L'isolement et la caractérisation fonctionnelle de Human ventriculaire cardiomyocytes à partir des échantillons chirurgicaux frais

Summary

Les connaissances actuelles sur la base cellulaire de maladies cardiaques repose principalement sur des études sur des modèles animaux. Nous décrivons ici et valider une nouvelle méthode pour obtenir des cardiomyocytes viables simples de petits échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire humaine. Myocytes ventriculaires humains peuvent être utilisés pour des études électrophysiologiques et le dépistage des drogues.

Abstract

Cardiomyocytes de coeurs malades sont soumis à des processus de remodelage complexes impliquant des changements dans la structure de la cellule, le couplage excitation contraction et les courants ioniques membranaires. Ces changements sont susceptibles d'être responsable de l'augmentation du risque arythmogène et les altérations contractiles conduisant à un dysfonctionnement systolique et diastolique chez les patients cardiaques. Cependant, la plupart des informations sur les modifications de la fonction des myocytes cardiaques dans les maladies est venu à partir de modèles animaux.

Nous décrivons ici et valider un protocole d'isoler les myocytes viables de petits échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire de patients subissant des opérations de chirurgie cardiaque. Le protocole est décrit dans le détail. Les mesures de calcium intracellulaires et électrophysiologiques sont rapportés à démontrer la faisabilité d'un certain nombre de mesures de cellules simples dans des cardiomyocytes ventriculaires humains obtenus avec cette méthode.

Le protocole a signalére peuvent être utiles pour des enquêtes futures de la base cellulaire et moléculaire des altérations fonctionnelles du cœur humain en présence de différentes maladies cardiaques. En outre, cette méthode peut être utilisée pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques au niveau cellulaire et pour tester l'efficacité de nouveaux composés sur des cardiomyocytes humains, avec une valeur de translation direct.

Introduction

Dissection des propriétés électrophysiologiques du myocarde a progressé de façon marquée après la mise au point de techniques pour seule isolation des myocytes cardiaques. Les récents progrès dans la compréhension de la contraction cardiaque excitation Coupling (CE-Coupling) ont également été rendue possible par la capacité d'isoler des cardiomyocytes viables simples qui conservent toutes les propriétés physiologiques des tissus intacts. Procédés de patch-clamp sont couramment utilisées pour étudier la fonction et la modulation pharmacologique des courants ioniques sarcolemmiques cardiaque. Les enregistrements de la dynamique du calcium intracellulaire avec Ca

Protocol

Les protocoles expérimentaux sur des tissus humains ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Careggi-Hôpital (2006/0024713; renouvelé mai 2009). Chaque patient a donné son consentement éclairé.

1. Solutions et Préparation du matériel

Les solutions sont décrites dans le tableau 1. Un organigramme simplifié de la procédure d'isolement des cellules est constaté sur la figure 1.

Solution

CP

DB

KB

TB

PS

EB1

....

Results

La méthode décrite ci-dessus a été utilisé pour caractériser les anomalies fonctionnelles des cardiomyocytes isolés du septum interventriculaire des patients atteints de cardiomyopathie hypertrophique (CMH) qui ont subi une opération de myectomie, par rapport aux patients défaut hypertrophiques non non chirurgicaux ^21. Les résultats présentés dans cette section sont dérivées à partir de ce travail ²¹ et sont représentés ici comme un exemple de comment cette technique peut être utilisée pour caracté.......

Discussion

Nous avons décrit et validé une méthode pour isoler les myocytes viables à partir d'échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire humaine. A partir de protocoles décrits précédemment qui avaient été utilisées avec succès pour des cellules isolées à partir d'échantillons chirurgicaux auriculaire, la technique pour permettre la séparation des myocytes viables simples du malade myocarde ventriculaire a été développé et affiné. Les premiers rapports ont montré que l'isolement des cardiomyocytes simples à p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Sulfate de magnésium heptahydraté(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adénosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Hydroxyde de potassium (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Bicarbonate de potassium (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Pyruvate de sodium	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Hydroxyde de sodium(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Acide glutamique monopotassique sel monohydraté	Sigma-Aldrich	49601
Acide pyruvique	Sigma-Aldrich	107360
3-Acide hydroxybutyrique	Sigma-Aldrich	166898
Adénosine 5&prime ;-triphosphate sel dipotassique dihydraté (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Acide succinique	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumine du sérum bovin	Sigma-Aldrich	A0281
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagénase de Clostridium histolyticum, type V	Sigma-Aldrich	C9263
Protéinase bactérienne de type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Solution de chlorure de calcium, ~1 M dans H2O	Sigma-Aldrich	21115
Chlorure de calcium 0,1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Méthanesulfonate de potassium	Sigma-Aldrich	83000
Réactif FluoForte	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Concentré Powerload, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotéricine B solubilisée	Sigma-Aldrich	A9528
Amplificateur patch-clamp Multiclamp 700B	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0  ;	Le
			dispositif est fabriqué sur mesure dans notre laboratoire à l’aide de tubes en plastique, de Sylgard moulé et d’un moteur ; il est décrit en détail dans la figure 1C-1D et dans la figure 7. Nous pouvons vous fournir plus de détails si nécessaire.
Élastomère de silicone pour les brosses de l’appareil de digestion	Dow Corning	SYLGARD® ; 184
Moteur rotatif à vitesse variable pour l’appareil de digestion	Crouzet Crouzet	178-4765
Moule pour coulée de brosses	N.A.	N.A.	Le moule est fabriqué sur mesure à partir de tiges standard en PTFE de 2,5 cm de diamètre.