Mesures microscopie intravitale Vidéo de la rétine débit sanguin chez les souris

Résumé

La microscopie intravitale peut être utilisée chez les animaux pour visualiser et mesurer les diamètres vasculaires rétiniens, les vitesses de la circulation sanguine et le flux sanguin rétinien total.

Résumé

Les altérations du flux sanguin rétinien peuvent contribuer à la maladie oculaire et au dysfonctionnement visuel ou en être la conséquence. Par conséquent, la quantification de la perfusion altérée peut aider la recherche sur les mécanismes des pathologies rétiniennes. La vidéomicroscopie intravitale des traceurs fluorescents peut être utilisée pour mesurer les diamètres vasculaires et les vitesses sanguines du système vasculaire rétinien, en particulier des artérioles qui se ramifient à partir de l’artère centrale de la rétine et des veinules menant à la veine centrale de la rétine. Les débits sanguins peuvent être calculés à partir des diamètres et des vitesses, avec la somme du flux artériolaire et du flux veinulaire séparément, ce qui fournit des valeurs du débit sanguin rétinien total. Cet article et la vidéo associée décrivent les méthodes d’application de cette technique à la souris, qui comprend 1) la préparation de l’œil pour la microscopie intravitale de l’animal anesthésié, 2) la perfusion intraveineuse de microsphères fluorescentes pour mesurer la vitesse de la circulation sanguine, 3) la perfusion intraveineuse d’un dextran fluorescent de haut poids moléculaire, pour aider à la visualisation microscopique de la microvascularisation rétinienne, 4) l’utilisation d’une caméra de microscope numérique pour obtenir des vidéos de la rétine perfusée, et 5) l’utilisation d’un logiciel de traitement d’image pour analyser la vidéo. Les mêmes techniques peuvent être utilisées pour mesurer les débits sanguins rétiniens chez les rats.

Introduction

La rétine est l’un des tissus les plus métaboliquement actifs du corps et nécessite par conséquent un apport sanguin généreux. Deux circulations distinctes répondent à cette demande : la circulation choroïdienne pour la partie externe de la rétine et la circulation rétinienne pour la partie interne de la rétine. L’étude de la perfusion rétinienne est impérative pour comprendre les mécanismes pathologiques et les conséquences de la rétinopathie diabétique, de la rétinopathie induite par l’oxygène, de l’occlusion de l’artère ou de la veine de la rétine et de l’accident vasculaire cérébral. Plusieurs méthodes ont été employées pour quantifier le flux sanguin rétinien, chaque technique ayant ses avantages, ses inconvénients, ses limites et ses hypothèses. Parmi ces techniques, citons la perfusion de microsphères de 7 à 8 m de diamètre qui se logent dans les artérioles précapillaires^1,2, l’autoradiographie quantitative^3,4, la microangiopathie optique-tomographie par cohérence optique^5,6, l’imagerie par résonance magnétique^7,8 et la vidéomicroscopie intravitale^{9 à 16}. Les avantages de ce dernier comprennent la visualisation directe en direct des vaisseaux et du flux rétiniens, une dépendance à l’égard de quelques hypothèses mineures et un prix abordable pour les laboratoires disposant d’un microscope à fluorescence avec une caméra vidéo attachée. Dans des études antérieures de microscopie vidéo intravitale^9-16, le dextran fluorescent a été utilisé comme marqueur plasmatique, et les globules rouges marqués par fluorescence (provenant d’un animal donneur) ont été utilisés comme marqueurs de vitesse. Dans le protocole actuel, des microsphères de 1,9 m de diamètre, au lieu de globules rouges, sont utilisées pour mesurer la vitesse, cette altération éliminant le besoin d’un donneur de cellules sanguines.

Protocole

Les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du LSUHSC-S et exécutées conformément aux critères définis par les National Institutes of Health.

