Des cardiomyocytes individuels de souris de type sauvage et mutantes peuvent être isolés du cœur afin d’étudier leur contractilité et leurs transitoires calciques. Cela permet de caractériser la contribution du dysfonctionnement cellulaire au dysfonctionnement cardiaque, quelle qu’en soit la cause.
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Article de méthode
L'isolement et l'analyse physiologique de cardiomyocytes de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cardiomyocytes, la cellule de travail du cœur, contiennent des éléments cytosquelettiques et contractiles parfaitement organisés qui génèrent la force contractile utilisée pour pomper le sang. Les cardiomyocytes individuels ont été isolés pour la première fois il y a plus de 40 ans afin de mieux étudier la physiologie et la structure du muscle cardiaque. Les techniques se sont rapidement améliorées pour inclure la digestion enzymatique par perfusion coronaire. Plus récemment, l’analyse de la contractilité et du flux calcique de myocytes isolés a fourni un outil essentiel dans l’analyse cellulaire et subcellulaire de l’insuffisance cardiaque. L’échocardiographie et les électrocardiogrammes fournissent des informations sur le cœur au niveau des organes seulement. Il existe des systèmes de culture cellulaire de cardiomyocytes, mais les cellules manquent de structures physiologiquement essentielles telles que les sarcomères organisés et les tubules T nécessaires à la fonction des myocytes dans le cœur. Dans le protocole présenté ici, les cardiomyocytes sont isolés par perfusion de Langendorff. Le cœur est retiré de la souris, monté via l’aorte dans une canule, perfusé avec des enzymes de digestion, et les cellules sont introduites à des concentrations croissantes de calcium. Un logiciel de détection des bords et des sarcomères est utilisé pour analyser la contractilité, et un colorant fluorescent de liaison au calcium est utilisé pour visualiser les transitoires calciques des cardiomyocytes à stimulation électrique ; une meilleure compréhension du rôle que jouent les changements cellulaires dans la dysfonction cardiaque. Traditionnellement utilisé pour tester les effets des médicaments sur les cardiomyocytes, nous utilisons ce système pour comparer les myocytes de souris WT et les souris présentant une mutation qui provoque une cardiomyopathie dilatée. Ce protocole est unique en ce qu’il compare des cellules vivantes de souris dont la fonction cardiaque et la génétique sont connues. De nombreuses conditions expérimentales sont comparées de manière fiable, notamment la manipulation génétique ou environnementale, l’infection, le traitement médicamenteux, etc. Au-delà des données physiologiques, les cardiomyocytes isolés sont facilement fixés et colorés pour les éléments cytosquelettiques. L’isolement des cardiomyocytes par perfusion est une méthode extrêmement polyvalente, utile pour étudier les changements cellulaires qui accompagnent ou conduisent à l’insuffisance cardiaque dans diverses conditions expérimentales.
Introduction
Les cardiomyocytes fournissent la force contractile pour le cœur. Chaque myocyte contient des éléments cytosquelettiques et contractiles organisés essentiels à la contraction. Le cœur contient non seulement des cardiomyocytes, mais aussi des fibroblastes, du tissu conjonctif et des myocytes modifiés tels que les fibres de Purkinje. Des changements dans l’un ou l’autre de ces types de cellules peuvent être observés dans l’insuffisance cardiaque, ce qui rend difficile la détermination de la cause ultime du dysfonctionnement cardiaque. La diminution de la contractilité ventriculaire d’un cœur défaillant est précédée de degrés divers d’accumulation de tissu fibreux et d’une hypertrophie et d’un dysfonctionnement des cardiomyocytes1. Les arythmies peuvent être causées par un dysfonctionnement des cellules conductrices2, une fibrose interrompant la conduction cardiaque3 ou des modifications de l’expression des canaux ioniques dans les cardiomyocytes1,4. En effet, ces problèmes coexistent souvent de manière compliquée.
