Collecte et analyse des Arabidopsis Phloème exsudats Utilisation de la méthode EDTA-animé

Les plantes ne peuvent pas se déplacer pour échapper à des conditions défavorables. Par conséquent, ils ont dû développer des mécanismes pour détecter les stress environnementaux, obtenir et transmettre un signal lié à toute la plante, et d'ajuster en conséquence le développement. Deux systèmes de transport existent pour la distribution d'eau, de nutriments et d'autres composés (signalisation). Le premier est le xylème, qui transporte habituellement de l'eau et des minéraux absorbés par les racines de l'usine. Le second est le phloème. La vue sur le phloème a changé à partir d'un simple système de transport assimiler à un conduit pour l'ARN, les protéines, les virus, les lipides et d'autres petites molécules. Il joue un rôle important dans l'assimiler et le transport des nutriments, la réponse au stress biotique et abiotique, ainsi que dans la croissance et le développement des plantes. Il est désormais appelé le «autoroutes de l'information» de la plante ^18.

Le phloème est composé de plusieurs types de cellules: parenchyme du phloème, ainsi que compagnon spécialisé CELLS et des éléments tamis. L'élément de tamis est le site de mouvement longue distance. Pour permettre l'écoulement longitudinal dégagée, éléments tamis sont absents la plupart des organites ainsi que les noyaux et sont pensés pour contenir au mieux une machinerie traductionnelle limitée ^{21, 33.} On croit que les cellules compagnes synthétiser des protéines et d'autres composés, qui se déplacent dans le flux phloème. Ces composés sont ensuite transportés dans l'élément de tamis par l'intermédiaire d'plasmodesmata et peuvent fonctionner en tant que signal d'appel interurbain ^4,16.

Plusieurs groupes de composés peuvent être trouvés dans les exsudats phloème:

• Les sucres sont souvent les produits de la photosynthèse et sont transportés comme des molécules "énergie-transport" vers d'autres parties de la plante pour le stockage ou comme blocs de construction. Toutefois, ils peuvent également fonctionner comme antigel ou de signalisation des composés.
• Les protéines peuvent également être trouvés dans les exsudats phloème. Ils comprennent des enzymes métaboliques, mais aussi fonction ont de signalisation. Un example d'une protéine qui sert de signal de développement est le locus T protéine de floraison, qui signale l'induction de la floraison, ainsi que l'abscission des feuilles des plantes saisonnière à ^6.
• Les acides nucléiques sont présents dans les exsudats phloème sous la forme d'ARNm, les petites et les micro ARN et ARN viraux. Ils semblent être largement impliquées dans la signalisation ^{27, 28, 39.} Dans le même temps, ARNr et ARNt pour presque tous les acides aminés ont été observés dans la sève des cucurbitacées ^42. Ils apparaissent à transférer sélectivement dans le système de tube tamis. Les ARNt montrent modifications nécessaires à la possibilité de transférer des acides aminés à l'appareil translationnelle. Pourtant, plutôt que de participer à la traduction, ils semblent inhiber ce processus. Alternativement, ils pourraient servir de source de cytokine ou signaler l'état métabolique de la plante ^42.
• Acides gras, oxylipines, et d'autres lipides ont également été trouvés dans le phloème exsudats ^{3, 13, 14, 23.} Jasmoacide nic, un oxylipines se déplace à travers le phloème dans le cadre de la réponse à l'infection pathogène ^{22, 29, 31, 32.} Bien que le rôle de la plupart des lipides du phloème n'est pas encore clair, certains d'entre eux ont probablement fonction de signalisation ^4.

Le défi de travailler avec le phloème de la plante réside dans sa capacité à se sceller sur blessure. Il existe quatre grandes méthodes utilisées pour recueillir les exsudats phloème, mais ils ne fonctionnent que dans certaines espèces:

1) Dans les cucurbitacées, il est possible d'obtenir des quantités raisonnables de phloème exsudat par des coupures du pétiole. Une fois que la baisse initiale de la contamination de cellules lésées est supprimé, il est possible d'obtenir assez grandes quantités de pur sève ^{1, 15.} Cependant, avec l'augmentation du temps de collecte, ce exsudat s'épaissit, ce qui rend de plus en plus inadapté aux approches de chromatographie liquide (non publié). Des publications récentes suggèrent que selon les espèces, cette sève est dérivé de either la fasciculée (FP) ou le extrafasciculaire phloème (EP) et que, s'il contient "mobile" sève élaborée à partir des éléments tamis (FP), il est aussi sujette à la contamination par d'autres types de cellules, y compris le xylème ^{40, 41} .

