mg/ml) (dose : 80-100 mg/kg)MWI/Vedco011075
Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose : 5-10 mg/kg)MWI/VedcoNADA 139236
Lubrifiant pour les yeuxMWI/Apexa701013
Ocytocine (2 UI/kg)Vet One501013
Matériaux— ; Muntjac
Midazolam (1-2 mg/kg)Amerisource Bergen Drug Corp924326Facultatif : le chercheur peut utiliser le midazolam seul ou en association avec le BAM comme anesthésique
Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0,45 mg/kg)Fort Dodge Animal HealthNADA 135-780
Tartrate d’azaperone (0,25 mg/kg)ZooPharm
Medetomadine HCl (0,07 mg/kg)ZooPharm
Chlorhydrate d’antipamezol (Antisedan) (dose : 0,25 mg/kg)Orion CorporationNADA 141-033
Ocytocine (10 UI/kg)Vet One501013
Équipement— ; Souris
P-200 PipetmanGilsonF123601
200 &mu ; l pointes de pipetteLight LabsB-2004-SH
Seringues de 1 mlMWI005427
aiguilles de 27 GMWI002031
Équipement— ; Muntjac
15 ml Tubes coniquesVWR21008-918
Aiguilles 22 GMWI873
Seringues Luer Lock 3 mlMWI001377

Références

  1. Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
  2. Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
  3. Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  4. Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
  5. Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
  6. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  7. Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  8. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
  9. Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
  10. Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
  11. Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).

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