L’isolement et l’étude des cardiomyocytes permettent d’examiner le dysfonctionnement contractile et électrique des myocytes individuels dans le contexte de la fonction cardiaque globale. Des techniques permettant d’isoler des myocytes cardiaques individuels ont été mises au point il y a plus de 40 ans dans le but de mieux étudier la physiologie de cette cellule « bête de somme » du cœur. Les techniques d’isolement ont été améliorées pour augmenter le rendement et la qualité des cellules, avec le développement vital de la perfusion coronaire par canulation de l’aorte, réalisée pour la première fois en 19705. Cet article décrit l’isolement des cardiomyocytes suivi d’une mesure de la contractilité et des transitoires calciques à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données de fluorescence ratiométrique et de dimensionnement cellulaire. Dans les modèles génétiques et environnementaux des maladies cardiaques, l’utilisation de ce protocole fournit des informations clés sur la contractilité cellulaire, la contractilité et la relaxation sarcomériques, les transitoires calciques et la perturbation cytosquelettique. Ce système est souvent utilisé pour tester l’effet de médicaments sur des cardiomyocytes isolés6,7. Nous utilisons le système pour comparer la contractilité et les transitoires calciques des cardiomyocytes entre des souris de type sauvage et des souris présentant une mutation conduisant à une cardiomyopathie dilatée.
L’étude des myocytes cardiaques individuels présente de nombreux avantages par rapport aux autres méthodes couramment utilisées pour étudier l’anatomie et la physiologie cardiaques. L’échocardiographie et l’électrocardiographie fournissent des informations sur la fonction contractile et la conduction électrique du cœur dans son ensemble. Aucune de ces méthodes n’explique la cause ou la nature du dysfonctionnement en dessous du niveau de l’organe entier. La mesure de la contractilité de cardiomyocytes individuels à l’aide d’algorithmes de détection des bords et de longueur du sarcomère peut démontrer que des changements au sein de la cellule contractile du cœur sont présents dans le cadre d’un dysfonctionnement cardiaque global. La mesure des transitoires calciques démontre l’influence des changements dans le flux ionique au niveau cellulaire sur la dysfonction contractile ou les arythmies.
En plus de compléter les études d’organes entiers, ce protocole fournit des cellules facilement colorées pour les composants subcellulaires. Il est possible de voir des changements cytosquelettiques en colorant des sections de tissu de l’ensemble du cœur ; Cependant, on ne peut visualiser qu’une coupe efficace de cellules. Un cardiomyocyte entier est plus épais qu’une section de tissu typique, et compte tenu de la disposition et de la longueur des cardiomyocytes, il est difficile de voir des cellules entières dans une seule section. Les cardiomyocytes isolés peuvent être fixés immédiatement et colorés pour une variété d’éléments cytosquelettiques et de canaux ioniques. Les images confocales peuvent être compilées en empilements z de pleine épaisseur de la cellule. De plus, la coloration des myocytes cardiaques isolés permet de colorer des composants impossibles à visualiser en coupes, tels que les invaginations membranaires connues sous le nom de tubules T.
Il existe des lignées cellulaires cultivées de myocytes cardiaques, dont certaines ont des profils transcriptionnels et des caractéristiques phénotypiques similaires à ceux des myocytes cardiaques. Certains, comme la lignée cellulaire HL-1, conservent même une certaine organisation sarcomérique et une capacité contractile rudimentaire8. Malgré ces qualités, les cellules cultivées n’ont pas la forme de « boîte » et la structure des tubules en T des cardiomyocytes et ont moins d’organisation sarcomérique. Ces composants sont essentiels au fonctionnement des cardiomyocytes in vivo. De plus, l’utilisation de cellules cultivées permet des manipulations génétiques mais pas des manipulations physiologiques in vivo. Les cardiomyocytes isolés conservent leur organisation cellulaire assez longtemps pour être étudiés, mais sont encore facilement imagés et même transduits9.
Les cardiomyocytes isolés sont extrêmement polyvalents, fournissant un substrat pour analyser à l’identique des cellules provenant de conditions expérimentales variées. L’isolement et l’analyse physiologique des myocytes ont été utilisés par d’innombrables laboratoires pour une variété d’expériences, y compris l’étude de l’effet des médicaments6,7 ou des petites molécules10, des facteurs de stress environnementaux11, de l’infection12, de la maladie13 ou de la mutation génétique14,15 sur la contractilité et/ou les transitoires calciques et l’étude de la régulation de la contractilité et de la libération de calcium dans un cardiomyocyte15-17. Avec l’application de l’un de ces facteurs de stress, les changements dans la fonction cardiaque pourraient être dus à une combinaison de changements dans les cardiomyocytes eux-mêmes et de changements dans l’environnement environnant du cœur, tels que des cicatrices, des changements de conductivité ou des changements dans la matrice extracellulaire. Il s’agit d’un protocole idéal pour répondre aux questions de recherche concernant la structure et la fonction des myocytes individuels dans le contexte de l’insuffisance cardiaque, quelle qu’en soit la cause.