2) Une deuxième approche consiste à obtenir sève élaborée par des coupures peu profondes ou des perforations dans la tige ou pétiole. Cette méthode a été utilisée avec succès dans lupin ^{17, 25, 36} cucurbitacées, et Brassica napus ^12. Ici, la contamination de cellules lésées est minime et les exsudats très pure. Cependant, les plantes ont besoin pour être en bonne santé et bien arrosée, car il est très difficile de percer sélectivement seulement les éléments de tamis. Si vaisseaux du bois sont entaillés, tout exsudat est aspiré dans le flux de xylème. Cela rend la méthode inadaptée pour les plantes à tiges ou les pétioles très fragiles et très lignifiées.

3) stylectomy de puceron pucerons permet d'insérer leur stylet dans les tubes criblés dun enlevant le puceron avec un laser. Sève est sécrétée par le reste stylet ^{2, 9, 10, 35, 38.} En théorie, toute plante qui peut être infecté par des pucerons peut être utilisé pour cette approche. Cependant, la plupart de serre ou managers en chambre de croissance ne seront pas en charge l'utilisation d'un agent pathogène. En outre, les pucerons introduisent plusieurs protéines dans le phloème avec leur salive ^{19, 33.} Cela conduit à une reprogrammation ³⁰ transcriptionnelle limitée et a le potentiel de changer la composition du phloème ^26.

4) La méthode décrite ici est l'exsudation EDTA facilité de sève. Cette méthode utilise l'EDTA pour prévenir étanchéité du phloème ^20. EDTA chélate ions Ca ^{2 +} qui participeraient autrement dans les processus qui scellent le phloème. Alors que l'EDTA peut conduire à des dommages cellulaires ^30, plusieurs groupes ont utilisé cette méthode et observé aucun effet indésirable des concentrations d'EDTA de 10 à 20 mm sur l'ultrastructure cellulaire ou sur phloem chargement et le transport ^{5, 24.} Pour réduire les effets dommageables ainsi que l'interférence de l'EDTA par chromatographie et électrophorèse sur gel, les plantes sont déplacés dans l'eau après 1 h et uniquement la partie postérieure de l'exsudat est utilisé ^14. Ainsi, plutôt que exsudation dans de l'EDTA, du phloème est exudated dans l'eau (exsudation EDTA-animé). C'est une méthode straight-forward, à faible coût et de faible technicité pour la collecte des exsudats phloème. Sève obtenu de cette manière peut être utilisée pour analyser les protéines, petites molécules, des lipides et des ARN et a été utilisé avec succès dans de nombreuses plantes. Malgré le nombre limité d'expériences a été effectuée chez les monocotylédones ^11, la méthode semble être plus approprié pour les dicotylédones (Perilla ^{17, 20,} Arabidopsis ^{8, 13, 14,} Poplar ^7). Collection d'exsudats doit se produire dans un environnement humide pour éviter les pertes d'exsudats par la transpiration. En fonction de la plante, l'incubation dans de l'EDTA pour une à deux heures estsuffisante pour empêcher l'étanchéité des éléments du phloème / tamis. La collection peut alors se produire dans l'eau. Ceci a l'avantage d'éviter l'effet négatif EDTA a sur la structure et la stabilité cellule. Il élimine aussi les interférences de l'EDTA avec des méthodes telles que HPLC ou SDS-PAGE. Il est représenté tel qu'il s'applique aux Arabidopsis. Pour les grandes installations, l'incubation dans de l'EDTA et l'exsudat collections doit être intensifié et est effectuée dans des béchers plutôt que dans 1,7 tubes de réaction ml.

1. Préparation des plantes

1. Graines d'Arabidopsis peuvent être mises à germer directement sur ​​le sol ou sur des plaques de SEP. Cultiver les plantes pour quatre à six semaines dans des chambres de croissance avec une photopériode de 12 heures (22 ° C le jour, 15 ° C la nuit ^14). Arrosez les plantes une à deux fois par semaine. Utilisez le tiroir du bas pour l'arrosage, ne pas les plantes aquatiques à partir du haut; permettent aux plateaux sécher avant de re-arrosage. Assurez-vous que les plantes sont bien hydratés au moment de la récolte.

