Nous décrivons ici d'une simple hybridation fluorescente in situ (FISH) Méthode pour la localisation des virus et des bactéries dans les tissus d'insectes et de plantes. Ce protocole peut être étendu pour la visualisation de l'ARNm dans la montagne ensemble et coupes microscopiques.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Hybridation in situ fluorescente (FISH) est un nom donné à une variété de techniques couramment utilisées pour la visualisation de la transcription de gènes dans des cellules eucaryotes et peuvent être en outre modifiées pour visualiser d'autres composants dans la cellule telles que l'infection par des virus et des bactéries. Localisation spatiale et la visualisation des virus et des bactéries au cours du processus d'infection est une étape essentielle qui vient compléter le profil d'expression des expériences comme les puces et RNAseq en réponse à différents stimuli. Comprendre les infections spatio-temporelles avec ces agents complète expériences biologiques visant à mieux comprendre leur interaction avec les composants cellulaires. Plusieurs techniques de visualisation des virus et des bactéries telles que les systèmes de gènes rapporteurs ou des méthodes immunohistochimiques sont longues, et certains sont limités à travailler avec des organismes modèles et sur les méthodologies complexes. FISH qui cible les espèces d'ARN ou d'ADN dans la cellule est un moi relativement facile et rapidethode pour étudier la localisation spatio-temporelle des gènes et à des fins diagnostiques. Cette méthode peut être robuste et relativement facile à mettre en œuvre lorsque les protocoles emploient court hybridation, les sondes commercialement achetés, qui ne sont pas chers. Ceci est particulièrement robuste lorsque la préparation des échantillons, la fixation, l'hybridation, et la visualisation microscopique ne comportent pas d'étapes complexes. Nous décrivons ici un protocole de localisation de bactéries et de virus dans les tissus d'insectes et de plantes. La méthode est basée sur une préparation simple, la fixation et l'hybridation des supports entiers insectes et les organes disséqués ou sections de plantes fabriqués à la main, avec 20 paires de bases des sondes d'ADN courts conjugués à des colorants fluorescents sur leur extrémité 5 'ou 3'. Ce protocole a été appliqué avec succès à un certain nombre de tissus d'insectes et de plantes, et peut être utilisée pour analyser l'expression des ARNm ou d'autres espèces d'ARN ou d'ADN dans la cellule.
Introduction
Lors de l'étude des interactions entre les virus de plantes et d'autres agents pathogènes avec leurs hôtes végétaux infectés, il est important de visualiser les agents pathogènes et leurs acides nucléiques respectifs in situ, indépendamment du fait qu'ils ont des effets négatifs sur leurs hôtes. Ceci est très important lorsque l'on étudie le mouvement de l'agent pathogène à l'intérieur et entre les cellules de la plante. En localisation in situ de produits du gène de l'agent pathogène est une étape essentielle qui s'ajoute à d'autres approches pour l'étude du processus de pathogénicité. De nombreux agents pathogènes des plantes, en particulier les virus, sont transmis par les insectes, comprenant des interactions complexes et intimes avec leurs vecteurs. La localisation de ces virus dans leurs vecteurs est important pour l'étude de la voie de transmission, et les sites possibles d'interaction à l'intérieur du vecteur. La transmission de certains virus de plantes contre les insectes vectorisé est aidée par des bactéries symbiotiques qui se trouvent dans ces insectes. Pour mieux étudier la transmission de ces virus de plantes by leurs vecteurs, il est également essentiel de visualiser les bactéries symbiotiques en général, et ceux qui sont impliqués dans la transmission du virus, en particulier. Colocalisation des virus et des bactéries symbiotiques est donc souhaitable pour enquêter sur les relations possibles entre ces organismes dans leur insecte hôte. En dehors de la transmission du virus, les bactéries symbiotiques influencent plusieurs aspects de la biologie des insectes vecteurs, la localisation ainsi spatiale de ces bactéries dans les insectes est d'un grand intérêt et d'importance.
