Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Résumé

Cette vidéo montre une stratégie simple et fiable pour la préparation de cultures pures de cellules endothéliales de cerveau antérieur embryonnaire dans les 10-12 jours et sera utile pour la recherche axée sur de nombreux aspects de l'angiogenèse cérébrale.

Résumé

Cellules endothéliales du cerveau embryonnaires peuvent servir comme un outil important dans l'étude de l'angiogenèse et le développement neuro-vasculaire et les interactions. Les deux réseaux vasculaires du cerveau antérieur embryonnaire, la pie-mère et périventriculaire, sont distinctes dans l'espace et avoir des origines différentes et des modèles de croissance. Les cellules endotheliales à partir des réseaux vasculaires et la pie-mère périventriculaires ont des profils uniques d'expression génique et les fonctions. Nous présentons ici un protocole étape par étape pour l'isolement, la culture, et la vérification des populations pures de cellules endothéliales à partir du réseau vasculaire périventriculaire (PVECs) du cerveau antérieur embryonnaire (télencéphale). Dans cette approche, le télencéphale dépourvue de membrane pial obtenu à partir de 15 jours embryonnaires de souris est hachée, une digestion avec de la collagénase / dispase, et on disperse mécaniquement dans une suspension cellulaire unique. PVECs sont purifiés à partir de la suspension cellulaire en utilisant une sélection positive avec l'anticorps conjugué à anti-CD-31/PECAM-1 microbilles en utilisant une forte magnétiqueProcédé de séparation. Des cellules purifiées sont cultivées sur collagène 1 boîtes de culture revêtues dans endothéliale milieu de culture de cellules jusqu'à confluence, et en outre en subculture. PVECs obtenu avec ce protocole exposition pavé et en forme de fuseau phénotypes, comme visualisé par microscopie optique à contraste de phase et microscopie de fluorescence. Pureté des cultures Pvec a été créée avec des marqueurs de cellules endothéliales. Dans nos mains, cette méthode fiable et cohérente donne des populations pures de PVECs. Ce protocole bénéficiera des études visant à obtenir un aperçu mécanistes dans le cerveau antérieur angiogenèse, la compréhension des interactions de Pvec et croisées des entretiens avec les types de cellules neuronales et détient un énorme potentiel pour l'angiogenèse thérapeutique.

Introduction

L'angiogenèse, la neurogenèse et la migration neuronale sont des événements critiques dans le système nerveux central (SNC) le développement, la réparation et la régénération. Plusieurs études ont montré que les élégantes cellules endothéliales stimulent la prolifération neuronale et vice-versa grâce à la libération de facteurs solubles et par contact direct. Nous avons trouvé curieux que dans la majorité de ces études ^1-3, tandis que progéniteurs neuronaux / cellules souches neurales sont isolées du cerveau embryonnaire, ils sont co-cultivées avec des cellules endothéliales de cerveau de l'adulte, d'autres sources de tissu adulte, ou avec des lignées de cellules endothéliales. Cela peut être dû à des difficultés techniques associées à l'isolement et la mise en culture des populations pures de cellules endothéliales de cerveau embryonnaire en partie. Cependant, l'angiogenèse, la neurogenèse, la migration neuronale et sont des événements simultanés qui se produisent dans des ordres de grandeur plus robuste dans le cerveau embryonnaire que dans le cerveau d'un adulte normal. Le réseau vasculaire périventriculaire du embryonic cerveau antérieur (télencéphale) provient d'un navire situé dans le ganglion basal ébauche et se développe sous la forme d'un gradient ordonnée de ventral à dorsal télencéphale par jour embryonnaire 11 (E11) ^4,5. Ce plexus de vaisseaux du réseau vasculaire périventriculaire se distinguent des vaisseaux pie-mère basée sur les origines, la localisation anatomique, les modèles de croissance, et la régulation du développement ^4,5. La direction de propagation du gradient de l'angiogenèse périventriculaire correspond à la pente transversale neurogenetic télencéphalique. Au sein du télencéphale, le gradient de l'angiogenèse périventriculaire et le gradient de migration des neurones GABA chevauchent tangentiellement dans l'espace ainsi ^6. En ce qui concerne la synchronisation, le gradient de l'angiogenèse est l'avance de la pente et de GABA neurone neurogenetic gradient d'environ un jour. Ainsi, les cellules endothéliales périventriculaires sont spatialement et temporellement bien placés pour fournir des indices essentiels pour soutenir la neurogenèse et télencéphaliqueneuronale ^4,6 de migration. Par conséquent, l'utilisation des cellules endothéliales périventriculaires embryonnaires dans des expériences de co-culture avec des progéniteurs et / ou des neurones neurones fournirait un modèle plus favorable pour l'étude des interactions neurovasculaires et le développement de nouvelles voies pour le traitement de maladies neurodégénératives ou une lésion cérébrale ischémique / traumatique.

