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Logement des animaux et de l'euthanasie: Tous les animaux utilisés à cette manifestation ont été logés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes, conformément aux lignes directrices de l'entretien et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) et l'Institut national de la santé (NIH).
Offrir aux animaux pour rats dur culot standard et de l'eau ad lib. Euthanasier les animaux par une méthode en deux étapes de dioxyde de carbone asphyxie, thoracotomie bilatérale en conformité avec le protocole standard de l'UCSF approuvé par IACUC. Effectuer des tests biomécaniques dans les 24 heures de sacrifice d'animaux pour éviter la dégradation des tissus.
Une. Préparation et Dissection d'une mandibule ou maxillaire Rat
- Retirer mandibules de rat en coupant délicatement les pièces jointes de tissus et de tissus musculaire membraneuses tout en préservant l'ensemble mandibule, y compris le processus coronoïde et le condyle (figure 1) 15.
- Hemimandibles séparés en voitureefully couper le tissu fibreux de la symphyse mandibulaire avec une lame de scalpel.
Remarque: Les processus coronaires et condyliennes et branche de la mandibule (figure 1) devraient être supprimés s'ils gênent physiquement tests biomécaniques de la 2 ème molaire. - Couper les incisives sans exposer la chambre pulpaire à ne pas gêner le chargement de la molaire.
2. Préparation des échantillons in situ pour la compression chargement (Figure 2)
- Immobiliser l'échantillon sur un talon de l'acier en utilisant un matériau qui est sensiblement plus rigide que les échantillons expérimentaux avant de le charger dans un dispositif de chargement in situ (Figure 2A) dans.
Remarque: polyméthacrylate de méthyle (PMMA) a été utilisé pour immobiliser l'échantillon de cette étude et l'excès, le cas échéant, a été éliminé en utilisant un explorateur dentaire. - Aligner la surface occlusale de la molaire (s) d'intérêt parallèlement à la platine métallique AFM aide d'une règle à la foisplans (c.-à-mésiodistale et bucco-lingual).
- Créer un creux avec un objet contondant entourant les molaires.
Note: Cet espace doit servir de "fossé" pour contenir le liquide en excès et maintenir l'hydratation des tissus pendant le chargement in situ. - Préparer la surface de la dent à s'accumuler pour concentrique (figure 2B) ou excentrique (figure 2C) en utilisant un chargement composite dentaire. Graver la surface de la dent d'intérêt avec un gel d'acide phosphorique à 35% sur la surface de mastication pendant 15 s.
- Rincer l'agent de gravure à l'eau désionisée et sécher la surface à l'aide d'une seringue air / eau ou une cartouche à air comprimé. Avec un explorateur, répandre une goutte de l'agent de liaison en pointes ouvertes dans une couche mince. Traiter le composite avec une lampe à polymériser dentaire.
Remarque: Toutes les étapes impliquant composites devraient être exécutées sans lumière directe d'une lampe. Ces conditions non souhaitable d'accélérer le processus de polymérisation, et could empêcher le positionnement correct du composite. éclairage de la pièce est acceptable. - Éliminer l'agent de liaison en excès de dents adjacentes avec un scalpel amende ou une lame de rasoir.
- Placez composite dentaire fluide sur la surface suite à la préparation de la surface et l'étaler dans les rainures de la molaire (s) d'intérêt en utilisant un explorateur dentaire.
- Exposer le composite à la lumière de durcissement dentaire pendant 30 secondes.
- Mouler une accumulation d'occlusion de l'ordre de 4.3 mm en utilisant une résine composite dentaire, à partir du plan d'occlusion de la molaire (s) d'intérêt et photopolymériser pendant 30 sec.
- Réduire le haut de l'accumulation composite sur une surface plane parallèle pour permettre un système de chargement uniforme dans tous les échantillons à l'aide d'une règle et une pièce à main haute vitesse.
Remarque: Lors de tests biomécaniques, d'autres échantillons doivent être stockés dans tris-solution tamponnée au phosphate (SCT) avec 50 mg / ml de pénicilline, la streptomycine et 15.
3. Chargement dérive de l'appareil etRigidité, Matériel propriété de différenciation des capacités, in situ Chargement de la commune Fort
- Fixer le spécimen avec l'accumulation de synthèse sur l'enclume de l'étage de chargement, et le test de charge uniforme comme le montre la figure 2B.
- Placez un papier à articuler sur la surface du composite suivi d'un chargement de l'échantillon à une charge finie pour vérifier le chargement concentrique ou excentrique (figures 2B et 2C).
- Placez Kimwipe SCT trempé dans l'échantillon pour assurer spécimen hydratation. Faire un creux autour de l'échantillon et de le remplir avec le SCT pour maintenir l'organe hydraté pendant l'imagerie.
- une pointe de charge d'entrée et la vitesse de déplacement dans le logiciel Deben pour comprimer la molaire à une charge de crête souhaité à une vitesse de déplacement suivant l'immobilisation du hemimandible.
Remarque: lectures typiques devraient inclure une charge réactionnaire que le matériau est comprimé au cours du temps (sensibilité du capteur de charge = 0,1N). De charge-temps et le déplacement en temps, une courbe charge-déplacement pour le matériau comprimé doit être obtenu 16-18. En utilisant les données recueillies à partir des cycles de chargement, diverses propriétés du joint peuvent également être déterminés. La raideur de l'articulation doit être calculée en prenant la pente de la partie linéaire (environ le dernier 30% de données) de la phase de chargement de la charge en fonction de la courbe de déplacement 19.
4. La coloration des tissus mous, le PDL, avec de l'acide phosphotungstique (PTA)
Remarque: Pour améliorer X-ray atténuation revanche, le PDL doit être coloré avec une solution de PTA de 5% 20.
- Solution de coloration remblai PTA dans un récipient propre de 1,8 ml de cartouche en verre et placer de cartouche chargée dans la seringue.
- Injecter la solution lentement (5 min / de cartouche) dans l'espace PDL des dents adjacentes pour empêcher des dommages structurels aux tissus parodontaux molaire d'intérêt environnants.
Remarque: Les étapes ci-dessus devraient be répété jusqu'à environ 5 carpules plein (9 ml) de solution sont injectés et autorisé à circuler dans les tissus environnants. Les spécimens prepped peuvent également être trempées pendant une nuit dans la solution d'ATP restant (8 h).
5. Paramètres de numérisation μ-XCT recommandés
Effectuer m-XCT avec les paramètres de numérisation suivants:
| Grossissement de l'objectif | 4X, 10X |
| 1800 images |
| X-ray tension du tube | 75 kV (50 kV pour les échantillons de la ZEP souillé) |
| 8 W |
| Temps d'exposition | ~ 8-25 sec * |
| ~ 4 pm (objectif 4X), ~ 2 pm (objectif 10X) ** |
* Le temps d'exposition peut varier en fonction de la géométrie et de la densité optique de l'échantillon et de tube à rayons X voltage.
** Pixels de résolution réelle sera légèrement différer en fonction de la configuration de la source, l'échantillon, et le détecteur.