2. Préparation des solutions et plats

1. Solution _2-EDTA K: Faire une solution 100 mM K _2-EDTA solution actions, qui peut être conservé au réfrigérateur. Le jour de la collecte, diluer la solution à un à cinq (une solution EDTA partie, quatre parties d'eau) pour obtenir une solution 20 mM de _2-EDTA K.
2. Remplir un verre ou une boîte de Pétri (diamètre 7-15 cm) à mi-chemin avec le 20 mm solution _2-EDTA K. Si la collecte d'échantillons de différents traitements (par explantes sel de stress ou de différents génotypes ample contrôle et), préparent des plats séparés pour chaque traitement.
3. Remplissez nombre désiré de 1,7 tubes de réaction ml à 1,4 ml de solution à 20 mM K _2-EDTA. Remplir un nombre égal de tubes de réaction avec 1,4 ml d'eau désionisée ou autoclavés Millipore.
4. Mettez des serviettes en papier sur le banc de mettre des plantes sur; obtenir une lame de rasoir neuve et mettre des gants.

3. Collection de phloème exsudats (représentée dans le diagramme de la figure 1)

1. Rosette de récolte feuilles de quatre à six semaines d'âge plantes en les coupant avec la lame de rasoir à la base du pétiole à proximité du centre de la rosette.
2. Immédiatement placer les feuilles dans les boîtes contenant 20 mM K _2-EDTA. Assurez-vous que la fin de la coupe du pétiole est immergée dans la solution (Figure 2).
3. Une fois 15 feuilles ont été collectés (environ trois à quatre plantes), empiler les feuilles délicatement sur le dessus de l'autre de telle tpétioles le chapeau de coupe sont alignés les uns avec les autres. Retailler la base des pétioles (environ 1 mm) et de transférer immédiatement les feuilles dans l'un des tubes de réaction avec la solution de 20 mM de K-EDTA _2. Les feuilles correspondent plus facile si elles sont légèrement retroussées. Éviter de serrer les feuilles en ce qui risque de causer des blessures des cellules et, par conséquent, conduit à la collecte du contenu des cellules de la feuille.
4. Si plus de matériel est nécessaire, couvrir soigneusement les échantillons avec une serviette en papier humide. Utilisez une nouvelle série de plats si pour la collecte des échantillons de différents traitements ou des génotypes.
5. Une fois que tous les échantillons sont placés dans des tubes de réaction, de recueillir les exsudats soit dans l'obscurité ou à la lumière.
6. Pour la collecte dans l'obscurité, la ligne-de-chaussée d'un grand plat peu profond avec des serviettes en papier humide. Placer la grille avec les tubes de réaction feuilles remplies dans le plat et couvrir soit avec du papier absorbant humide ou le mettre dans un dos en plastique noir avec des fentes pour l'aération. Placez l'ensemble du montage dans une armoire ou une pièce sombre.
7. Pour la collecte, à la lumière, tapisser le fond d'un récipient en plexiglas transparent avec des serviettes en papier humide. Placer la grille avec les tubes de réaction remplis de feuilles dans le bac et fermez-le.
8. Après 1 heure, enlever les feuilles doucement à partir du conteneur et des tubes de réaction et laver abondamment avec de l'eau distillée, déminéralisée ou Millipore pour enlever toute EDTA. Cette étape sert trois objectifs: (1) il élimine le EDTA à minimiser les dommages aux cellules, (2) il élimine l'interférence de l'EDTA avec SDS-PAGE et la chromatographie, et (3) supprime tous les composés qui se sont accumulés depuis cut / endommagé cellules. Transférer immédiatement dans les tubes de réaction préparés contenant de l'eau autoclave et revenir aux conteneurs de collecte humidifiés pour la collecte des exsudats. À ce stade, ajouter inhibiteur de RNase si l'exsudat doit être utilisé pour l'extraction d'ARN. En option: inhibiteur de protéinase peut être ajouté si l'analyse des protéines est souhaitée.
9. Après le temps de collecte destiné, sortez et DISCAe les feuilles et geler les exsudats de phloème dans _N2 liquide pour une utilisation ultérieure. Si un stockage prolongé est nécessaire, lyophiliser les échantillons et les conserver à -80 ° C.
10. Dans le cas d'Arabidopsis, métabolites peuvent déjà être détectés après la collecte des exsudats pendant 1 heure. Toutefois, la collecte de 5-8 heures est conseillé si l'analyse des composants moins abondantes sont prévues. Pour les grandes installations, comme Perilla, les délais de recouvrement plus longs (8 h) sont recommandés.
    Exsudat recueilli à partir de 15 feuilles est généralement suffisant pour une voie sur un gel SDS-PAGE (protéines), pour l'extraction de l'ARNm, GC-MS (sucres et de métabolites). Pour l'analyse des lipides la mise en commun de 2-3 échantillons (exsudat de 30 à 45 feuilles) est recommandée et conduit à des résultats plus clairs.