Nous insistons sur l'importance d'éliminer la membrane pial, non seulement pour limiter la contamination des cellules épithéliales, mais aussi pour séparer les cellules endothéliales pie-mère qui sont moléculairement et fonctionnellement distincte de cellules endothéliales du réseau vasculaire périventriculaire ^4,6 (de PVECs appelés à distinguer de la pie-mère EC) . Ici, nous décrivons la méthode que nous utilisons régulièrement dans notre laboratoire pour obtenir un rendement riche et pur de PVECs. Ces cellules endothéliales sont préparés à partir forebrains embryonnaires isolées à partir d'un simple clic de souris chronométrée enceinte. Ils peuvent être complétés, en sous-culture, et on les congèle avec succès vers le bas pour une utilisation future.

Protocole

Une. Préparation des réactifs et solutions

1. Revêtement de 35 mm boîte de culture: Le collagène de type 1 est fournie comme solution une solution aqueuse à 20 mM d'acide acétique (~ 100 mg de protéine / fiole). Diluer un volume approprié de solution de collagène à une concentration de travail de 0,01% en utilisant une culture tissulaire stérile eau de qualité. plats Manteau avec 1 ml de solution de collagène pour 3-4 heures à température ambiante (RT) ou 37 ° C, ou une nuit à 2-8 ° C. Enlever l'excédent de la boîte enduit et laisser sécher pendant la nuit. Rincer le plat avec de l'eau de qualité de culture de tissus ou de PBS avant d'ajouter les médias. Boîtes revêtues peuvent être stockés à 4 ° C pendant un mois.
2. Préparer milieu Eagle modifié par Dulbecco complet (DMEM). Compléter le DMEM (500 ml) avec 10% de FBS et de solution antibiotique-antimycotique (concentration de 1x; une ml/100 ml). DMEM complet peut être stocké à 4 ° C pendant deux mois.
3. Préparer une partie aliquote (50 ml) de DMEM avec de la DNase I (0,001 mg / ml), (dénommé DMEM-DNase I).
4. Préparer une autre partie aliquote (10 ml) de DMEM avec de la collagénase et de la dispase (1 mg / ml) (dénommé DMEM-collagenase/dispase).
5. Préparer des cellules endothéliales milieu de culture (ECCM, 500 ml), supplémenté avec de l'EGF (5 ng), ECGS (100 mg) et 5 ul de solution d'antibiotique-antimycotique. ECCM peut être stocké à 4 ° C pendant deux mois.
6. Préchauffer tous les médias avant de l'utiliser.
7. Préparer le tampon de purification: PBS, pH 7,2 avec 0,5% de BSA et 2 mM d'EDTA. Gardez tampon froid (2-8 ° C).

2. Suppression des embryons et dissection de Télencéphale

Toutes les expériences utilisant des animaux de laboratoire sont approuvés par les soins des animaux et de l'utilisation des comités de l'hôpital McLean et sont conformes aux directives du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Utilisez la souris CD1 enceintes chronométrés (jour embryonnaire 15). Le jour de la découverte du bouchon vaginal est considéré comme jour embryonnaire 0 (E0). CD1 barrages produisent généralement de grandes portées, de sorte 10-12 embryons sont attendus à partir d'un barrage enceinte.
2. Pour hystérotomie, anesthésier les souris enceintes avec une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg). Pour les souris d'environ 20-30 g, livrer 0,3 ml d'une solution anesthésique 10 ml / kg de kétamine / xylazine et veiller à ce que la douleur et la détresse est minime lors des injections intra-péritonéales de l'anesthésie. Faire preuve de retenue à la main pour les injections.
3. Vérifiez anesthésie profonde par pincement de l'orteil. Retirer des embryons de souris profondément anesthésiés. Décapiter chaque embryon immédiatement après son retrait de la mère. Placez les têtes embryonnaires dans des plats de Pétri dans glacée PBS.
4. Suivez l'hystérectomie par euthanasie immédiate avec surdose d'un anesthésique (130 mg / kg de pentobarbital, ip), une méthode d'euthanasie, qui est conforme aux lignes directrices de l'AVMA sur l'euthanasie des animaux: 2013 Edition.
5. Sous un microscope stéréo, retirez le cerveau de la tête avec des ciseaux à micropointes fines et une pince fine. Remarque: Une dissection de haute qualitéion est indispensable pour réussir à éliminer la membrane pial du cerveau embryonnaire. Ceci est réalisé en pratique. Une pince fine et ciseaux à micropointes sont également des outils essentiels pour obtenir un bon dissection.
6. Utilisez la pince pour obtenir une prise ferme sur le cerveau et les ciseaux à micropointes à décoller la membrane pial. Retirez le mésencéphale et métencéphale et isoler le télencéphale. Transfert télencéphale pial-libre de tous les embryons à une boîte de culture de 35 mm avec 2 ml de PBS dans la glace.

