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Article de méthode

Intramyocardique cellulaire livraison: Observations aux coeurs murins

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DOI :

10.3791/51064

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24 janvier 2014

 ,  ,  , 
1Magdi Yacoub Institute, Imperial College London, 2National Heart and Lung Institute, Imperial College London, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Dans cet article

Résumé

Fourniture de cellules intra-myocardique dans des modèles murins de maladies cardio-vasculaires telles que l'hypertension ou de l'infarctus du myocarde, est largement utilisé pour évaluer le potentiel thérapeutique de différents types de cellules dans les études de régénération. Par conséquent, une description détaillée et une visualisation claire de cette intervention chirurgicale aideront à définir les limites et les avantages des analyses thérapeutiques de cellules cardiovasculaires chez les petits rongeurs.

Résumé

Des études antérieures ont montré que la capacité des cellules favorise l'amélioration de la fonction cardiaque par la libération de cytokines et de facteurs qui augmentent la revascularisation du tissu cardiaque et la survie cellulaire. En outre, des observations ont révélé que les cellules souches spécifiques, tels que les cellules souches cardiaques, les cellules souches mésenchymateuses et cardiospheres ont la capacité d'intégrer au sein du myocarde environnant en se différencier en cardiomyocytes, les cellules musculaires lisses et les cellules endotheliales.

Ici, nous présentons les matériaux et les méthodes susceptibles de fournir de manière fiable les cellules non contractiles dans la paroi ventriculaire gauche de la souris immunodéplétion. Les étapes marquantes de cette procédure microchirurgicale impliquent l'anesthésie et l'injection de l'analgésie, intratrachéale intubation, incision pour ouvrir le coffre et exposer le coeur et la livraison des cellules par une aiguille stérile de calibre 30 et une seringue de précision microlitre.

Le traitement des tissus comprenant de coeur récolte, embedding, de sectionnement et coloration histologique a montré que l'injection intra-myocardique de cellules produit une petite dommages dans la zone épicardique, ainsi que dans la paroi ventriculaire. Les cellules non contractiles ont été retenues dans la paroi du myocarde de souris immunodéprimées et sont entourés par une couche de tissu fibreux, de nature à l'abri de la pression cardiaque et de la charge mécanique.

Introduction

Divers protocoles de transport cellulaire ont été testés dans des modèles murins de rat et de maladies cardio-vasculaires, dans le but de traduire l'efficacité, l'efficacité et l'innocuité de cette procédure expérimentale chez des patients humains. Dans les petits coeurs de rongeurs, la livraison de cellules intramyocardique est la méthode la plus réaliste de la prestation de cellule 1,2, alors que dans le antérograde de coeur de rat 3 et rétrograde injection de cellules de 4 intracoronaire peut également être utilisé. Les deux méthodes ont des limites et avantages. livraison cellulaire par voie intracoronaire présente des avantages théoriques sur l'injection intramusculaire directe dans la promotion de la diffusion de la cellule mondiale 3, mais il a aussi le risque de provoquer une embolie coronarienne 3,5. Limitations de livraison intramyocardique sont associées à une lésion mécanique, une inflammation aiguë et des lésions myocardiques 6,7. Chez les humains, les cellules pour la réparation cardiaque sont administrés par injection intra-myocardique par un épicardique endocavitaire ou chirurgicalapprocher ou par intracoronaire artère 8. Injection par voie transvasculaire est adapté chez les patients présentant un infarctus aigu du myocarde et reperfusé, mais peut-être pas possible dans le cas d'occlusions totales ou mauvaise circulation dans les vaisseaux du territoire effectuée 9. L'injection directe dans la paroi ventriculaire par injection transendocardique ou transépicardique est techniquement réalisable en fonction de l'état de santé du patient. En effet, il a été montré que cette technique est sûre 10,11, bien que pour l'injection transépicardique une chirurgie à thorax ouvert est nécessaire pour transendocardique et se rapproche d'une cartographie électrophysiologique pour chaque patient est nécessaire pour différencier les sites de myocarde ischémique ou portant des cicatrices viable 9.

