Séparation automatique des C. elegans Façon variable colonisé par une bactérie pathogène

Résumé

Le wormsorter facilite écrans génétiques dans Caenorhabditis elegans par tri vers selon l'expression de journalistes fluorescentes. Ici, nous décrivons un nouvel usage: le tri selon la colonisation par un agent pathogène exprimant la GFP, et nous l'employons pour examiner le rôle mal compris de la reconnaissance de l'agent pathogène dans l'initiation des réponses immunitaires.

Résumé

Le wormsorter est un instrument analogue à une machine FACS qui est utilisé dans les études de Caenorhabditis elegans, typiquement pour trier vers basés sur l'expression d'un rapporteur fluorescent. Ici, nous mettons en évidence une utilisation alternative de cet instrument, pour trier vers en fonction de leur degré de colonisation par un agent pathogène exprimant la GFP. Cette nouvelle utilisation nous a permis d'aborder la relation entre la colonisation de l'intestin du ver et de l'induction de réponses immunitaires. Alors que C. réponses immunitaires elegans à différents agents pathogènes ont été documentés, il est encore inconnue ce qui les déclenche. Les deux possibilités (qui ne sont pas mutuellement exclusives) sont la reconnaissance de motifs moléculaires associés à des pathogènes et la détection des dommages causés par une infection. Pour différencier entre les deux possibilités, l'exposition à l'agent pathogène doit être dissociée de la dommages qu'il cause. La séparation de wormsorter permis de vers qui ont été largement colonisée par le Gram-npathogène egative Pseudomonas aeruginosa, avec les dommages susceptibles provoquée par la charge pathogène, des vers qui ont été exposées de façon similaire, mais pas, ou peu, colonisé. Ces populations distinctes ont été utilisés pour évaluer la relation entre la charge de l'agent pathogène et l'induction de réponses immunitaires de transcription. Les résultats suggèrent que les deux sont dissociées, confirmant la possibilité de reconnaissance de l'agent pathogène.

Introduction

Tri à vis sans fin automatique est un peu comme FACS, fonctionnant en mesurant un signal fluorescent dans une vis sans fin (typiquement fournie par l'expression transgénique de protéines rapporteurs) lors de son passage redressé dans un tube, ce qui permet la redirection soit à un tube de collecte / puits ou à un conteneur de déchets selon l' à gating paramètres fixés par le chercheur ^1. Le wormsorter peut faciliter la recherche de plusieurs façons, un exemple de l'employer comme outil d'analyse est une étude qui a suivi les modèles spatio-temporelles de l'activité du promoteur pour près de 1000 gènes ^2.
Cependant, l'utilisation principale de la wormsorter est dans cribles génétiques, à la suite des niveaux ou des gènes localisation de la protéine fluorescente selon l'axe de la vis sans fin ^3-5 expression cibles.

Ici, nous décrivons une nouvelle application pour la wormsorter, en suite à la colonisation de la vis sans fin par un agent pathogène fluorescence marqués. Avec comme un outil nous nous sommes concentrés sur la relation entre pathogfr colonisation / charge et la réponse immunitaire, à acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes responsables de l'initiation de la réponse immunitaire dans le ver.

Dans pratiquement tous les organismes étudiés à ce jour, l'initiation des réponses immunitaires innées à des agents pathogènes microbiens dépend de la reconnaissance de motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP), et / ou motifs moléculaires danger / dommages-associé (Damps) ^6,7. Les structures microbiennes premiers sont conservés qui comprennent les éléments de la paroi cellulaire microbienne, son flagelle, ou son bicouche lipidique ^6; la seconde, comprennent deux molécules libérées (par exemple ATP ^8), protéines modifiées ou d'autres marqueurs de processus cellulaires modifiés ^9,10. Les deux types de signaux sont reconnus par des protéines désignées comme des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR), qui, lors de la liaison spécifique d'une molécule modèle activer une chaîne d'événements conduisant à une réponse protectrice. C. elegans a été extrêmement utile comme Tractable modèle de disséquer les différents aspects des interactions hôte-pathogène, mais une chose qui n'est pas bien compris comment les réponses immunitaires sont initiées dans le ver. Aucun des récepteurs putatifs qui sont orthologues de reconnaissance de formes récepteurs (PRR) dans d'autres organismes ont été montré pour lier PAMP, et la plupart des orthologues de PRR qui sont essentielles pour les réponses immunitaires dans d'autres organismes montrent une contribution étonnamment limité de réponses ver pathogènes et la résistance. Par exemple, le récepteur de type Toll de Drosophila, ce qui est essentiel pour la résistance à des agents pathogènes Gram positifs, est représenté en C. elegans par un seul homologue, tol-1, ce qui contribue à la protection contre l'agent pathogène à Gram négatif Salmonella Typhimurium ^11, mais pas par les autres agents pathogènes testés positifs ou Gram-négatifs, ^11,12. Ces observations, combinées avec des données indiquant que les réponses immunitaires pourrait être induite par perturber protéine cellulaire traduction hque conduit certains à suggérer que C. elegans détecte principalement Damps ^9,13,14. Néanmoins, les rapports décrivant la capacité des agents pathogènes morts à induire des réponses immunitaires suggérer que la liaison PAMP peut avoir un rôle important dans la reconnaissance de l'agent pathogène dans C. elegans ^15,16. Des travaux antérieurs mettant l'accent sur ​​les réponses immunitaires de l'âge synchronisée génétiquement identiques C. elegans populations, ont montré une grande variabilité individuelle dans la colonisation intestinale par le Gram négatif bactérienne pathogène Pseudomonas aeruginosa.

