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Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

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DOI :

10.3791/51105

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17 décembre 2013

 ,  , 
1Vaccine and Gene Therapy Institute of Florida

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un test de cytotoxicité sensible basé sur des cellules. En énumérant la diminution de la fréquence des lymphocytes T CD4+ cibles vivantes en présence d’un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ effecteurs, ce test permet d’évaluer directement l’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène.

Résumé

L’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ est rarement évaluée. Nous décrivons ici un nouveau test cellulaire pour mesurer la capacité des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène à tuer les lymphocytes T CD4+ chargés de leur peptide apparenté. Les lymphocytes T CD4+ cibles sont divisés en deux populations, marquées avec deux concentrations différentes de CFSE. Une population est pulsée avec le peptide d’intérêt (CFSE-faible) tandis que l’autre reste non pulsée (CFSE-élevé). Les lymphocytes T CD4+ pulsés et non pulsés sont mélangés dans un rapport égal et incubés avec un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ purifiés. La destruction spécifique des lymphocytes T CD4+ cibles autologues est analysée par cytométrie en flux après coculture avec des lymphocytes T CD8+ contenant des lymphocytes T CD8+ effecteurs spécifiques de l’antigène détectés par coloration peptide/tétramère MHCI. La lyse spécifique des lymphocytes T CD4+ cibles, mesurée à différents rapports effecteurs/cibles, permet de calculer des unités lytiques, LU30/106 cellules. Ce test simple et direct permet de mesurer avec précision la capacité intrinsèque des lymphocytes T CD8+ à tuer les lymphocytes T CD4+ cibles.

Introduction

L’activité cytolytique est la fonction principale des lymphocytes T CD8+, mais elle est encore rarement mesurée, car les dosages utilisés à cette fin sont lourds et difficiles à normaliser. Une mesure précise de cette fonction est d’une importance primordiale pour caractériser les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+, car aucun prédicteur fiable de cytotoxicité efficace à médiation cellulaire n’a encore été décrit1,2. Ici, nous proposons un nouveau test fonctionnel pour mesurer l’activité cytotoxique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène sur les lymphocytes T CD4+ cibles. Plusieurs approches ont été développées pour fournir des alternatives à l’essai de référence de libération de chrome. Nous présentons ici un test basé sur les cellules qui révèle l’ensemble du processus de destruction en mesurant la mort de cellules cibles vivantes. Cette méthode a été dérivée de protocoles d’essais cytotoxiques basés sur la cytométrie en flux in vivo chez la souris4,5 et in vitro chez l’homme6. Dans ce protocole, les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène contenus dans la population totale de lymphocytes T CD8+ sont utilisés comme cellules effectrices et les lymphocytes T CD4+ autologues sont utilisés comme cellules cibles. Les lymphocytes T effecteurs CD8+ d’intérêt sont dénombrés à l’aide de tétramères MHCI/peptides7. La mort des cellules cibles est calculée par le rapport entre les lymphocytes T CD4+ chargés et les lymphocytes T CD4+ non chargés. Nous avons précédemment montré que cette méthode était reproductible, sensible, spécifique et ne dépendait pas du nombre de cellules effectrices dans la population totale de lymphocytes T CD8+8. En énumérant à la fois le nombre de cellules effectrices et de cellules cibles dans l’essai de coculture, la capacité intrinsèque des lymphocytes T CD8+ à tuer les cellules cibles peut être calculée et exprimée en unités lytiques9.