Fait important, dans les études de thérapie cellulaire du choix de la meilleure cellule pour être transplanté est encore à l'étude. Analyses à court terme (4 semaines) ont montré que l'injection de cellules souches cardiaques définies comme cardiospheres 12 cellules ou de la population des côtés de la moelle osseuse induite par 13 la récupération fonctionnelle cardiaque chez le rat et la souris 14 15 modèles de l'infarctus du myocarde en réduisant la taille de la cicatrice et la mort cellulaire. L'allogreffe de cardiospheres dans un modèle de l'infarctus du myocarde de rat sans immunosuppression a été trouvé pour être sûr, promu la régénération cardiaque et améliore la fonction cardiaque par stimulation des mécanismes de réparation endogènes 15. Lin-/c-kit + adultes de cellules souches dans le coeur ont été montrés pour être auto-renouvellement, clonogenic, et multipotentes in vitro et in vivo, et lorsqu'il est injecté dans un coeur de rat ischémique reconstitué une grande partie de la paroi du myocarde blessé 16 et eu l' capacité à former des artères coronaires 17 conductrice et de taille intermédiaire. Ces données prometteuses ont alimenté la phase I et II des essais cliniques chez l'homme: l'injection de cellules souches mésenchymateuses autologues et allogéniques (MSC) 18, 19 cardiospheres, ou de cellules souches cardiaques positifs c-Kit (SCC) 20 dans les cœurs ischémiques chaque montré des effets bénéfiques de la fonction cardiaque dans les études à long terme. Néanmoins, vaste à long terme de suivi et de méta-analyse rétrospective ont montré que la thérapie de cellules souches apporte un bénéfice important à certains patients, mais pas dans d'autres avec une série de résultats imprévisibles 21. Il est possible que ces limitations nécessiteront la conception de protocoles spécifiques de délivrance de cellule pour chaque individu et de chaque maladie.

Dans des modèles de souris et de rat, des études à long terme ont montré que l'injection de cellules n'a pas d'améliorer encore la fonction cardiaque (12 mois). En effet, les greffes de cardiomyocytes souches embryonnaires humaines dérivées de cellules (CSEh-CM) ont été largement isolés du myocarde hôte par une couche de tissu fibreux 22,23. Des résultats similaires ont été observés après transplantation de myoblastes squelettiques intramyocardique dans le cœur de souris ayant subi un infarctus 24. Furthermore, la capacité à long terme de cellules souches mésenchymateuses allogènes pour préserver la fonction cardiaque en l'infarctus a été limité par la transition d'un état ​​à un immunoprivilégiés immunogène après différenciation 25.

Prenant en considération les défis et les perspectives énoncées ci-dessus, nous montrons ici comment offrir cellules par injection intra-myocardique chez la souris. Nous observons que les cellules sans propriétés contractiles des cardiomyocytes ne sont pas connectés avec le myocarde hôte et forment une masse homogène avec une barrière fibreuse mince. Bien que dans certains cas, ce résultat peut être avantageux, l'analyse qui suit peut être utile de comprendre comment la prise de greffe de cellules peut être modulée pour générer des structures du myocarde fonctionnellement connectés ainsi.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les organisations internationales (la directive 2010/63/UE du Parlement européen) et national (Home Office britannique, loi de 1986) des règlements. Les procédures décrites ici font partie de notre plan de travail en vertu des autorisations de licence au Royaume-Uni et n'ont pas été entrepris dans le but de l'enregistrement.

Une. Préparation des cellules

Ce protocole décrit la préparation d'une lignée cellulaire spécifique (rein embryonnaire humain, des cellules HEK293) à des fins de démonstration. Protocoles spécifiques aux cellules doivent être utilisées pour la culture et, éventuellement, la différenciation des cellules souches pluripotentes ou adultes dans des lignées cellulaires spécifiques.

