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Article de méthode

Cytologique Analyse de la spermatogenèse: Préparatifs en direct et fixes de

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DOI :

10.3791/51058

⸱

20 janvier 2014

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Méthodes pour isoler et préparer Drosophila testicules échantillons (vivre et fixe) pour l'imagerie par contraste de phase et microscopie de fluorescence sont décrits ici.

Résumé

Drosophila melanogaster est un système de modèle puissant qui a été largement utilisé pour élucider une variété de processus biologiques. Par exemple, des études à la fois la femme et lignées germinales mâles de Drosophila ont grandement contribué à la compréhension actuelle de la méiose ainsi que la biologie des cellules souches. Excellentes protocoles sont disponibles dans la littérature pour l'isolement et l'imagerie de ovaires et les testicules 12.03 Drosophila. Ici, les méthodes pour la dissection et la préparation des testicules chez la drosophile pour l'analyse microscopique sont décrits avec une vidéo de démonstration d'accompagnement. Un protocole pour isoler les testicules de l'abdomen des mâles adultes et préparer des lames de tissu vivant pour une analyse par microscopie à contraste de phase ainsi que d'un protocole pour la fixation et la coloration immunologique testicules pour l'analyse par microscopie de fluorescence sont représentés. Ces techniques peuvent être appliquées à la caractérisation de mutants de drosophile qui présentent defects de la spermatogenèse, ainsi que dans la visualisation des localisations intracellulaires de protéines.

Introduction

Testicules chez la drosophile sont un système modèle idéal pour l'étude de nombreux processus biologiques, y compris la régulation des cellules souches, la méiose, et le développement des spermatozoïdes 13-18. Les spermatocytes et leurs fuseaux méiotiques sont grandes et donc pratique pour l'analyse cytologique, et les points de contrôle du cycle cellulaire détendu pendant la spermatogenèse faciliter l'étude des mutations dans les gènes du cycle cellulaire. Différents types de cellules peuvent être observées dans la progression ordonnée le long de la longueur des testicules, et toute perturbation de la spermatogenèse peuvent conduire à des changements dans cet agencement global. Ces fonctionnalités, combinées à des outils génétiques chez la drosophile ont facilité l'analyse mutationnelle de la spermatogenèse 21-23.

Les étapes de la spermatogenèse chez la drosophile ont été bien définis. des cellules de la lignée germinale qui se développent de manière synchrone à l'intérieur des kystes progresser séquentiellement à travers les étapes de la spermatogenèse le long de la longueur du testicule. Pendant boe la mitose et la méiose divisions des cellules germinales mâles, la cytokinèse se produit de manière incomplète de telle sorte que les cellules filles restent reliés par des ponts cytoplasmiques dits canaux périphériques (Figure 1). L'extrémité apicale du testicule contient une population de cellules souches de lignée germinale qui donne lieu à des spermatogonies, qui subissent quatre divisions mitotiques avec la cytokinèse incomplète pour générer des kystes de 16 cellules de spermatocytes primaires. Après la phase S préméiotique, spermatocytes primaires entrent G2, une période de croissance prolongée de ~ 90 heures au cours de laquelle le volume cellulaire augmente ~ 25 fois. La progression à travers la méiose et de la méiose II I conduit à la formation de kystes de 32 cellules de spermatocytes secondaires et les kystes 64 cellulaires des spermatides haploïdes, respectivement. Les immatures, des spermatides rondes subissent un remodelage cellulaire pour former des spermatozoïdes matures. Cellules post-méiotiques, en particulier des faisceaux de s'allongeant et spermatides matures, occupent une grande partie du volume du testicule.

Til transports succès des spermatozoïdes fonctionnels à mouches femelles nécessite une coordination entre les différentes parties du système reproducteur masculin, qui est composé de plusieurs structures paires (les testicules, les vésicules séminales et des glandes accessoires) et un seul canal éjaculateur (Figure 2). Les spermatozoïdes sont produits dans les testicules et stockée dans les vésicules séminales jusqu'à l'accouplement 24. Les glandes accessoires contiennent des cellules sécrétoires qui produisent le liquide séminal. Le sperme migrer des vésicules séminales sont mélangés avec le liquide séminal dans le conduit éjaculatoire, qui est reliée à la fois les vésicules séminales et les glandes accessoires. Ce mélange de sperme et du liquide séminal est finalement pompé hors du mâle dans le vagin de la femelle voler à travers l'ampoule de la éjaculatoire situé à l'extrémité postérieure de l'abdomen mâle 25. Protéines dans le liquide séminal sont essentiels pour un stockage prolongé des spermatozoïdes dans les organes spécialisés appelés spermathèque de la répétitionvoies roductive de Drosophila femmes 26.