Bien qu’elle présente d’innombrables avantages par rapport à d’autres techniques, l’analyse physiologique des cardiomyocytes isolés n’est pas idéale pour toutes les questions de recherche. L’isolement est une procédure terminale, de sorte que les cardiomyocytes ne peuvent être évalués qu’à un moment unique de la vie de la souris. Ce phénomène peut être partiellement surmonté à l’aide de cohortes et de souris sacrifiées individuellement au cours du développement de la maladie ou en surveillant la souris pour déterminer si elle souffre d’une insuffisance cardiaque cliniquement significative avant l’isolement. Bien que ce protocole puisse déterminer si un dysfonctionnement des cardiomyocytes s’est produit, on ne peut pas conclure que ce dysfonctionnement est la cause profonde de l’insuffisance cardiaque sans informations expérimentales supplémentaires. Il est possible que le dysfonctionnement des cardiomyocytes lui-même soit secondaire à d’autres changements dans le cœur. Malgré ces défis, l’étude des cardiomyocytes offre des informations précieuses pour déterminer la nature du dysfonctionnement cardiaque, en particulier lorsqu’elle est combinée à d’autres expériences.
Le protocole suivant est adapté de celui fourni par le Dr Chee Lim, de l’Université Vanderbilt. Bien que les données de contractilité et de flux calcique soient hautement reproductibles et utiles pour comparer les cœurs avec des manipulations génétiques ou environnementales, l’isolement lui-même reste un protocole dépendant de la technique, nécessitant une optimisation. Minimiser le temps entre le retrait du cœur de la souris et la perfusion du cœur via la canulation aortique est essentiel pour une digestion de qualité. De plus, le temps de digestion et la concentration enzymatique peuvent être optimisés pour les myocytes de la plus haute qualité. Les étapes susceptibles de nécessiter une optimisation, ainsi que des suggestions d’optimisation, sont indiquées ci-dessous.
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Protocole
S'assurer que toutes les procédures impliquant des animaux sont approuvés par l'utilisation des animaux appropriés et soins du corps.
1 Préparer Stock tampons à l'avance
- Préparer 2 L stocks de Ca2 + libre de Tyrode (Table 1). Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH.
- Préparer 2 L stocks 1.2 (la Table 2) de mM Ca2 + Tyrode. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH.
2 Le jour de l'expérience, Préparer la perfusion, transfert et Digestion tampons
- Préparer tampon de perfusion de 150 ml en Ca 2 + libre de Tyrode (tableau 3) et filtrer à travers un filtre de 0,2 um.
- Préparer 35 ml de Ca 2 + libre transfert "tampon A" (Tableau 4) et de 25 ml contenant du Ca2 + "tampon B» (Tableau 5). Filtre chacun à travers un filtre de 0,2 um.
- Préparer des solutions de 00,06, 0,24, 0,6, et 1,2 mM de Ca 2 + par le mélange tampon A et B au tableau 6.
- Préparer du tampon de digestion de 25 ml en dissolvant les enzymes de digestion dans 25 ml de tampon de perfusion (tableau 7) sur la base du poids corporel (BW) de la souris. Filtrer à travers un filtre de 0,2 um avant utilisation.
3. installation expérimentale
- Assemblage d'un appareil de Langendorff à débit constant, disponible dans le commerce ou à l'aide d'une pompe, un tube, et une bobine d'échangeur de chaleur péristaltique pour permettre un débit de 3 ml d'écoulement / min de solution de perfusion chauffé à 37 ° C. Un schéma simple est fourni dans l'examen de 2011 par Bell et al 18.
- Régler la température de circulation du bain d'eau (~ 47 ° C) de l'appareil de Langendorff, afin que la canule de sortie est à 37 ° C à un débit de 3 ml / min.
- Exécuter éthanol à 70% à travers le système de perfusion pendant 15 min, puis 100 ml d'eau de type I ultrapure. Tampon de perfusion courir à travers la systématisationm pendant 5 min, tout en éliminant les bulles d'air.
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec une méthode souhaitée.
- Créer une canule en fixant un morceau court (environ 3 mm) de tube PE-50 à l'extrémité 23 d'un embout Luer-G adaptateur. pointe de chaleur de tube pour créer une lèvre sur laquelle l'aorte sera positionné.