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) est le plus important complexe de la maladie virale de la tomate cultivée dans le monde 1-4. TYLCV est un virus limitée au phloème et est exclusivement guidé par l'aleurode Bemisia tabaci 5,6. Un modèle décrivant la translocation de bégomovirus dans leurs vecteurs aleurodes a été proposée 6-9. Deux obstacles spécifiques sont activement croisés pendantment cette transmission circulante: l'intestin moyen / hémolymphe et les obstacles de la glande hémolymphe / salivaires. Ce procédé de transmission est supposé être médiée par des récepteurs qui reconnaissent inconnus la capside du virus. TYLCV est pensé pour traverser B. tabaci intestin moyen de 6,10, et est absorbé à travers le primaire des glandes salivaires 6 avant d'être injecté dans la plante. Dans l'hémolymphe aleurodes, TYLCV interagit avec une protéine GroEL produite par l'insecte secondaire endosymbiotique bactérie Hamiltonella. Cette interaction assure la sécurité du transport de TYLCV dans l'hémolymphe, et la protège contre l'attaque par le système immunitaire des insectes 11. Hamiltonella et Portiera, la endosymbiote primaire aleurodes, sont logés dans bactériocytes, des cellules d'insectes trouvés dans l'hémolymphe et la maison endosymbiotiques bactéries 11. B. tabaci abrite des bactéries symbiotiques supplémentaires, y compris Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, et Fritschch, qui peuvent être localisés à l'intérieur ou à l'extérieur des bactériocytes, et ont des effets divers sur la biologie de l'insecte 12.
Plusieurs rapports ont tenté d'étudier la localisation de TYLCV dans les plantes et les aleurodes en utilisant des protocoles de fastidieuses et coûteuses telles que microscopie électronique à transmission (MET), les anticorps et l'ARN in situ sur la section d'épaisseur microscopique 10,13, une étude récente décrit la localisation des virus de plantes à l'intérieur de leurs hôtes végétaux et vecteur à l'aide d'un protocole simple 14. Nous décrivons ici un protocole simple pour la localisation de TYLCV dans B. tabaci disséqué estomacs et les glandes salivaires, et aux articles préparés à partir de plantes infectées par le TYLCV. Nous décrivons en outre la localisation de Portiera, la endosymbiote primaire de B. tabaci, et ses endosymbiontes secondaires Hamitonella, rickettsies et Arsenophonus. Ce protocole est basé sur l'utilisation de sondes d'ADN courts, quesont marqués par fluorescence sur leur extrémité 5 ', et de s'hybrider spécifiquement à des séquences complémentaires dans les séquences géniques virales ou bactériennes. Le traitement de l'échantillon est relativement facile et le signal obtenu est très spécifique. Le protocole décrit peut être utilisé pour localiser des virus, des bactéries et d'autres agents pathogènes chez leurs hôtes végétaux, les animaux et les insectes, et peut en outre être utilisé pour localiser l'ARNm dans un tissu donné.
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Protocole
Une. Préparatifs général aleurodes, des plantes, et Virus pour l'analyse FISH
- B arrière et Q biotype aleurodes sur les plants de coton (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) et maintenir dans des cages insect-proof et chambres de croissance dans des conditions standard de 25 ± 2 ° C, 60% d'humidité relative, et une lumière de 14 h / 10 h photopériode sombre.
- Faire la PCR pour tester l'infection par endosymbiontes en utilisant des amorces spécifiques endosymbiont comme décrit précédemment 15-19.
- Acheter des plants de tomate (Solanum esculentum cv. Beefsteak) à partir d'une pépinière commerciale ou végétales graines de tomates.
- Maintenir dans les mêmes conditions d'élevage décrites ci-dessus jusqu'à ce que les plantes atteignent le stade quatre feuilles vraies, l'âge le plus approprié pour l'inoculation d'aleurodes médiation du TYLCV 15 (voir la section 4.1 ci-dessous).
2. Manipulation des insectes, Fixation, sonde conception, hybridation, et visualisation pour Endosymbiote FISH
- Recueillir 10 aleurodes par aspiration de plants de coton, ou prendre 10 3 e ou 4 e nymphes âgées à partir de feuilles de coton.