D'excellentes méthodes pour l'isolement de testicules de Drosophila et la visualisation de cellules à différents stades de la spermatogenèse sont disponibles dans la littérature scientifique 3-12. Nous ajoutons ici à cet ensemble de connaissances en présentant des exemples de ces protocoles avec une vidéo de démonstration d'accompagnement. Le protocole de préparation des échantillons de testicules vivants pour la microscopie à contraste de phase est basé sur un procédé 27 décrit précédemment. Le protocole pour la fixation de formaldehyde et immunomarquage des testicules est également basée sur un procédé 28 décrit précédemment. Les approches décrites ici ont été utilisées dans de nombreuses études de la spermatogenèse chez la drosophile (par exemple, pour évaluer le rôle de la dynéine, un moteur de microtubule-minus extrémité dirigée, pendant la spermatogenèse chez la drosophile).

En plus des protocoles de base, des suggestions sont prévus pour varying la dissection afin d'enrichir de spermatogonies, spermatocytes, ou des spermatozoïdes matures. Différentes méthodes de traitement des testicules tels que les kystes soit restent intacts ou sont perturbés au besoin sont décrits. Un avantage à utiliser des testicules de Drosophila en tant que système modèle est que, par rapport à des ovocytes et des embryons de Drosophila, des anticorps et des colorants peuvent facilement pénétrer dans les cellules après leur dispersion à partir des testicules, et moins d'étapes de lavage sont nécessaires, ainsi, les protocoles peuvent être effectuées en un temps relativement peu de temps.

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Protocole

Une. Dissection des testicules

  1. Anesthésier les mouches dans une bouteille ou flacon à l'aide d'un flux de CO 2 et de les transférer à un pad à la mouche.
  2. Trier les mouches sous un microscope à dissection à l'aide d'un petit pinceau, et collecter un nombre approprié (en fonction de l'expérience) des mâles de Drosophila des génotypes souhaités. Les jeunes mâles (0-2 jours) sont idéales pour examiner les cellules à travers les premières étapes de la spermatogenèse (par exemple de spermatogonies, spermatocytes et spermatides début d'après-méiotiques), tandis que les mâles un peu plus âgés (2-5 jours) sont idéales pour examiner les cellules dans les dernières étapes de la spermatogenèse (en particulier, la maturité des spermatozoïdes).
  3. Utilisez une pince pour enlever les ailes de chaque vol (pour empêcher les mouches de flotter dans le liquide lors de la dissection).
  4. Ajouter ~ 500 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3 mM de NaH 2 PO 4; PBS) dans une goutte d'une dissection plat revêtu de silicone surun fond noir. Autres solutions aqueuses ont été utilisés avec succès pour testicules dissection 3.
  5. Point de forceps vers la partie antérieure de la mouche, le saisir par le thorax, et la plonger dans la chute du PBS. Lors de la visualisation au microscope de dissection, utiliser une autre paire de pinces pour saisir et tirer des organes génitaux externes (structure brun foncé situé à l'extrémité postérieure de l'abdomen ventral) en arrière jusqu'à ce qu'il se détache de l'abdomen. Dans la plupart des cas, les testicules, les vésicules séminales, et la glande accessoire seront retirés de l'abdomen avec les organes génitaux externes, sinon, insérer une seule paire de pince dans l'abdomen et démêler les testicules.
  6. Séparez les testicules glande accessoire et organes génitaux externes en utilisant deux paires de pinces dans les menus déroulants PBS (figure 2). Testicules de type sauvage sont faciles à distinguer des tissus blancs voisins par leur couleur jaune. Procéder immédiatement à l'étape 2.
  7. Pour isoler les testicules des mâles de pharate (i.. E enfermé dans la coque de nymphose), une étape supplémentaire doit être effectué d'abord qui consiste à retirer la volée de la coque de nymphose; cette étape a déjà été décrit ailleurs 31. Procéder à la dissection que pour les testicules adultes commençant à l'étape 1.2.
  8. Pour isoler les testicules des mâles larvaires, effectuer une modification d'un protocole pour isoler ovaires larves de Drosophila 32. Brièvement, les larves mâle peut être distingué de larves femelle par la présence d'une paire de grandes structures, ovales clairs (testicules larvaires) noyées dans le tiers postérieur du corps de la graisse. Pour isoler les testicules larvaires, écorcher partiellement ouvrir la larve mâle d'isoler les testicules et la graisse du corps entourant de l'abdomen comme décrit pour l'isolement des ovaires larvaires. Procéder immédiatement à l'étape 2 du protocole décrit ci-après, les testicules peuvent ensuite être retirés du corps de graisse juste avant le montage (étapes 2.3 ou 3.14) comme décrit pour les 32 ovaires.

