Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridations (FISH) pour la localisation des virus et des bactéries dans Endosymbiotic plantes et d&#39;insectes tissus

Résumé

Nous décrivons ici d'une simple hybridation fluorescente in situ (FISH) Méthode pour la localisation des virus et des bactéries dans les tissus d'insectes et de plantes. Ce protocole peut être étendu pour la visualisation de l'ARNm dans la montagne ensemble et coupes microscopiques.

Résumé

Hybridation in situ fluorescente (FISH) est un nom donné à une variété de techniques couramment utilisées pour la visualisation de la transcription de gènes dans des cellules eucaryotes et peuvent être en outre modifiées pour visualiser d'autres composants dans la cellule telles que l'infection par des virus et des bactéries. Localisation spatiale et la visualisation des virus et des bactéries au cours du processus d'infection est une étape essentielle qui vient compléter le profil d'expression des expériences comme les puces et RNAseq en réponse à différents stimuli. Comprendre les infections spatio-temporelles avec ces agents complète expériences biologiques visant à mieux comprendre leur interaction avec les composants cellulaires. Plusieurs techniques de visualisation des virus et des bactéries telles que les systèmes de gènes rapporteurs ou des méthodes immunohistochimiques sont longues, et certains sont limités à travailler avec des organismes modèles et sur les méthodologies complexes. FISH qui cible les espèces d'ARN ou d'ADN dans la cellule est un moi relativement facile et rapidethode pour étudier la localisation spatio-temporelle des gènes et à des fins diagnostiques. Cette méthode peut être robuste et relativement facile à mettre en œuvre lorsque les protocoles emploient court hybridation, les sondes commercialement achetés, qui ne sont pas chers. Ceci est particulièrement robuste lorsque la préparation des échantillons, la fixation, l'hybridation, et la visualisation microscopique ne comportent pas d'étapes complexes. Nous décrivons ici un protocole de localisation de bactéries et de virus dans les tissus d'insectes et de plantes. La méthode est basée sur une préparation simple, la fixation et l'hybridation des supports entiers insectes et les organes disséqués ou sections de plantes fabriqués à la main, avec 20 paires de bases des sondes d'ADN courts conjugués à des colorants fluorescents sur leur extrémité 5 'ou 3'. Ce protocole a été appliqué avec succès à un certain nombre de tissus d'insectes et de plantes, et peut être utilisée pour analyser l'expression des ARNm ou d'autres espèces d'ARN ou d'ADN dans la cellule.

Introduction

Lors de l'étude des interactions entre les virus de plantes et d'autres agents pathogènes avec leurs hôtes végétaux infectés, il est important de visualiser les agents pathogènes et leurs acides nucléiques respectifs in situ, indépendamment du fait qu'ils ont des effets négatifs sur leurs hôtes. Ceci est très important lorsque l'on étudie le mouvement de l'agent pathogène à l'intérieur et entre les cellules de la plante. En localisation in situ de produits du gène de l'agent pathogène est une étape essentielle qui s'ajoute à d'autres approches pour l'étude du processus de pathogénicité. De nombreux ag....

Protocole

Une. Préparatifs général aleurodes, des plantes, et Virus pour l'analyse FISH

1. B arrière et Q biotype aleurodes sur les plants de coton (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) et maintenir dans des cages insect-proof et chambres de croissance dans des conditions standard de 25 ± 2 ° C, 60% d'humidité relative, et une lumière de 14 h / 10 h photopériode sombre.
2. Faire la PCR pour tester l'infection par endosymbiontes en utilisant des amorces spécifiques endosymbiont comme décrit précédemment ^15-19.
3. Acheter des plants de tomate (Solanum esculentum cv. Beefsteak) à partir d'une pépinière commer....

Résultats

Le système étudié dans ce manuscrit est illustré à la figure 1 et comprend une plante infectée avec TYLCV, un adulte et d'une nymphe de l'aleurode B. tabaci, et l'anatomie interne de l'aleurode montrant le chemin pour TYLCV translocation dans l'insecte. Figure 2 montre deux poissons dans un aleurode adulte pour le symbiote primaire Portiera et le symbiote secondaire Arsenophonus. Figure 3 montre le double FISH pour Port.......

Discussion

Le protocole décrit ici pour la localisation d'un virus de plante dans son hôte de plante et l'insecte vecteur, et les bactéries symbiotiques dans leur hôte de la mouche blanche spécifique, peut être adapté pour la localisation d'autres virus dans les plantes et, même dans les tissus animaux. En outre, le protocole peut être utilisé pour localiser les bactéries symbiotiques et pathogènes et d'autres microorganismes dans les systèmes de plantes et d'animaux. Les méthodes décrites reposent sur le conce.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Marquage fluorescent Sondes	Metabion	20 pb HPLC purifiée	Séquence conçue par le client
Bleu de toluidine	Sigma-Aldrich	89640
Dodécylsulfate de sodium	Sigma-Aldrich	L3771	Biologie moléculaire Qualité
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Biologie moléculaire
Qualité Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941	Biologie moléculaire
Acide acétique glacial	Sigma-Aldrich	320099	Bloqueur de liquide de qualité biologie moléculaire
	Ted Pella Inc.	Référence 22309