- Plonger immédiatement dans le fixateur de Carnoy (acide chloroforme-éthanol-acétique glacial, 06:03:01, v / v) à l'intérieur des tubes Eppendorf. Fixer pendant 2 heures à une nuit (de préférence la nuit).
- Supprimer complètement le fixateur et décolorer dans 6% H 2 O 2 dans l'éthanol pendant 2 heures.
- Préserver les échantillons dans de l'éthanol absolu pendant plusieurs jours à plusieurs semaines à la température ambiante, ou passer à l'étape suivante.
- Conception des sondes amorces d'ADN inverse comme complémentaires basées sur les ribosomique 16S gènes d'ARN de chaque bactérie. Pour la conception des sondes, prendre en compte les mêmes considérations pour la conception des amorces de PCR. Utiliser les sondes oligonucléotidiques BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'-Cy3 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-Cy3 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'et 5'-ARS2 Cy3TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'pour le ciblage spécifique de Portiera, Rickettsia, Hamilonella, et Arsenophonus, respectivement.
- Hybrider les échantillons pendant une nuit dans l'obscurité dans un tampon d'hybridation (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M de NaCl, 0,01% [p / v] de sodium dodécyl sulfate, 30% de formamide de [vol / vol]) contenant 10 pmol sonde fluorescente par ml . Combiner plus d'une sonde avec différents colorants fluorescents, si nécessaire. Utiliser les aleurodes non infectées par la bactérie ciblée et des échantillons non-sonde de témoins négatifs.
- Montez les échantillons ensemble, sur une lame de microscope, dans le tampon d'hybridation contenue avec un bloqueur liquide, couvrir avec une lamelle, sceller avec du vernis à ongles, et vue sous une fluorescence ou microscope confocal.
3. Aleurode organes Dissection, Fixation, hybridation, et visualisation pour TYLCV FISH
- Recueillir aleurodes adultes élevés en permanence sur des plants de tomates TYLCV-infectés par aspiration et anesthetize par l'exposition à la serviette en papier imprégné d'acétone. Exposer les aleurodes seulement pendant 1-2 min trop longue exposition à l'acétone peut fixer les tissus de aleurodes. Utilisez les aleurodes nonviruliferous élevés sur des plants de tomates non infectées et aucun échantillon de la sonde pour les contrôles de confirmer l'hybridation spécifique.
- Aleurodes montage sur la dépression des lames de microscope de dissection des organes à l'aide d'un microscope stéréo.
- Arracher la tête d'insecte du prothorax et disséquer les glandes salivaires en 1x PBS additionné de 1% toluidine bleue pour une meilleure visualisation, en raison de leur petite taille. Permettre l'absorption de la tache pendant 2-3 min.
- Tirez l'insecte part à la jonction entre le thorax et l'abdomen d'observer et d'expulser hors de l'intestin moyen. Expulser le contenu de l'abdomen en poussant avec une pince sur le bout de l'abdomen.
- Retirez délicatement le PBS et le bleu de toluidine de dissections succès et ajouter délicatement 300 pi de fixateur de Carnoy pour fixer les organes pendant 5 min.
- Add le fixateur d'un côté du puits et non déprimée par le haut pour empêcher un mouvement non contrôlé des organes disséqués. Une fois de toucher le fixateur, les organes adhèrent au verre, et dans le processus, ils ne bougeront pas.
- Retirer fixateur et ajouter 500 ul de tampon d'hybridation supplémenté avec 10 pmol de la sonde d'ADN fluorescent Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', qui est complémentaire d'une séquence dans le gène de protéine d'enveloppe du TYLCV.
- Hybrider une nuit à température ambiante dans l'obscurité par la lame à incuber avec l'échantillon à l'intérieur d'une petite chambre humide composée de petite boîte en plastique avec du papier de serviette humide au fond.