1. Préparation des solutions de perfusion

1. Sonicer une solution mère à 1 % (en poids) de microsphères de 1,9 μm de diamètre.
2. Prélever ~25-30 x 10⁶ microsphères fluorescentes vertes (c’est-à-dire ~10 μl de la solution mère) dans une seringue de 300 μl. Diluez les microsphères en prélevant 240 μl supplémentaires de solution saline dans la seringue.
3. Préparez une solution de 50 μl de dextran fluorescent de 2 x 10^{de poids moléculaire 6} dissous dans une solution saline stérile, avec une dose injectée comprise entre 3 et 10 mg/kg. Gardez le dextran recouvert de papier d’aluminium jusqu’au moment de son infusion.

2. Anesthésie animale et canulation vasculaire

1. Anesthésier l’animal pour l’insertion chirurgicale de canules vasculaires et pour le positionnement stationnaire sous un objectif microscope. De nombreux choix de protocoles d’anesthésie sont disponibles, avec divers avantages et inconvénients, et des effets potentiels sur les paramètres systémiques. Parmi les nombreux choix différents, citons une combinaison de kétamine (100-150 mg/kg), de xylazine (10 mg/kg) et d’acépromazine (2 mg/kg), ou une combinaison de kétamine (50 mg/kg) et de pentobarbital (50 mg/kg). Les procédures décrites sont aiguës et se terminent par une euthanasie induite par une surdose de pentobarbital (150 mg/kg) suivie d’une thoracotomie ; L’inclusion d’un analgésique n’est pas nécessaire pour la procédure terminale.
2. Maintenez un coussin chauffant sous l’animal pour le reste de l’expérience.
3. Gardez les yeux humides avec une solution saline tamponnée au phosphate lors des insertions chirurgicales ultérieures des canules vasculaires.
4. Préparez une canule vasculaire pour les perfusions ultérieures de traceurs fluorescents. Un tube en polyéthylène d’une longueur de 20 cm (par exemple, 0,28 mm de diamètre intérieur, 0,61 mm de diamètre extérieur) est placé sur l’extrémité d’une aiguille de seringue, l’extrémité pointue de l’aiguille étant préalablement cassée en se pliant d’avant en arrière avec un hémostat.
5. Remplissez une seringue et un tube avec une solution saline héparinée (25 U/ml).
6. Rasez un côté du bas-ventre et faites une incision pour exposer la veine fémorale.
7. Pour canuler la veine fémorale, attachez le vaisseau avec une suture 5.0, faites une incision partielle du vaisseau (environ la moitié du diamètre du vaisseau) et insérez le tube dans le vaisseau, en fixant le tube avec la suture attachée autour de la section canulée.

3. Préparation à la microscopie intravitale

1. Dilater la pupille de l’œil avec une goutte de solution ophtalmique de tropiciamide à 1 %, suivie d’une goutte de solution ophtalmique d’hypromellose à 2,5 %.
2. Couvrez l’œil avec une lamelle en verre de 5 mm.
3. Placez l’animal sur une planche de plexiglas, qui sera placée sous l’objectif du microscope d’un microscope vertical. Placez stratégiquement de la gaze chirurgicale sous la tête pour permettre un axe direct à travers l’objectif vers la rétine centrale et le disque optique.
4. Faites la mise au point à travers le microscope sur le disque optique, en trouvant le disque avec un objectif 4X de faible puissance et en utilisant un filtre à fluorescéine.

4. Infusion de microsphères fluorescentes pour mesurer les vitesses

1. À l’aide d’un objectif 4X, faites la mise au point sur la rétine avec le disque optique au centre du champ de vision.
2. Perfuser la solution de microsphères fluorescentes à une vitesse de 250 μl/min/kg.
3. Enregistrez en vidéo la rétine visible autour du disque optique, en utilisant un temps d’exposition de l’appareil photo de ~8 ms.
4. Arrêtez l’infusion de microsphères lorsqu’une durée suffisante de vidéo a été enregistrée (1 à 2 min) ; une partie de la solution de microsphère restera probablement inutilisée.