4. Une analyse ultérieure (pour la vidéo Nous n'indiquons que les 4.4)

1. Pour l'analyse des protéines, échantillon remettre en suspension dans 15 pi d'eau et de tampon Lämmli 30 ul, de la chaleur à 95 ° C pendant 5 min, rapidement Isoler tout precipitates et charger ensemble de l'échantillon sur un gel SDS-PAGE (45 poches de chargement pi). Les échantillons doivent être colorées avec Coomassie colloïdal ou d'autres taches sensibles depuis abondance de protéines est très faible.
2. Pour le sucre et les petits analyse des métabolites, ajouter des agents de dérivation de l'échantillon séché comme décrit dans la littérature ^14.
3. ARNm peut être analysée par RT-PCR, puces à ADN ou l'analyse d'ARN-Seq.
4. Pour l'analyse des lipides piscine immédiatement deux à trois échantillons et cloisons contre chloroforme: methanol (1:1) dans la hotte comme suit: ajouter une quantité égale de chloroforme et de methanol à chaque échantillon, vortex pendant quelques secondes, et centrifuger pendant 4 min à 400 x g. Recueillir la phase inférieure (organique) dans un tube en verre avec bouchon en téflon et la partition de répétition de la phase supérieure de plus de trois fois. Sécher les phases organiques réunies sous un courant de N ₂ et de soumettre à une analyse (chromatographie sur couche mince: TLC ^{14, 37;} liquide spectrométrie de masse à: LC-MS ^14).

Il est devenu évident au cours des dernières années que la complexité de la sève peut être la réponse à la question de savoir comment les plantes envoient différents signaux de développement et de stress pour une réponse optimale. En utilisant l'EDTA facilité exsudation phloème peut fournir l'occasion d'analyser les exsudats phloème de plantes qui ne conviennent pas à d'autres approches, mais peut-être un intérêt économique ou physiologique.

Cette méthode permet la récolte de suffisamment phloème exsudats pour identifier les protéines phloème localisés et détecter des changements dans leur niveau en réponse au développement ou de stress (figure 3). Comme le montre la figure, les protéines sont en très faible abondance, et pourtant, leur niveau est suffisamment élevé pour des expériences de protéomique ultérieures par LC-MS/MS ou pour l'analyse de Western blot. Les conclusions de cucurbitacées suggèrent que la coupe de la tige entraîne une perturbation de l'équilibre du potentiel de l'eau et un afflux ultérieur de l'eau etcontaminants possibles du apoplaste 41. Pourtant, la collecte des temps allant de un à huit heures n'affecte pas le profil du phloème de protéines / composition chez Arabidopsis (. Seulement la quantité absolue varie Guelette et al), la quantité de protéines recueillies et le modèle de protéines trouvées varie selon les espèces (Arabidopsis: Au; Perilla, voie I et NI) et les traitements (Perilla cultivé à différentes longueurs de jour, voie I et NI). En tant que signaux protéiques de résultats peuvent être visualisés, identifiés et suivis.

ARNm et micro ARNs peuvent également être identifiés dans les exsudats phloème par cette méthode. Cependant, le traitement avec un inhibiteur de la RNase est nécessaire pour éviter la dégradation de l'ARNm pendant le temps d'exsudation prolongée. Comme les éléments tamis ne contiennent pas de chloroplastes fonctionnels, Rubisco petite ou grande sous-unité (hématies ou RbcL, respectivement) ARNm peuvent être utilisés comme témoins négatifs, tandis connu phloème-ARNm localisée comme enzyme de conjugaison de l'ubiquitine peut être utilisé comme un témoin positif (figure 4).