4. cardiomyocytes isolement
- Injecter souris avec 0,2 ml de solution d'héparine (1000 IU / ml), par injection intrapéritonéale.
- Après 5 min, anesthésier la souris avec isofluorane. Une fois complètement anesthésiés (pas de réponse à une forte pincée de pied), pulvériser poitrine avec EtOH à 70%. Ouvrez le coffre, exciser rapidement le coeur, en faisant attention à ne pas endommager l'aorte, et dans 4 ° C tampon de perfusion. Utilisez une pince courbes de saisir et de soulever dans le cœur. Cela crée un espace pour couper les pièces jointes derrière le cœur avec des ciseaux fins.
- Cathétériser coeur en saisissant délicatement le bord de l'aorte avec deux paires de pinces fines et en tirant soigneusement la mise en service:ng de l'aorte au-dessus de la lèvre de la canule. S'assurer que la pointe de la canule n'est pas passé la valve aortique et dans le ventricule, comme cela va inhiber la perfusion du coeur par les artères coronaires.
- Fixer l'aorte à la canule en attachant une boucle de fil de suture en soie 5-0 autour de l'aorte juste au-dessus de la lèvre de la canule.
- Remarque: Les étapes 4.2 à 4.4 devraient être achevés aussi rapidement que possible pour une meilleure digestion de la qualité.
- Remarque: Le cœur peut être accroché directement sur la canule déjà fixé à l'appareil de Langendorff avec coule tampon de perfusion. Cependant, le coeur accroché sur une canule fixée à une seringue de petit tampon de perfusion sous un microscope de dissection a été trouvé pour être plus efficace. Cela permet à une petite quantité de tampon de perfusion pour être poussée à travers, en regardant à la compensation des artères coronaires et d'assurer le coeur est solidement fixé à la canule. La canule est ensuite accroché sur le Langendorff avec la gestion du tampon de perfusion.
- Perfusele coeur de Ca2 + libre tampon de perfusion à un débit de 3 ml / min pendant 2-3 min.
- Mettre à l'enzyme tampon de digestion et perfuser pour 7-10 min, le cœur devient plus doux et plus légers en couleur.
- Remarque: la durée de minéralisation peut être ajustée en fonction de l'activité enzymatique et la taille du cœur.
- Une fois que le cœur est manifestement flasque, retirez le cœur de canule et le placer dans un plat de p60 stérile avec le tampon A (Ca2 + tampon de transfert gratuit).
- Retirer les oreillettes et les gros vaisseaux. Retirer le ventricule droit, si désiré. Avec une pince, séparer le ventricule en petits morceaux. Introduire à la pipette plusieurs fois avec 5 ml d'une pipette de transfert stérile à disperser en outre des cellules.
- On filtre la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml à travers un filtre à mailles de nylon de 250 um.
- Laisser la suspension de culot pour environ 10 min.
- Transférer le culot dans la solution 2 + Ca 0,06 mM. Permettent aux cellules de granulés pour 10 min. Les cellules saines vont sédimenter, tandis que la plupart des cellules mortes flottent.
- Aspirer le surnageant et transférer le culot à l'mM Ca2 + solution de 0,24.
- Répétez 10 minutes d'incubation, l'aspiration, et de les transférer dans les deux solutions 2 + Ca reste jusqu'à ce que les cellules sont dans la solution de 1,2 mM. A ce moment, la majorité des cellules doit être myocytes en forme de tige.
5. mesure contractilité et calcium transitoires
- Remarque: Les contractilité et transitoires de calcium peuvent être mesurées simultanément.
- Préparer Fura-2 AM solution par remise en suspension dans du DMSO anhydre à une concentration de 1 pg / pl. Solution Fura-2 AM peut être stocké dans un dessiccateur à -20 ° C.
- Charge 1 ml de cellules en suspension avec 1 pi Fura-2 heures. Permettent aux cellules de s'asseoir dans l'obscurité 10 minutes, puis aspirer le surnageant. Laver deux fois avec la solution de Ca2 + Tyrode, permettant aux cellules de granulés dans l'obscurité pendant 10 min entre les lavages.
- Déposer une lamelle de verre dans un insert de phase qui permet chauffé perfusion / aspiration et l'électrode de stimulation d'un stimulateur domaine des myocytes. insert de scène de la Place de microscope inversé mis en place pour la mesure de la fluorescence, en ajoutant une goutte d'huile à l'aide d'un objectif si l'objectif à immersion d'huile.