5. Infusion d’un marqueur plasma fluorescent pour mesurer les diamètres

1. À l’aide d’un objectif 4X, faites la mise au point sur la rétine avec le disque optique au centre du champ de vision.
2. Perfaction la solution préparée de dextran fluorescent dans la veine fémorale sous forme de bolus pendant ~5 secondes, pendant l’enregistrement vidéo. Cette vidéo aidera à déterminer l’identité des artérioles par rapport aux veinules, les artérioles étant perfusées en premier. Effectuez cette étape avec le temps d’exposition de l’appareil photo réglé sur ~8 ms, bien que le temps d’exposition précis ne soit pas critique.
3. Passez à un objectif 10X et à un temps d’exposition de 20 à 40 ms pour une meilleure résolution afin de filmer chacune des 4 à 7 artérioles et 4 à 7 veinules de la rétine superficielle. Concentrez-vous (et enregistrez vidéo) sur environ un quadrant de la rétine visible à la fois, avec le centre du disque optique dans un coin du champ de vision. Il faut s’efforcer de réduire au minimum le temps pendant lequel la lumière du microscope éclaire le tissu afin de réduire le risque de phototoxicité induite par la lumière ou les colorants¹⁷.

6. Analyse vidéo

1. À l’aide d’une échelle micrométrique, calibrez le système vidéo pour une conversion de μm/pixel.
2. Avec un logiciel de traitement d’image, lisez la vidéo enregistrée.
3. À partir de la vidéo de la perfusion en bolus de dextran fluorescent, identifiez les artérioles par rapport aux veinules.
4. Pour chacune des 4 à 7 artérioles et 4 à 7 veinules enregistrées avec l’objectif 10X, mesurez les diamètres remplis de dextran fluorescent, en faisant une moyenne de 5 mesures de diamètre par vaisseau le long de la longueur visible.
5. Pour chacune des mêmes artérioles et veinules, mesurez la longueur des traînées des microsphères fluorescentes, en utilisant 10 traînées successives de microsphères dans chaque vaisseau pour éviter le biais de sélection. Divisez la longueur des traînées par le temps d’exposition pour calculer la vitesse de la microsphère, par exemple, 160 μm/8 msec = 20 μm/msec = 2 cm/sec. Faites la moyenne des 10 vitesses par navire.
6. Calculez le débit volumétrique de chaque cuve à l’aide de l’équation suivante : débit = vitesse moyenne × π × diamètre²/4.
7. Additionnez les débits artériolaires, et séparément les débits veineux, pour obtenir le débit sanguin rétinien total.

Résultats

Figure 1 montre des images individuelles d'une vidéo provenant d'une expérience, les panneaux A à D et F à I présentant des traînées de microbilles fluorescentes capturées avec un objectif 4X et un temps d'exposition de 8 ms (et un binning de 2 x 2 pixels afin de réduire la taille du fichier vidéo). Figure 1E montre l'orientation des vaisseaux rétiniens dans les autres panneaux de la figure. Toutes les images de la vidéo ne présenteront pas nécessairement une traînée fluorescen...

Discussion

Cette technique de vidéomicroscopie intravitale peut être appliquée non seulement aux souris, mais aussi aux rats. Ce protocole ne repose que sur quelques hypothèses, mais est limité à une utilisation sous anesthésie et avec la dilatation de la pupille telle que nous l’avons décrite. Les autres hypothèses et limites sont les suivantes :

1. Hypothèse d’une erreur de grossissement optique minimale résultant de la nature réfractive de l’œil. Comme décrit par d’autres^18-20

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microsphères fluorescentes	Bangs Laboratories	FS04F/10584 (vert)
Sondes moléculaires	de dextran fluorescent de haut poids moléculaire	D-7137 (vert) ; D-7139 (rouge)
Système de microscope	Nikon	Eclipse E600FN + embouts Objectif
4X	Nikon	Plan Fluor 4X	ouverture numérique 0,13 ; distance de travail 17,2 mm
Objectif 10X Objectif	Nikon	Plan 10X	ouverture numérique 0,25 ; distance de travail 10,5 mm
Tropicamide solution ophtalmique	Bausch Lomb	1 % Tropicamide
Hypromellose solution ophtalmique	HUB Pharmaceuticals	2,5 % Goniovisc
Logiciel de traitement	d’images Université de Californie San Francisco Vale Lab	Micro-Manager
Caméra vidéo numérique pour la microscopie	Photométrie	CoolSnap ES	1392 x 1040 pixels résolution ; taille des pixels 6,45 x 6,45 &mu ; L