3. Cellule d'isolement

1. Hacher le télencéphale en fragments de 1 à 2 mm avec une lame de scalpel et recueillir le tissu dans un tube Falcon de 15 ml contenant 2 ml de DMEM complet.
2. Dissocier le tissu doucement mais à fond avec une pipette de 1 ml jusqu'à touffes disparaissent et une suspension laiteuse est atteint.
3. Centrifugeuse dissocié les cellules à 800-1000 g pendant 5 min à température ambiante.
4. Retirez délicatement le surnageant et remettre le culot dans du DMEM-DNase I. doucement dissocier la CElls nouveau en utilisant pipette de 1 ml et centrifuger à 800-1000 g pendant 5 min à température ambiante.
5. Reprendre le culot dans du DMEM chaud complet. cellules de filtrer à travers un maillage de 70 um Nylon stérile. Recueillir des cellules filtrées et garder dans la glace.
6. Recueillir les cellules-parties retenues sur le maillage et digérer plus loin avec DMEM-collagenase/dispase (2 ml) pendant 1-2 min à température ambiante. Laver les cellules 3 fois dans du milieu DMEM-DNase I par centrifugation à 800-1000 g pendant 5 min à température ambiante. Commun de ces cellules avec les cellules filtrées recueillies à l'étape 3.5. Laver les cellules une fois avec le total DMEM complet. Passez à déterminer le nombre de cellules et des mesures d'étiquetage magnétiques. Remarque: Il est important pour obtenir une suspension à cellule unique avant le marquage magnétique.

4. Étiquetage magnétique

1. Ce protocole indique le marquage magnétique de 10 ⁷ cellules. Pour le nombre de cellules inférieur à 10 ^7, utilisent le même volume de réactif et pour le nombre de cellules de plus de 10 ^7, à l'échelle de tous les volumes de réactifs et le total des volumesen conséquence (par exemple pour 2 x 10 ⁷ cellules totales, utiliser deux fois le volume de tous les réactifs indiqués). Conservez tous les réactifs et les cellules dans la glace.
2. Déterminer le nombre de cellules avec un hémocytomètre.
3. Centrifugeuse suspension de cellules à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant complètement.
4. Ajouter μl/10 90 ⁷ cellules de tampon de purification pour le culot de cellules, suivie par 10 ul de microbilles CD31. Les microbilles fournies par le fabricant sont conjugués à l'anticorps monoclonal anti-CD31 de souris.
5. Bien mélanger et incuber pendant 15 min au réfrigérateur. Remarque: Des températures plus élevées et / ou un plus long temps d'incubation pendant marquage magnétique peut entraîner la liaison non spécifique.
6. Laver les cellules par addition de 2.1 ml/10 ⁷ cellules de tampon de purification et centrifuger à 300 g pendant 10 min. Enlever les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 500 ul de tampon de purification. Procéder à une séparation magnétique ou étape de purification.

5. Purification

1. Placez MS colonne dans le champ magnétique de MACS Separator.
2. Rincer la colonne avec 500 ul de tampon de purification.
3. Appliquer une suspension de cellules dans la colonne. Chargez nombre approprié de cellules de MS colonne le nombre de cellules plus élevée peut obstruer la colonne. Attention: Chaque colonne MS peut accueillir un maximum de 2 x 10 ⁷ cellules, pour un nombre de cellules plus élevée, utiliser plusieurs colonnes.
4. Recueillir et jetez accréditives contenant des cellules non marquées.
5. Laver la colonne avec 500 ul de tampon de purification trois fois. Au cours des étapes de lavage, assurez-vous que le réservoir de la colonne est vide avant addition de quantités de tampons de purification ultérieures.
6. Supprimer colonne du séparateur MACS et le placer sur un tube Falcon de 15 ml.
7. Un plongeur est fourni avec la colonne MS. Pipette 1 ml de tampon de purification sur la colonne MS et rincer immédiatement les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne.
8. Plaque cells sur une boîte de culture de 35 mm pré-revêtu avec du collagène de type 1 et cultiver des cellules dans CCME dans un incubateur réglé à 37 ° C avec 95% d'O ₂ et 5% de CO _2.
9. Changer le milieu tous les quatre jours. Utilisez PVECs pour des expériences ou sous-culture après 10-12 jours lorsque le plat est confluent.

