Article de méthode

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d'ions concentrations dans Streptococcus pneumoniae Utilisation des colorants fluorescents

DOI :

10.3791/51008

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17 février 2014

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1Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 2Witebsky Center for Microbial Pathogenesis and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 3New York State Center of Excellence in Bioinformatics and Life Sciences, University at Buffalo, State University of New York

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Contrairement à celle observée pour les eucaryotes, il ya un manque d'études qui dépolarisation de la membrane de détail et de la concentration d'ions changements dans les bactéries, principalement que leur petite taille rend les méthodes conventionnelles de mesure difficile. Ici, nous avons des protocoles détaillés pour le suivi de ces événements dans le Gram-positif important agent pathogène Streptococcus pneumoniae en utilisant des techniques de fluorescence.

Résumé

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Membrane dépolarisation et les flux ioniques sont des événements qui ont été largement étudiés dans des systèmes biologiques en raison de leur capacité à influer profondément fonctions cellulaires, y compris l'énergétique et des transductions de signaux. Bien que les deux méthodes fluorescentes et électrophysiologiques, y compris l'utilisation de l'électrode et patch-clamp, ont été bien développés pour mesurer ces événements dans les cellules eucaryotes, la méthodologie de mesure des événements similaires dans des micro-organismes ont prouvé plus difficile à développer en raison de leur petite taille en combinaison avec la plus complexe surface externe de la membrane des bactéries de blindage. Au cours de nos études de mort initiation à Streptococcus pneumoniae (pneumocoque), nous voulions élucider le rôle des événements de la membrane, y compris les changements de polarité, l'intégrité et la concentration des ions intracellulaires. Recherche de la littérature, nous avons constaté que très peu d'études existent. D'autres chercheurs ont suivi l'absorption de radio-isotopes ou d'équilibre pour mesurer la grippe ionxes et potentiel de membrane et un nombre limité d'études, principalement dans des organismes Gram-négatifs, avaient connu un certain succès en utilisant carbocyanine ou oxonol colorants fluorescents pour mesurer le potentiel de membrane, ou le chargement des bactéries avec acétoxyméthylique cellulaire infiltrant (AM) versions d'ester de sensible aux ions colorants indicateurs fluorescents. Nous avons donc créé et optimisé les protocoles de mesure du potentiel de membrane, la rupture, et d'ions de transport dans l'organisme Gram-positif S. pneumoniae. Nous avons développé des protocoles utilisant le bis-oxonol colorant DiBAC 4 (3) et le colorant iodure de propidium cellulaire-imperméant pour mesurer dépolarisation de la membrane et de la rupture, respectivement, ainsi que des méthodes pour charger de manière optimale le pneumocoque avec les esters AM des colorants ratiométriques Fura-2, PBFI, BCECF et à détecter des changements dans les concentrations intracellulaires de Ca2 +, K + et H +, respectivement, en utilisant un lecteur de plaque par fluorescence détection. Ces protocoles sont les premiers de leur genre pour le pneumocoqueet la majorité de ces colorants n'ont pas été utilisés dans d'autres espèces bactériennes. Bien que nos protocoles ont été optimisés pour S. pneumoniae, nous croyons que ces approches devraient constituer un excellent point de départ pour des études similaires dans d'autres espèces bactériennes.

Introduction

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Notre laboratoire a identifié un complexe protéine-lipide à partir de lait humain nommé Hamlet (pour Human Alpha-lactalbumine Fait létale pour les cellules tumorales) qui induit l'apoptose dans les cellules tumorales, mais est également capable de tuer une variété d'espèces bactériennes 1,2. Les espèces qui ont été jugées particulièrement sensibles sont ceux qui ciblent les voies respiratoires, avec Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) affichant la plus grande sensibilité et un phénotype de l'apoptose comme la mort de 2,3. Événements de transport dépolarisation de la membrane et d'ions spécifique sont bien décrits e....

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Protocole

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Une. Préparation cultures bactériennes

  1. Stimuler la culture pour une utilisation dans des expériences
    1. Dans un bloc de chauffage à 37 ° C, décongeler un stock-flacon congelé de S. pneumoniae et ajouter son contenu à 9 ml de frais, préchauffé bouillon de Todd-Hewitt avec de l'extrait de levure à 0,5% (THY) pour un volume total de 10 ml dans un tube de culture en verre.
    2. Incuber statiquement à 37 ° C jusqu'à ce que la culture atteigne la phase semi-log (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6).

2. Détection de dépolarisation de la membrane et de rupture

  1. ....

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Résultats

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Pour toutes les expériences, il existe une série d'échantillons et les conditions présentes dans chaque puits. Ainsi, chaque tracé représente l'intensité de fluorescence d'une population entière de bactéries au cours du temps. Les résultats devraient être faciles à interpréter, avec une distinction claire entre la fluorescence des échantillons traités et que des témoins non traités. La cinétique et le degré de changement observé dans fluorescence pourraient fournir des informations sur le mécanisme possible et .......

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Discussion

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Malgré la limitation de cette taille présente de en utilisant des procédés classiques d'électrophysiologie pour détecter les changements de polarité et de l'intégrité de la membrane et des changements dans les concentrations d'ions à l'intérieur des bactéries, nous avons décrit une manière de mesurer ces événements dans S. pneumoniae en utilisant des colorants fluorescents. Nos protocoles sont les premiers de leur genre décrit pour le pneumocoque et l'un des rares décrits pour les espèces ba.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont aucun intérêt financier concurrents à déclarer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation Bill et Melinda Gates (subvention 53 085), la Fondation JR Oishei, et l'American Lung Association (Grant RG-123721-N) à APH, et les NIH (NIDCD) bourse F31DC011218 à CAE.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bouillon Todd-HewittBacto, BD Diagnostics249240
Extrait de levureBacto, BD Diagnostics212750
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; pH 7,2)Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD5879DMSO
DiBAC4(3) (acide bis-(1,3-dibutylbarbiturique) trimethine oxonol)Sondes moléculairesB-438
Iodure de propidiumSigma-AldrichP4170Maquillage dans de l’eau désionisée
D-(+)-GlucoseSigma-Aldrich
PowerLoadSondes moléculairesP10020100x concentré
Sondes moléculairesde probénécideP36400Fabriquer 100x stock en ajoutant 1 ml de PBS dans un flacon
de 77 mgSondes moléculairesF1221Emballage spécial (50 µ ; g aliquotes)
PBFI/AMSondes moléculairesP1267Emballage spécial (50 µ ; g aliquotes)
NigericinSigma-AldrichN7143
KH2PO4JT Baker3246-01monobasique
NaOHJT Baker5565-01
K2HPO4JT Baker4012-01dibasic
BCECF/AMSondes moléculairesB1170Emballage spécial (50 & micro ; g aliquotes)
CCCPSigma-AldrichProtonophore qui provoque un afflux de H+ dans le cytoplasme, dissipant le potentiel électrique et le gradient H+.
Tube de culture  ;VWR53283-802Convient au spectrophotomètre Spectronic ; verre borosilicaté
SpectrophotomètreThermo ScientificSpectronic 20D+
15 ml Tube conique en plastiqueCorning430790
Plaque de microtitration en polystyrène transparent à 96 puitsFisher Scientific12-565-501
Lecteur de plaquesBioTekSynergy 2 Multi-Mode
Logiciel Gen5BioTekGen5&trade ; Logiciel
Fura-2/AM

Références

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  1. Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
  2. Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericida....

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Mots-clés

D polarisation membranaireRupture membranaireTransport ioniqueD tection de fluorescenceLecteur de plaques

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