Cependant, des études de profilage transcriptionnel traités ces populations variable colonisés comme une seule entité ^17,18. Profitant de cette variabilité, nous avons élaboré un protocole en se concentrant un wormsorter automatisé pour séparer les populations colonisées différentielle de Caenorhabditis elegans exposés à la GFP exprimant P. aeruginosa. Examen expression des gènes dans les populations différemment colonisés Faciévaluation litated de la relation entre la charge de pathogènes (et les dommages associés) et les réponses immunitaires et fourni de nouvelles informations sur la reconnaissance des agents pathogènes dans C. elegans ^19. Ci-dessous nous décrivons le protocole, qui pourrait être appliquée pour trier vers infectées par l'agent pathogène tout marqué par fluorescence.

Pour les utilisateurs potentiels, il convient de noter que le nombre de vers qui doivent être triés dépend de la nature des analyses ultérieures et les protocoles utilisés. Par exemple, dans le cas de l'analyse de l'expression des gènes de microréseau,> 1000 vers devront obtenir suffisamment ARN, si les protocoles standards sont utilisés, mais ~ 100 vers suffirait si l'amplification est utilisé, permettant la collecte rapide de matériel et de minimiser ainsi le stress de les vers.

Protocole

Une. L'obtention d'une culture synchronisée des jeunes adultes Animaux

1. Grandir vers sur plusieurs plaques NGM ensemencées avec OP50-1 E. colibacilles (10x concentré d'une culture saturée) jusqu'à ce que de nombreux vers ont atteint le stade gravide.
2. Traiter les animaux gravides avec une solution d'oeuf préparation pour obtenir une culture synchronisée (œufs).
3. oeufs de plaque sur plusieurs plaques de 60 mm NGM ensemencées avec 10x concentré OP50-1 à une densité d'environ 150-200 oeufs / plaque.
4. Incuber les plaques à 25 ° C pendant 2 jours (jusque vers ont atteint le L4 - stade jeune adulte).

2. Préparation Pseudomonas aeruginosa plaques et infecter Worms

1. Le jour de l'oeuf-prep (étape 1.1) inoculer une culture PA14 :: GFP dans 2 ml d'un milieu contenant B de King la rifampicine à une concentration finale de 100 pg / ml. Incuber la culture à 37 ° C avec agitation O / N.
2. Plate la PA14 :: GFP culture sur autant de plaques de Killing lent (SKP) comme nécessaire pour le test. Sur chaque 150 mm SKP boîte de Pétri pipette 75-100 ul de culture saturée et répartir uniformément avec une spatule en verre stérile. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 20-24 h.
3. Retirer les plaques de l'incubateur et de les laisser refroidir à la température ambiante (~ 20 min). En utilisant un tampon M9, laver les vers de l'étape 1.4 sur PA14 :: plaques GFP dans un volume minimal de liquide. Lors de l'utilisation des plaques de 150 mm, plusieurs centaines de vers peuvent être placés sur une seule plaque.
4. Incuber les plaques à 25 ° C pendant 18-21 h. Pour P. jeunes vers adultes aeruginosa exposés, c'est la fenêtre de temps l'affichage de la répartition optimale de colonisé vs animaux noncolonized.

3. Mise en place du Wormsorter

Avant d'effectuer l'échantillon sorte, s'assurer que la machine fonctionne correctement. Les détails peuvent être obtenus http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, et ee étapes essentielles sont décrites ci-dessous.