  1. Cultiver les cellules dans du milieu DMEM (taux élevé de glucose, 4500 mg / L) contenant du pyruvate de 1% de sodium, 2 mM de glutamine, 1% d'antibiotique Pen / Strep et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Une plaque de 10 cm doit être normalement divisée à 01h03 et médias complétée frais tous les deux jours.
  2. Traiter les cellules légèrement avec trypsen 1x et remettre en suspension dans du milieu DMEM décrit dans 1:1.
  3. Compter les cellules dans un hémocytomètre et la chambre de collecte de 3 x 10 6 cellules dans un tube séparé.
  4. Centrifuger dans un seau rotor oscillant à 100 g pendant 5 min.
  5. Jeter le surnageant et laver le culot de cellules avec un tampon de phosphate stérile 2x.
  6. Remettre en suspension dans du PBS 1x à une concentration de 10 6/50 pi pour l'injection dans le ventricule gauche de souris immunodéplétion.

2. Conditions préchirurgicales

  1. Maintenir souris immunodéplétion (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) avec des granulés stériles alimentaires et de l'eau dans un isolateur à température contrôlée (22 ° C; tableau 1) avant chaque intervention.
  2. Effectuer la chirurgie de souris immunodéplétion sous une hotte à flux laminaire. Nettoyer la zone de travail avec 70% d'éthanol et l'autoclave outils chirurgicaux (pinces et ciseaux).
  3. Mettez coussins chauffants pour la chirurgie et pour la reprise. Les coussins chauffants sont importantspour bloquer la diminution de la température du corps se produisant pendant et après la chirurgie.
  4. Placez une cage propre et stérilisé sur le pavé de récupération de chauffage.
  5. Transporter les souris dans leur cage d'origine à partir de l'isolateur de la salle d'opération à l'autoclave dans un sac stérile.
  6. Peser la souris et en fonction du poids corporel injection sous-cutanée (sc) une solution contenant la médétomidine et de chlorhydrate de kétamine dilué dans 0,9% de solution saline stérile pour anesthésier les souris, ainsi que pour relaxer la musculature (médétomidine 1 mg / kg; chlorhydrate de kétamine 75 mg / kg).
  7. Débranchez la souris de la cage lorsqu'il est complètement anesthésié (dans 1-2 min, pas de pincement pincée réflexe après stimulation)
  8. Appliquer les cheveux crème dépilatoire sur le côté gauche de la poitrine et de la région de la gorge. Après un laps de temps approprié (environ 2-5 min), essuyer les poils à un tissu mouillé d'eau.
  9. Placer la souris sur le panneau de chirurgie dans une position couchée sur le dos. À partir dele point de vue du chirurgien la position verticale, la queue basse-tête.
  10. Injecter la solution analgésique à 0,1-0,2 ng / g dilué dans une solution saline stérile (buprénorphine) dans le membre postérieur voie sous-cutanée et couvrir la zone rasée avec l'iode solution de povidone aseptique en utilisant un applicateur coton-tige.
  11. Focaliser le microscope (objectif 2.5X) sur la zone de la gorge.