6. Subculture de PV ECS

1. Retirez le CCME et rincer la monocouche de PVECS avec 1-2 ml de PBS stérile.
2. Ajouter lentement 1,5 ml de solution à 0,25% de trypsine-EDTA pour couvrir la monocouche cellulaire.
3. Remettre le plat dans l'incubateur. Dans 5-7 min, les cellules se détacher de la surface de la boîte.
4. Après que les cellules ont détaché, ajouter immédiatement un volume égal d'inhibiteur de la trypsine et on triture plusieurs fois.
5. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml de Falcon stérile. Centrifuger le tube à 500 g pendant 5 min.
6. Enlever le surnageant et remettre le culot dans 1 ml de préchauffé CCME.
7. Ensemencer les cellules d'expansion de la culture, imvieillissement ou d'autres dosages.

Résultats

La caractérisation phénotypique des PVECs du jour 1-12 est représenté par microscopie optique à contraste de phase (Figure 2). Les cellules fixées à l'antenne le jour 1 montrent une morphologie caractéristique de la division cellulaire (figure 2A). Entre 5-8 jours, PVECs transition de galets de pierre à la broche en forme de morphologie typique des cellules endothéliales et plus proche de son état ​​in vivo (figures 2B et 2C). Par jour 12 d...

Discussion

Pvec de sont physiologiquement plus pertinent que les cellules endothéliales cérébrales adultes et EC provenant d'autres sources de tissus pour des études portant sur les interactions neurovasculaires et avoir un potentiel thérapeutique aussi. Pour la préparation PVEC, il est essentiel début à la dissection de travailler rapidement pour obtenir une bonne viabilité puisque les cellules mortes peuvent se lier de manière non spécifique à microbilles CD31. En outre, si la suspension à cellule unique n'est pas attein...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DNase I	Sigma	D-4527	;
Collagène, solution de type 1 de queue de rat  ;	Sigma	C3867	;
Produits biologiques de qualité	DPBS	114057-131	;
EDTA	Fisher Scientific	M4055	² ;
BSA	Sigma	A2058	;
MS column	Miltenyi Biotech	130-042-201	;
Microbilles CD31	Miltenyi Biotech	130-097-418	;
Séparateur MACS	Miltenyi Biotech	130-042-102	;
Stand multiple MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303	;
Crépine à cellules 70 µ ; m	BD Bioscience	352350	;
Solution antibiotique et antimycosique	Sigma	A5955	²�
FBS	Sigma	F4135	² ;
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	;
DMEM  ;	Lonza	12-604F	;
Plat de culture 35 mm	BD Bioscience	353001	;
Tube Falcon de 15 ml  ;	BD Bioscience	352097
50 ml Tube Falcon	BD Bioscience	352098	;
Kit ECCM	Le kit 355054 BD Bioscience		comprend un supplément de croissance des cellules endothéliales, un EGF et un supplément
croissance des cellules endothéliales (ECGS)	Bioscience	354006	;
Applications des cellules	RBECGM	R819-500	;
DMEM F12° ;	Life Technologies	10565-018	;
GlutaMAX	Life Technologies	305050-061	;
Eau de culture tissulaire Life	Technologies	15230162	;
0,25 % Trypsine Life	Technologies	15050	;
Inhibiteur de la trypsine de soja	BD Bioscience	5425	;
Matrigel	BD Bioscience	354234	;
Qtracker 655 Kit d’étiquetage cellulaire	Life Technologies	Q25021	;
Membrane plasmique CellLight-RFP, BacMam 2.0	Life Technologies	C10608	;
Anticorps biotinylé contre l’isolectine B4	Sigma	L2140	;
Facteur anti-Von Willebrand	Sigma	F3520	;
Anti-CD31/PECAM-1	BD Pharmingen	550274	;
Supports de montage VECTASHIELD Hardset avec DAPI	Vector Laboratories	H-1500	;
Kétamine	Butler Schein Approvisionnement en santé animale	44028	;
Xylazine	Lloyd Laboratories	1009	;
Stéréomicroscope	Motic	SMZ-168	;
Hémocytomètre	Fisher Scientific	267110	;
Microscope inversé	Olympus CK-40	CK-40	;
Microscope fluorescent	Olympus FSX-100	FSX-100	;
Pince fine	Roboz Instrument chirurgical	7 inox	;
Ciseaux fins à micro-pointes	Roboz Surgical Instrument	RS5611	;

de inhibiteur de la trypsine de sojaBD