1. Régler la pression de la soupape de gaine à environ 5 psi (4,5-5,5 gamme).
2. Pour vérifier que le débit de fluide gaine est approprié, placer un tube conique de 15 ml sous le distributeur, tournez la vanne de la gaine, et fermez le robinet de tri. Tenir le tube sous le distributeur pendant 60 secondes. Le volume dans le tube doit être de 9 à 10 ml. Si elle est en dehors de cette gamme, ajuster la pression de la soupape de gaine en conséquence.
3. Pour veiller à ce que le débit de fluide gaine (défini comme dans l'étape 3.2) permettra tri précis, tester le taux de tri à l'aide de 40 particules um de contrôle:
4. Fermez le robinet de la gaine. Ajouter environ 25 ml de solution de particules de commande au réservoir.
5. Ouvrir la valve de la gaine, et la soupape d'échantillon.
6. Sur le logiciel de l'ordinateur, accédez à la "mode de particule de contrôle" et cliquez acquérir.
7. Assurez-vous que le taux d'écoulement de particules est d'environ 5-8 particules / sec, avec une TOF (Time Of Flight) approximation de la largeurde la particule, de 40 um. Un tel TOF indique que seulement une seule 40 um objet passe à travers à la fois. Si les valeurs sont en dehors de cette plage, régler les paramètres (en suivant les indications ci-dessus) en conséquence.

4. Le tri Colonisée vs Noncolonized Worms

1. Utilisation M9, laver vers dans des tubes coniques de 15 ml. Permettre vers adultes à se déposent au fond du tube par gravité et retirer le surnageant. Remplir le tube avec frais M9. Répétez ce processus 3-4x. Cela supprime une grande partie des larves ainsi que les bactéries en excès et dure environ 10 min.
2. Ajouter vers le réservoir de wormsorter avec une petite barre d'agitation en douceur de mélange.
3. Régler le gain de signal initial en définissant la PMT vert à 600 et le rouge et jaune PMT à 200.
4. Commencer à acquérir des données pour ajuster les réglages.
5. Viser un taux de 25-30 événements (vers) par seconde de tri. Si le taux de nombre est trop élevé, diluer les vers dans le réservoir avec M9 en conséquence. Si le taux est deo faible, ajouter des vers dans un petit volume de M9.
6. Si l'expérience nécessite une séparation très stricte de colonisé vs vers noncolonized, réglez le "bilan de coïncidence" à "pur". Cela garantit que dans le cas où deux objets apparaissent trop proches les uns des autres ou dans la même chute, la machine rejette la chute plutôt que de les recueillir.
7. Pour trier la population d'intérêt, établir des barrières autour des axes indiquant la taille (pour obtenir des vers adultes) et de l'intensité de fluorescence (c.-haut pour colonisé, faible pour noncolonized). Les valeurs de fluorescence de déclenchement doivent être déterminées de manière empirique.
8. Placez une plaque multi-puits ou d'une boîte de Pétri sous le distributeur pour recueillir les vers puis ouvrez la vanne de sorte à commencer le tri vers.
9. Recueillir une petite population d'animaux pour vérifier sous le microscope que la population triée est la population d'intérêt. Sinon, ajustez les paramètres de déclenchement en conséquence et poursuivre la collecte de l'échantillon.

Résultats

Lorsque appariés pour l'âge, génétiquement identiques C. elegans sont exposés à P. aeruginosa, une large distribution est observée dans les niveaux de colonisation (Figure 1A). Avec l'aide du protocole décrit ci-séparation efficace contre les vers de noncolonized colonisés peut être réalisé (figure 1B). Contrairement vers noncolonized, vers colonisés montrent des signes de dommages, comme la lenteur et la défécation réduit ^19. Ce dernier peut être une raison...

Discussion

La méthode que nous décrivons tire parti de marquage fluorescent des entités à l'extérieur de la vis sans fin, pour suivre les interactions entre la vis sans fin et de son environnement. Dans le cas que nous présentons, la séparation a été basée sur l'étiquetage d'un agent pathogène et a été utilisé pour les vers séparées avec lourde charge pathogène de ceux qui n'ont pas (ou lumière) charge. Après l'analyse de l'expression du gène n'a trouvé aucune différence dans les réponses immunitaires e...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
M9 Tampon	préparé sur place		Recette chez wormbook.org
Rifampicine	Sigma	R3501
Solution de préparation d’œufs	préparée sur place		50 ml d’eau ; 40 ml d’eau de Javel ; 10 ml de plaques d’hydroxyde de sodium 10 N
NGM	préparées sur place		Recette chez wormbook.org
Plaques SKP	préparées sur place		Recette identique à NGM seulement 0,35 % de peptone au lieu de 0,25 % Particules de
test de contrôle	Union Biometrica	310-5071-001