De même, les sucres ou les petits métabolites peuvent être analysés en utilisant soit GC-MS ou LC-MS. Ici, il convient de mentionner que les exsudats de phloème contiennent un grand nombre d'enzymes fonctionnelles, y compris la quasi-totalité glycolyse 12. Ainsi, en utilisant plusieurs points dans le temps peut révéler les processus métaboliques lors de la collecte exsudat. Un exemple est illustré à la figure 5: Dans tous les exsudats, le saccharose est le métabolite le plus abondant, ce qui est le plus évident après une collection pendant 1 heure. Toutefois, après cinq heures du saccharose rapport fructose est légèrement réduite. Si le même exsudat est collecté pendant une heure et laissé sur le banc pour les quatre prochaines heures, le saccharose et de fructose ratio est réduit à une mesure beaucoup plus importante, ce qui suggère que les enzymes actives dans le phloème exsudats conduire à une dégradation du saccharose à température ambiantetempérature (pour plus d'interprétations de pointe voir 14). Ceci est cohérent avec les résultats que phloème chargement et le transport des molécules à partir de cellules compagnes dans les éléments de tamis peuvent continuer pendant exsudation jusqu'à ce que le système perd de sa vitalité 34.

Lipides dans les exsudats phloème et, par extension, de la signalisation des lipides à longue distance sont un domaine relativement récent de l'intérêt pour la science des plantes. En raison de leur nature hydrophobe des lipides ne sont présents en faibles concentrations et peuvent être liés à d'autres molécules de solubilisation. Pourtant, l'exsudation EDTA facilité permet la collecte de suffisamment de matière pour visualiser (TLC; Figure 6) et d'identifier (LC-MS; Figure 7) lipides phloème de plusieurs espèces de plantes. Comme la figure montre qu'il est possible d'identifier et de séparer plusieurs espèces de lipides. LC-MS permet d'identifier les différentes espèces de lipides et de suivre les changements dans les profils lipidiques des différegénotypes NT ou traitements. Cela permet pour l'étude du rôle des lipides au cours du développement de la plante et la réponse au stress.

Figure 1. Organigramme de la collection du phloème exsudats d'Arabidopsis ou Perilla. Différents chemins mènent à différents produits finis, qui sont indiqués en bleu. Pour la préparation de l'ARN, un inhibiteur de RNase (100 U / ml, Roche) est ajouté à l'eau dans laquelle l'exsudat phloème est recueilli.
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Figure 2. Installation de matériaux pour le phloème exsudat recueillird'ions. Le setup affiche tous les matériaux nécessaires pour le protocole étapes 3.1-3.4.
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. Figure 3 protéines trouvées dans le phloème exsudats de deux espèces différentes de plantes, Arabidopsis (AT) et Perilla (I et NI; différentes longueurs de jour); MW: marqueurs de poids moléculaire (piste 2). Les protéines ont été séparées à l'aide d'un gradient de 10 à 20% SDS-PAGE.
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Figure 4. Analysede la présence d'ARNm de la Rubisco petite et grande sous-unité (hématies et RbcL, respectivement) et de l'enzyme de conjugaison de l'ubiquitine (UCB). L'ARNm a été recueilli à partir des feuilles d'Arabidopsis (L), les pétioles (P), et les exsudats du phloème (Ph), inverser les transcriptions transcrits et spécifique visualisés à l'aide de PCR. Le chiffre a été modifié à partir de Guelette et al. 14.
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Figure GC-MS profil de phloème 5. Exsudats recueillis montant différent de fois. On notera que la quantité relative des changements de saccharose de 1 heure de collecte (A) à 5 heures de temps de collecte (B). Exsudat profil après la collecte pendant 1 heure suivie de «incubation» à la salle température (RT) pendant quatre heures, (C). profil des métabolites de la feuille (D).
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Figure 6. Couche mince chromatogramme comparant les lipides de Perilla (à gauche) et les feuilles d'Arabidopsis (à droite) et les exsudats de phloème. Les astérisques indiquent les lipides spécifiques pour exsudats phloème. DGDG: digalactosyldiacylglycérol; PG: phosphatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol, la partie de la figure montrant lipides Arabidopsis a été modifié depuis Guelette et al. 14.
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