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Protocole

1. Préparation des lymphocytes T CD8+ effecteurs

  1. Décongeler des PBMC autologues cryoconservés (2-3 flacons de 50 x 106 cellules) en transférant le cryoflacon de l’azote liquide dans un bain-marie à 37 °C.
  2. Lavez les cellules en remplissant le tube à 50 ml avec du RPMI complet (4 mM de L-glutamine et 100 U/ml de pénicilline et de streptomycine, complétés par 10 % de FBS). Compter les PBMC et remettre les cellules en suspension à une concentration de 5 x 106/ml dans un RPMI complet.
  3. Ajouter un peptide spécifique (5 μg/ml) et de l’IL-2 (10 ng/ml) aux PBMC.
  4. Mise en place de la culture dans une plaque à 96 puits profonds ; semer 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits.
  5. Après 3 jours de culture, remplacez la moitié du milieu de culture cellulaire par du RPMI complet frais.
  6. Après 6 jours de culture, prélever tous les PBMC à l’aide d’une pipette multicanaux et transférer les cellules dans un réservoir stérile.
  7. Compter, laver et remettre en suspension les PBMC à raison de 5 x 107/ml dans le tampon de séparation recommandé dans des tubes à fond rond de 14 ml. Ajouter un cocktail d’enrichissement en lymphocytes T CD8+ humains à 50 μl/ml de cellules. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter des particules magnétiques à 150 μl/ml et incuber pendant 5 min.
  8. Porter la suspension cellulaire à 7 ml en ajoutant le tampon de séparation. Procédez à l’isolement immunomagnétique des lymphocytes T CD8+ non touchés en plaçant le tube dans l’aimant. Au bout de 5 min, avec le tube toujours dans l’aimant, versez les cellules d’intérêt dans un nouveau tube conique de 15 ml. Prenez une petite aliquote et colorez les cellules avec des anticorps contre CD3 et CD8 dans 1X PBS-2 % FBS pendant 30 min à 4 °C. La pureté des lymphocytes T CD8+ peut ensuite être mesurée par cytométrie en flux avec une pureté attendue de 95 % ou plus.
  9. Mettez en suspension les lymphocytes T CD8+ dans 450 μl avec RPMI complet.
  10. Ajoutez 225 μl de RPMI complet dans 5 tubes à bouchon à vis.
  11. Préparez des dilutions en série (de 1:2 à 1:32) en transférant 225 μl de CD8+ dans le tube suivant (voir figure 1, panneau supérieur).

2. Préparation des lymphocytes T CD4+ cibles

  1. Décongelez des PBMC autologues cryoconservés (1 flacon de 50 x 106 cellules) en transférant le cryoflacon de l’azote liquide dans un bain-marie à 37 °C.
  2. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de RPMI.
  3. Laver les cellules et remettre en suspension les PBMC à 5 x 107/ml avec tampon de séparation dans des tubes à fond rond de 14 ml. Ajouter un cocktail d’enrichissement en lymphocytes T CD4+ humains à 50 μl/ml de cellules. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter des particules magnétiques à 100 μl/ml et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  4. Porter la suspension cellulaire à 7 ml en ajoutant un tampon de séparation. Procédez à l’isolement des lymphocytes T CD4+ en plaçant le tube dans l’aimant. Après 5 min, avec le tube toujours à l’intérieur de l’aimant, versez les cellules souhaitées dans un nouveau tube conique de 15 ml. Prenez une petite aliquote et colorez les cellules avec des anticorps contre CD3 et CD4 dans 1x PBS-2 % FBS pendant 30 min à 4 °C. La pureté des lymphocytes T CD4+ peut ensuite être mesurée par cytométrie en flux avec une pureté attendue de 95 % ou plus.
  5. Comptez les lymphocytes T CD4+, divisez-les en deux tubes coniques de 15 ml et lavez-les dans du PBS chaud 1x.
  6. Préparez une solution de travail de 0,4 μM CFSE dans du PBS chaud.
  7. Préparez une solution de travail à faible CFSE de 0,04 μM en diluant une partie de la solution de travail à 10x CFSE dans du PBS chaud.
  8. Remettre les cellules en suspension à raison de 20 x 106/ml de PBS (si le nombre de cellules T CD4+ est inférieur à 10 x 106/ml, remettre les cellules en suspension dans 0,5 ml de PBS) et colorer la moitié des cellules T CD4+ en ajoutant un volume égal de solution de travail à haute teneur en CFSE de 0,4 μM (concentration finale de 0,2 μM). Par exemple, pour 1 ml de cellules, ajoutez 1 ml de la solution de travail CFSE. Colorer la moitié restante du CD4+ en ajoutant un volume égal de solution de travail à faible teneur en CFSE de 0,04 μM (concentration finale de 0,02 μM). Cellules de coloration pendant 15 min à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2.
  9. Après l’incubation, les cellules de granulés à 1 500 tr/min pendant 5 min et les remettre en suspension dans 1 ml de RPMI complet chaud pour éteindre la réaction de marquage.
  10. Pulsez des lymphocytes T CD4+ à faible teneur en CFSE en ajoutant le peptide d’intérêt à une concentration finale de 5 μg/ml dans l’IPRP complet et incubez pendant 45 min dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C.
  11. Lavez les lymphocytes T CD4+ à indice CFSE élevé et CFSE faible dans un RPMI complet. Répétez l’opération pour un total de deux lavages. Remettre en suspension à une concentration de 2 x 105 cellules/ml chacune dans un RPMI complet.
  12. Mélangez les deux populations cibles selon un rapport de 1:1 (CFSE-High :CFSE-Low) (voir la figure 1, panneau inférieur).