- Mettre en place une perfusion par gravité chauffée avec une solution de 1,2 mM Ca2 + Tyrode donc solution sur scène atteint 37 ° C. Fixez aspiration à vide. Appliquez les électrodes.
- Allumez le système de microscope, et ouvrir le logiciel de fluorescence et d'acquisition de données de dimensionnement des cellules quotientométrique.
- Ajouter quelques gouttes de cellules chargées de Fura-2 heures à l'insert de la scène, bloquant momentanément la perfusion afin de permettre aux cellules saines de se déposer.
- Utilisez objectif 40X pour localiser la cellule désirée. Une cellule saine doit être en forme de bâton et pas se contractant spontanément. Il faut visiblement et uniformément contrat lorsque la cellule est stimulée à 5-20 V.
- Remarque: l'analyse physiologique nécessite une digestion de haute qualité. Il est possible d'avoir des cellules qui semblent saines, mais ne le font pas pa CE et à l'analyse physiologique. protocole de digestion peut être affinée pour obtenir de haute qualité, les myocytes sains. En outre, coeurs mutantes ou malades peuvent nécessiter des modifications au protocole.
- Régler la rotation de la lentille et le changement ouverture de manière souhaitée cellule est aligné horizontalement sur l'écran et le fond n'est pas visible.
- Aligner les barres de détection de bord à chaque extrémité de myocytes et ajuster seuil. Aligner la détection des sarcomères sur une partie de cellule de sarcomères uniformes. Le plus vous pouvez faire ce bar, le plus précis du modèle mathématique de la longueur de sarcomère sera, tant que ce n'est pas sur deux populations de sarcomères.
- cellules de Pace à 2 Hz et 5-20 V pour 10-15 secondes avant l'enregistrement.
- traçage d'enregistrement. La lumière ambiante doit être minimisée pour le meilleur enregistrement calcium transitoire.
Analyse 6.
- Analyser des traces par fluorescence ratiométrique et logiciel d'acquisition de données de dimensionnement de cellule.
- Ce protocole fournit les cellules excédentaires qui peuvent être utilisés pour une variété d'autres expériences, notamment: la fixation et coloration immunologique, l'évaluation des effets directs de la drogue, de la culture à court terme, et la microscopie à force atomique.
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Résultats
Une fois la contractilité et de tracés de passage sont recueillies (figure 2), les données sont facilement analysées avec le logiciel approprié. Le tout suivi, ou des parties de ceux-ci peuvent être en moyenne (Figure 3). Contractilité peut être analysé de différentes façons. Pour la fonction systolique, on peut évaluer l'ampleur de la contraction de la fraction de raccourcissement, ou la vitesse de contraction de temps pour culminer raccourcir, et la vitesse de contraction. La fonc...
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Discussion
Isolation des cardiomyocytes de qualité nécessite un certain niveau de pratique et d'optimisation. Ce protocole contient des étapes clés qui peuvent grandement influer sur le résultat de la digestion. Ceux-ci devraient être examinés avec soin lors de l'exécution et le dépannage du protocole. Le temps de retrait de la canule de coeur et la perfusion doit être réduit au minimum, de préférence moins de cinq minutes. Rinçage du coeur immédiatement dans un tampon de perfusion glacé après le retrait de la souris et de...
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Déclarations de divulgation
Nous n'avons rien à divulguer.
Remerciements
Marc Wozniak pour l'utilisation du Département de biologie cellulaire et de l'équipement de la vidéographie de développement.
Université Vanderbilt imagerie cellulaire de ressources partagées.
Ce travail est soutenu par AHA subvention 12PRE10950005 à l'ERP, AHA subvention 11GRNT7690040 de DMB, NIH R01 HL037675 à DMB. DMB est le président Gladys P. Stahlman en recherche cardiovasculaire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2· ; 2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-butanedione-monoxime (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurine | Sigma | T-0625 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagénase B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagénase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protéase XIV | Sigma | P-5147 | |
| Héparine | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO &ndash ; anhydre | Sigma | 276855 | |
| Système de stimulation cellulaire et d’analyse fluorescente IonOptix | IonOptix | ||
| 250 &mu ; m filtre à mailles en nylon | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Adaptateur Luer-stub | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 tube Becton | Dickinson | 427410 |
Références
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Réimpressions et autorisations