2. Préparation de l'échantillon et de l'imagerie en direct

  1. Utilisez une paire de pinces pour placer doucement 2-3 paires de testicules dans une goutte de 4-5 ml de PBS sur une place couvercle en verre glissement. Notez que le rapport du nombre des testicules au volume PBS peut être nécessaire d'ajuster: trop de liquide empêche les cellules de se propager correctement lorsque écrasé, alors que trop peu de liquide entraînera éclater leurs cellules quand écrasé. Facultatif: Utilisez le couvercle silicone glisse à minimiser l'adhérence de tissu pour couvrir glissement dans l'étape 3.2.
  2. Utilisez une paire de pinces à déchirer chaque testicule à une position appropriée de façon à maximiser la présence des types de cellules de la lignée germinale souhaités dans la préparation (à noter que le contenu du testicule sera la plupart du temps de sortie de la région déchirée sur la lame pendant l'écrasement étape.) pour enrichir les spermatogonies et spermatocytes, déchirer le testicule adjacent à son extrémité apicale (niveau 1, figure 2B). Pour enrichir les spermatocytes et spermatides, déchirer les testicules à une position légèrement base au niveau 1 (niveau 2, figure 2B). Pour enrichir les cellules de la lignée germinale plus matures, déchirer les testicules plus près de l'endroit où la courbure commence (niveau 3, figure 2B).
  3. Placez délicatement une lame de microscope en verre sur la lamelle à écraser les testicules, ne pas appliquer de pression manuellement le poids de la lamelle seul est suffisant pour obtenir un échantillon bien écrasé. Essayez d'éviter les bulles d'air. Facultatif: enduit utilisation poly-L-lysine lames de microscope pour promouvoir l'adhésion du tissu à glisser dans l'étape 3.2.
  4. Utiliser la préparation immédiatement (de préférence dans les 15 minutes suivant la préparation) pour observer les cellules vivantes par microscopie à contraste de phase, par des mouches transgéniques avec expression des protéines marquées par fluorescence dans les testicules, les cellules vivantes peuvent être examinés par microscopie de fluorescence à cette étape. Sinon, procéder à la fixation et coloration d'anticorps (protocole 3).
  5. Mèche doucement tout excès de liquide sous la lamelle en utilisant un nettoyage wipe pour permettre l'aplatissement de la préparation jusqu'à ce que les cellules germinales sont nettement au point.

3. Formaldéhyde fixation et coloration des anticorps

  1. Aligner geler chaque diapositive contenant les testicules écrasés (du protocole n ° 2) en utilisant une paire de pinces métalliques à plonger brièvement dans de l'azote liquide (azote liquide jusqu'à ce que le bouillonnement cesse).
  2. Retirer la lamelle immédiatement d'utiliser une lame de rasoir.
  3. Utilisez des pinces métalliques pour transférer des diapositives dans une grille coulissante en verre préalablement refroidi rempli de glace-froid à 95% d'éthanol (grade spectrophotométrie, sans méthanol). Conserver à -20 ° C pendant 10 min.
  4. Utiliser des pinces en métal de transférer les lames d'un porte-lame de verre rempli de formaldehyde à 4% dans du PBS plus 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Stocker à température ambiante pendant 7 min.
  5. Utilisez des pinces métalliques pour transférer des diapositives dans une grille coulissante en verre rempli de PBS. Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Répétez 1x. Effectuer tous les lavages en rejetant la solution dans la grille coulissante en verre ( Dire. en le versant sur) et les remplacer par une solution fraîche.
  6. Rejeter le PBS et plongez-lames dans du PBS-T pendant 30 min à température ambiante pour perméabiliser les membranes cellulaires.
  7. Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Répétez 2x.
  8. L'étape (optionnelle) de blocage: Immerger les lames dans du PBS + 1% de BSA pendant 45 minutes à température ambiante.
  9. Utilisez un stylo de barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur la lame autour du tissu écrasé (facilement visible à l'oeil nu), afin de limiter les solutions d'anticorps (ajoutés dans les étapes 3.9 et 3.11). Le tissu doit être maintenue humide en tout temps pendant l'exécution immunologique.
  10. Ajouter 30 à 40 ml d'anticorps primaire (dilué dans du PBS-T, 1:400 à 01:50, en fonction de l'anticorps) de tissu à l'intérieur du cercle. Si le blocage a été effectué, diluer l'anticorps primaire dans du PBS-T plus 1% de BSA. L'anticorps anti-gamma-tubuline (pour la coloration des centrosomes dans la figure 4) a été dilué 1:100. Incuber dans un sol humide, chambre noire (boîte en plastique par exemple. Ferméavec des serviettes humides de papier) pendant 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
  11. Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à manger 3x de température. Si le blocage a été effectué, laver deux fois dans du PBS-T et une fois dans du PBS (5 min à température ambiante chacun).
  12. Ajouter 30 à 40 ml d'un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (dilué à 1:400 dans du PBS) pour le tissu et incuber dans l'obscurité pendant 1-2 h à température ambiante.
  13. Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Répétez 2x.
  14. Ajouter 30 à 40 ml de solution de DAPI (0,2 mg / ml dans du PBS) pour le tissu à l'intérieur du cercle.
  15. Placez délicatement une lamelle de verre sur le tissu, en prenant soin d'éviter la formation de bulles. Si des bulles d'air doivent apparaître, déplacer soigneusement autour de la lamelle sans détruire la courge jusqu'à ce que les bulles s'échapper par les côtés de la lamelle.
  16. Utilisez un chiffon de nettoyage pour effacer l'excès de DAPI des bords de la diapositive.
  17. Sceller la lamelle sur la lame à l'aide de vernis à ongles transparent.
  18. Utilisez cette préparationdans le 3-4 heures suivantes pour afficher les cellules immunocolorées par microscopie à fluorescence. Pour le stockage à long terme de diapositives (au moins jusqu'à plusieurs semaines), utiliser un support de montage disque à base de glycérol avec DAPI, et conserver les lames à -20 ˚ C.
  19. En variante, fixer les échantillons dans du methanol à la place du formaldehyde (en fonction de l'antigène). Après avoir terminé l'ensemble du protocole à l'étape 3.2, plongez les lames de testicules écrasées dans du méthanol pendant 10 min à -20 ° C et passez à l'étape 3.5 en avant.