- Après l'hybridation, ramasser les organes d'un outil de dissection fine et rapidement les déplacer sur une lame de microscope frais contenant 30 pi de nouveau tampon d'hybridation supplémenté avec DAPI (0,1 mg / ml dans PBS 1x) et contenus avec bloqueur liquide.
- Couvrir les échantillons avec une lamelle, sceller l'esprith vernis à ongles et vue sous une fluorescence ou microscope confocal.
4. Manipulation de l'usine, la main sectionnement, fixation, et l'hybridation pour TYLCV FISH
- Inoculer des plants de tomates avec l'aide de TYLCV virulifères inoculation d'aleurodes médiation. Le virus peut être détecté en utilisant cette méthode FISH dans les plantes asymptomatiques d'une semaine après l'inoculation. Symptômes typiques de la maladie sont visibles trois semaines après l'inoculation. Utilisez des plants de tomates non infectées et aucun échantillon de la sonde pour les contrôles de confirmer l'hybridation spécifique.
- Utilisez une lame de rasoir histologique forte pour la préparation de longues sections 2-4 cm coupé à la main longitudinales ou transversales de tomate tiges et les feuilles.
- Dans des tubes Eppendorf, fixer les sections de fixateur de Carnoy pendant 2 heures à une nuit à température ambiante.
- Retirer fixateur et préserver les sections dans l'éthanol absolu pour plusieurs jours à plusieurs semaines à la température ambiante, ou passer à l'étape suivante.
- Laver les sectionstrois fois, 1 minute chaque fois, dans du tampon d'hybridation.
- Hybrider les sections avec 500 ul de tampon d'hybridation supplémenté avec 10 pmol de la sonde oligonucléotidique fluorescente Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 'qui est complémentaire d'une séquence dans le gène de protéine d'enveloppe du TYLCV.
- Laver les sections trois fois, 1 min chacune, dans un tampon d'hybridation.
- Sections de montage entières dans le tampon d'hybridation supplémenté avec DAPI (0,1 mg / ml dans PBS 1x) et contenus avec bloqueur liquide, couvrir avec une lamelle, sceller avec du vernis à ongles et vue sous une fluorescence ou microscope confocal.
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Résultats
Le système étudié dans ce manuscrit est illustré à la figure 1 et comprend une plante infectée avec TYLCV, un adulte et d'une nymphe de l'aleurode B. tabaci, et l'anatomie interne de l'aleurode montrant le chemin pour TYLCV translocation dans l'insecte. Figure 2 montre deux poissons dans un aleurode adulte pour le symbiote primaire Portiera et le symbiote secondaire Arsenophonus. Figure 3 montre le double FISH pour Port...
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Discussion
Le protocole décrit ici pour la localisation d'un virus de plante dans son hôte de plante et l'insecte vecteur, et les bactéries symbiotiques dans leur hôte de la mouche blanche spécifique, peut être adapté pour la localisation d'autres virus dans les plantes et, même dans les tissus animaux. En outre, le protocole peut être utilisé pour localiser les bactéries symbiotiques et pathogènes et d'autres microorganismes dans les systèmes de plantes et d'animaux. Les méthodes décrites reposent sur le conce...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
La recherche dans le laboratoire Ghanim a été financée par la subvention de recherche no. 908-42.12/2006 de la Fondation germano-israélienne (GIF), accordent pas. IS-4062-07 du-Unis Israël Royaume-Fonds binational de recherche agricole et le développement (BARD), et subvention de recherche no. 884/07 de la Fondation israélienne des sciences (ISF) à MG
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Marquage fluorescent Sondes | Metabion | 20 pb HPLC purifiée | Séquence conçue par le client |
| Bleu de toluidine | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Dodécylsulfate de sodium | Sigma-Aldrich | L3771 | Biologie moléculaire Qualité |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Biologie moléculaire |
| Qualité Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Biologie moléculaire |
| Acide acétique glacial | Sigma-Aldrich | 320099 | Bloqueur de liquide de qualité biologie moléculaire |
| Ted Pella Inc. | Référence 22309 |
Références
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Réimpressions et autorisations