3. Coculture

  1. À partir de chaque dilution de lymphocytes T CD8+, ensemencer 100 μl en double dans une plaque à fond rond à 96 puits.
  2. Ajouter les lymphocytes T CD4+ cibles mixtes (100 μl) à chaque dilution de cellules effectrices pour un volume final de 200 μl.
  3. Pour mesurer l’apoptose basale, ensemencez 3 puits avec les cellules cibles seules.
  4. Incuber en coculture pendant 6 h dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C.

4. Coloration et acquisition par cytométrie en flux

  1. Transférer les cellules sur une plaque à fond en V de 96 puits et les colorer avec des tétramères pMHC conjugués au PE pendant 15 min dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C.
  2. Laver dans 1x PBS-2 % FBS et colorer les cellules avec les cellules mortes fixables Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 pendant 30 min à 4 °C, à l’abri de la lumière.
  3. Lavez les cellules une fois avec 1x PBS-2 % FBS et remettez-les en suspension dans 100 μl avec 2 % de formaldéhyde dans 1x PBS.
  4. Acquisition de cellules sur cytomètre en flux.

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Résultats

Le schéma de la figure 1 résume le test. Des lymphocytes T CD8+ purifiés (cellules effectrices) ont été resuspendus dans 450 µl de RPMI complet et des dilutions sérielles ont été réalisées en ajoutant 225 µl de lymphocytes T CD8+ dans le tube suivant contenant 225 µl de milieu (panneau supérieur). Les lymphocytes T CD4+ purifiés (cellules cibles) ont été comptés, répartis en deux tubes et marqués avec deux concentrations différentes de CFSE (élevée et faible), comme décrit dans le protocole. Les lymphocy...

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Discussion

Le dosage décrit ici permet de quantifier la fonction principale des lymphocytes T CD8+ : l’activité cytolytique. La mesure précise de cette fonction est d’une importance capitale pour caractériser les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+, car des études antérieures ont rapporté une discordance entre cette fonction et la sécrétion de cytokines des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène10,11. En raison de la courte durée d’incubation en coculture (6 heures) et de l’utilisation de cellules cibles a...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Office du tourisme, du commerce et du développement économique de la Floride.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit d’enrichissement des lymphocytes T CD4+ humains EasySepCellules souches19052
Kit d’enrichissement des lymphocytes T CD8+ humains EasySepCellules souches19053
Kit de prolifération cellulaire CellTrace CFSE - Pour cytométrie en fluxInvitrogenC34554
Far Red LIVE/DEAD cellules mortes fixablesInvitrogenL10120
Alexa Fluor 700 Souris anti-humaine CD3BD
Brilliant Violet 650 Anti-Human CD4 AntibodyBiolegend317435
PerCP Anti-Human CD8 AntibodyBiolegend344707
RPMI 1640 Medium 1xVWR10-040-CV
Pénicilline-Streptomycine 100x SolutionInvitrogen15070063
Sérum fœtal bovin - Or, PAA inactivé par la chaleurA15-252
Plaques à 96 puits ; Traités; Fond en U ; avec couvercleBD Falcon353077
25 ml polystyrène stérile, réservoirs emballés individuellementUSA Scientific2321-2230
96 puits à fond en U, stérile 2 ml Plaques à puits profondsThermo Scientific275743
Human IL-2 (v126), qualité rechercheMiltenyi Biotec130-093-096
RoboSep Buffer, tampon de séparationCellulesouche20104
15 ml Tube conique en polypropylèneBD Falcon352097
14 ml Tube à fond rond, polypropylèneBD Falcon352059
The Big Easy EasySepAimant Cellule souche18001
PBS 1xVWR21-040-CV
96 puits ; Plaque à fond en V avec couvercleFisher12-565-481
Solution de formaldéhyde, réactif ACS, 37 % en poids dans H2OSigma-Aldrich252549-500ML
1,5 ml microtube à bouchon à vis, côneSarstedt72.692.005
557943

Références

  1. Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).
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Mots-clés

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