3. Conditions chirurgicales

  1. Avec des ciseaux émoussés faire une incision de la peau ventrale médiane d'environ 0,5-1 cm de longueur légèrement en dessous du cartilage cricoïde. Séparer la peau des tissus conjonctifs de visualiser les glandes salivaires.
  2. Divisez les glandes salivaires sur leur division médiane naturel en tirant simultanément chaque partie latéral avec pince et magnétique poitrine enrouleur et exposer la trachée.
  3. Tirez la languette doucement sur le côté pour exposer le larynx. Faites glisser le tube d'intubation avec précaution dans la trachée. La pointe du tube est visible à travers la l affichéearynx et de la trachée. Il est important, si le tube est dans, mais pas clairement visible, il est dans l'œsophage. Retirez-le et changer la position de la pointe du tube.
  4. Connectez le tuyau à la machine de ventilation. Réglez le volume de la course à 200 pi et 150 AVC / min. Fixer le tube de ventilation sur le panneau de la chirurgie avec une bande.
  5. Avec des ciseaux et des pinces émoussés, faire une queue verticale à la tête de 1 - 1,5 cm de long incision de la peau sur la zone du thorax gauche.
  6. Desserrez la peau des couches de tissu / musculaires conjonctifs et les majeurs et mineurs muscles pectoraux sans incisions.
  7. Effectuer une thoracotomie entre les troisième et quatrième nervures comme suit:
    1. Perforer la couche musculaire intercostal par pincement et le grattage avec de petites pinces arrondis.
    2. Une fois que la couche musculaire intercostal est perforé, placer l'enrouleur de la poitrine d'ouvrir au maximum la cavité thoracique. Les parties supérieures et moyennes du ventricule gauche (VG) avec son pavillon de recouvrement (atrium) sontmaintenant visible.
  8. Préparer une seringue de précision avec des cellules. La seringue doit être en mesure de livrer une quantité de volume de 10 ul pour chaque injection. Jetez un aiguille 30 G à l'extrémité de la seringue.
  9. Fixer avec du ruban adhésif, une petite canule en plastique (à partir d'un Introcan-W 20 G) sur l'aiguille, laissant exposés seulement 1 mm dont l'extrémité ouverte de l'aiguille. Cela permettra d'éviter que l'aiguille de perforation de la paroi ventriculaire gauche et la totalité de l'injection des cellules dans la cavité du ventricule gauche.
  10. Avec l'aide d'un objectif 5X, de visualiser à ce grossissement du ventricule gauche et d'injecter les cellules dans la paroi ventriculaire gauche dans 5 endroits différents (chaque injection livrera 10 ul pour un total de 106 cellules injectées). Si l'injection est réussie, une zone blanche et l'absence de grand lavage des cellules seront visibles (si l'injection n'a pas réussi, l'animal serait exclu de l'analyse fonctionnelle).
  11. Retirez l'enrouleur. Fermez la paroi thoracique by joignant les deux nervures séparées avec deux points de suture de soie 6-0.
  12. Hydrater les muscles pectoraux et la peau avec un coton-tige trempé dans du PBS 1x et posez-les délicatement les muscles du dos dans la position initiale avec la pince.
  13. Fermer la peau avec 3-4 points de suture de soie 6-0. Suturer l'incision de la gorge avec 2-3 points de suture pour refermer la peau.
  14. Injecter atipamezole (1 mg / kg la concentration finale) pour revenir aux effets anesthésiants.
  15. Dès que la souris commence à respirer de manière autonome, prendre le tube de la trachée et de mettre la souris sur le côté droit. On prévoit que la souris pour récupérer en quelques minutes.
  16. Lorsque la souris se met à tourner et marcher, le placer dans la cage de récupération à chaud (petite cage IVC avec haut filtrée fermée) pendant une heure.
  17. Laissez les animaux la nuit dans une boîte chauffée contrôlée (37 ° C).
  18. Remplir un plat avec de l'eau et de la nourriture à granulés pour soutenir la reprise au cours des 2 premiers jours après la chirurgie.

4. Post-chirurgie analyses

Dix coeurs injectées avec des cellules et 10 coeurs contrôle pas injectés sont analysés histologiquement comme suit:

  1. Effectuer l'analyse des cellules greffées 1 semaine après l'injection (figures 1 et 3).
    1. Après euthanasie par une surdose d'isoflurane, perfuser les coeurs avec 20 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) pour fixer le tissu. Déshydrater le tissu fixé en pourcentage croissant de l'éthanol (à partir de 70-100%) et de l'intégrer dans des blocs de paraffine.
    2. Section des coeurs dans la paraffine avec un microtome à 5 um et tache avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour l'analyse morphologique.
    3. Visualisez le tissu conjonctif à l'aide de colorant Trichrome de Masson.
    4. Analyser les images sous un microscope scanner de diapositives (figures 1A, 2A, 3A, 3B et 3C) et de visualiser l'ensemble du coeur en vue courte de l'axe à l'aide d'un microscope scanner de diapositives numériques (Figures 1B et 1C).
  2. Après les analyses ci-dessus, Déparaffiner les tissus cardiaques dans le xylène, réhydrater en immergeant les échantillons dans la diminution des pourcentages de l'éthanol (à partir de 100% d'eau) et le procédé de microscopie électronique à balayage (MEB) de la manière suivante:
    1. Incuber blocs déparaffinées avec de l'acide tannique à 1% dans 0,1 M de tampon phosphate pendant 1 h.
    2. Déshydrater les échantillons dans des pourcentages croissants d'éthanol (25-100%).
    3. Les échantillons secs avec HMDS (hexaméthyldisilazane).
    4. Montez les spécimens sur Stubbs avec Acheson Argent Dag et les enduire avec de l'or et de palladium.
    5. Voir les échantillons dans un microscope électronique à balayage analytique (Figure 2B).

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Résultats

Nous avons injecté des cellules HEK293, qui sont distinguables des cellules cardiaques par leur morphologie différente (figure 1), avec une forme de pavé par rapport aux cardiomyocytes allongés (Figure 1A). Cellules HEK293 ont été plus réactif à l'hématoxyline colorant (de couleur bleue) par rapport à des cardiomyocytes (de couleur rose), probablement en raison de leur contenu nucléaire augmenté (figure 1A). Pour distinguer en outre les cellules injectées à partir d...

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Discussion

Dans ce manuscrit, nous avons montré comment effectuer l'injection intra-myocardique de cellules dans les coeurs de souris. Comme preuve de cette méthode, nous avons utilisé des cellules HEK293. Il est important de souligner que les cellules HEK293 sont pas utilisés dans une étude de thérapie cellulaire et donc les conclusions de ce manuscrit ne sont pas appropriés pour la traduction directe d'une approche thérapeutique. Cependant, le fait que les cellules HEK293 sont des cellules contractiles pas et ne transdif...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions le Yacoub Institut Magdi (IPR) pour appuyer les analyses de microscopie et les projets impliquant la réparation cardiaque, les techniciens et le directeur de notre animalerie. Ce travail a été soutenu par la British Heart Foundation (BHF), subvention de projet PG/10/019. MPS est soutenu par le IPR et BHF. TP est un Fellow excellence BHF-recherche. NR est un NH & MRC Australie Fellow.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IsolateurSystèmes PfiDevis nécessaire
Coussin chauffantVet Tech SolutionsHE006Pour les petits animaux
MédétomidineServiceUne prescription vétérinaire est nécessaire
Chlorhydrate de kétamineServiceUne prescription vétérinaire est nécessaire
AtipamézoleService vétérinaire nationalUne prescription vétérinaire est nécessaire
Microscope électronique à balayageJeolJSM-6610
Ciseaux émoussésFST14084-09
MiniventHarvard Apparatus73-0043Avec petit adaptateur en Y (73-0027) et canule d’intubation (73-2844)
PinceFST11052-10
Système de rétractionFST18200-20Kit pour animaux jusqu’à 200 g
30 G 12 mm ; ½ ; inchBBraunA210Seringue Microliter fine jaune
ESSLAB81201Comprend également un distributeur répétitif Hamilton PB 600-1 Numéro de catalogue 83700
6-0 Suture en soieEthiconW1614T
vétérinaire national vétérinaire national Crème dépilatoire magasins commerciaux Buprénorphine NVS Une prescription vétérinaire est nécessaire Microscope Leica MZFLIII Leica Modèle S6E Avec support à bras oscillant TS0 Hamamatsu Nanozoomer Scanner de lames numérique Hamamatsu RS series

Références

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