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Résultats

Un exemple d'une paire convenablement disséqué des organes reproducteurs mâles de Drosophila est représenté sur la figure 2A. Testicules retirés de l'abdomen de la mouche mâle adulte sont généralement attachés à la conduite de l'éjaculation (brun, figure 2A ') et une paire de glandes accessoires (vert, figure 2A') via une paire de vésicules séminales (bleu, figure 2A ') . Pour séparer les testicules de la majeure partie ...

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Discussion

Bien que les testicules des mouches de type sauvage peuvent être facilement identifiés en raison de leur couleur jaune (en revanche, les tissus blancs des voisins), les testicules des mouches mutantes blancs sont blancs et donc peuvent parfois être confondus avec l'intestin. La plupart des souches transgéniques, qui sont généralement dans un fond blanc, ont également testicules blancs parce que le gène de mini-blanc trouvé dans les P-éléments ne favorise pas l'accumulation de ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Michael Anderson pour établir dans le laboratoire Lee ces méthodes reconnues pour l'étude de la spermatogenèse des conseils d'experts de Karen Hales. H. Oda et Y. Akiyama-Oda généreusement fourni le γ-tubuline-GFP mouche stock. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH R01 à LAL (GM074044).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
SylgardWorld Precision InstrumentsSYLG184Élastomère de silicone en deux parties pour la fabrication d’une boîte de dissection recouverte de silicone à partir d’une boîte de Pétri Kimax
stylo PAP FisherScientificNC9888126Ted Pella #22309
Protecteur d’ongles transparentWet n Wild7780235001
ProLong Gold Antifade Réactif avec DAPILife TechnologiesP36931
Anticorps anti-gamma-tubuline de souris (clone GTU-88)Sigma-AldrichT6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  ;Jackson ImmunoResearch115-165-003
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
ÉthanolFisher ScientificAC61511-0040
MéthanolFisher ScientificA412-4
16 % FormaldéhydeThermo Fisher Scientific28908
SigmacoteSigma-AldrichSL2Utiliser selon les instructions du fabricant pour siliconer les lamelles
DAPISigma-AldrichD-95420,5 mg/ml dans de l’éthanol à 75 % ; conserver à -20 ° ; C
NaClResearch Products International Corp.S23020
Na2HPO4Sigma-AldrichS9763
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
Essuie-glaces Kimwipes FisherScientificS47299
BSAResearch Products International Corp.A30075Qualité biologie moléculaire
Verre Coplin pot de coloration, bouchon à visMicroscopie électronique Sciences70315
Lames de microscope simples dépoliesCorning2948-75X25
Lames de microscope revêtues de poly-L-lysinePolysciences, Inc.22247-1En option (pour remplacer les lames de microscope non traitées)
Verre de couverture carréCorning2865-22
Lames de rasoirFisher Scientific12-640
Boîte de Pétri KimaxFisher ScientificS31473Kimble #23060 10015 Pince EMD
Dumont52100-51SMotif 5 Stéréoscope
INOX Stemi 2000-CSCarl Zeiss
Eclipse 80iObjectif Nikon
Plan-Fluor 40XNikon
AxiophotCarl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X ObjectifCarl Zeiss
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Références

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