Article de méthode

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

DOI :

10.3791/51138

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5 février 2014

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1Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Neurobiology and Anatomy, University of Utah School of Medicine, 3Interdepartmental Program in Neurosciences, University of Utah School of Medicine, 4Mutation Generation and Detection Core, HSC Core Research Facility, University of Utah School of Medicine, 5Department of Neurology, University of Utah School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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PCR combinée à l'analyse de fusion à haute résolution (AGRH) est démontré comme une méthode rapide et efficace de déterminer le génotype du poisson zèbre.

Résumé

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Le poisson zèbre est un système de modèle vertébré puissant pour étudier le développement, la modélisation de la maladie, et en effectuant le criblage de médicaments. Récemment, une variété d'outils génétiques ont été mis en place, y compris des stratégies multiples pour induire des mutations et de générer des lignées transgéniques. Cependant, le dépistage à grande échelle est limitée par des méthodes de génotypage traditionnels, qui prennent beaucoup de temps et de main-d'œuvre. Nous décrivons ici une technique pour analyser les génotypes de poisson zèbre par PCR combinées avec l'analyse à haute résolution fusion (AGRH). Cette approche est rapide, sensible et peu coûteux, avec un risque plus faible d'objets de contamination. Le génotypage par PCR avec HRMA peut être utilisé pour des embryons ou des poissons adultes, y compris dans des protocoles de criblage à haut débit.

Introduction

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Poisson zèbre (Danio rerio) est un système de modèle vertébré largement utilisé pour les études de développement et de modélisation de la maladie. Récemment, de nombreuses technologies transgéniques et de mutation ont été développés pour le poisson zèbre. Techniques de transgénèse rapides, généralement basés sur un système de transposon Tol2 1, ont été combinées avec une amélioration des options de clonage multiple pour l'assemblage de fragments d'ADN 2. Nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) ont été utilisées pour cibler les lieux dans les cellules somatiques et germina....

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Protocole

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Une. Préparation de l'ADN

  1. Préparer le tampon de lyse de l'ADN: 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Ajouter fraîche protéinase K à une concentration finale de 1 mg / ml le jour de l'utilisation 12.
  2. collecte des tissus:
    1. Pour adultes pince poisson nageoire:
      1. Anesthésier les poissons: Placer le poisson dans 0,004% MS-222 (tricaine) solution. Attendez jusqu'à ce que le mouvement des branchies ralentit.
      2. Mettez le poisson sur une pile de 5-10 Kimwipes et couper un petit morceau de la nageoire caudale, environ 2-3 mm, avec une lame de rasoir stérile.
      3. Placer r....

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Résultats

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Le protocole peut être effectué pendant une seule journée ou dans des étapes séparées sur plusieurs jours (diagramme de flux de travail est représentée sur la figure 1). extraction de l'ADN est suivie par la fusion et l'analyse des amplicons PCR. Les températures pour la fusion de l'amplicon dépendent de la taille et de GC-contenu, mais en général, et de commencer à des températures de 50 ˚ C et 95 ˚ C terminales sont appropriées (figures 2A et 2B). Une fois que la mass.......

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Discussion

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PCR combinée avec HRMA est une technologie puissante pour le génotypage du poisson zèbre. Les avantages de cette approche sont sa vitesse, la robustesse et la sensibilité à détecter même des mutations ponctuelles. L'ensemble du protocole, à partir de la cassette d'analyse ailette pour faire fondre la courbe, peut être effectuée en moins de huit heures par une seule personne. De plus, la technique est susceptible de criblage à haut débit, ne nécessite pas l'utilisation de bromure d'éthidium, et est scellé.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous remercions les membres des Blaschke, Grunwald, et Wittwer laboratoires pour obtenir des conseils et une assistance technique. Ce travail est soutenu par la Fondation PCMC, NIH R01 MH092256 et DP2 MH100008, et le Mars de Dimes Foundation subvention de recherche n ° 1-AF13-425, à JLB.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 Reaction LightScanner Master MixBioFireHRLS-ASY-0002www.biofiredx.com
Plaques PCR 96 puits BLK/WHT LaboratoriesBio-RadHSP9665www.bio-rad.com
Joints adhésifs Microseal 'B'Bio-Rad LaboratoriesMSB1001www.bio-rad.com
96-well LightScanner InstrumentBioFireLSCN-ASY-0040www.biofiredx.com
Logiciel LightScanner avec Call-IT 2.0BioFirewww.biofiredx.com
Analyse de fusion haute résolution 2.0BioFirewww.biofiredx.com
LightScanner Primer Design SoftwareBioFirewww.biofiredx.com
Vector NTISoftware Invitrogenwww.invitrogen.com
Tricaine
paraformaldéhyde

Références

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  1. Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  2. Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al.

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Mots-clés

Zebrafish GenotypingPCR AnalysisHigh resolution MeltDNA ExtractionMelt Curve AnalysisGenotyping ProtocolFluorescent ProbePCR CyclingTemperature NormalizationGenotype Detection

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