Un procédé de précipitation modification pour isoler les exosomes urinaire

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole permettant d’isoler les exosomes de l’urine humaine à l’aide d’une technique de précipitation modifiée.

Résumé

L’identification de biomarqueurs permettant la détection précoce des maladies rénales dans l’urine et le plasma est un domaine d’intérêt actif depuis plusieurs années. Les vésicules d’exosomes urinaires, d’une taille de 40 à 100 nm, sont libérées dans l’urine dans des conditions normales par les cellules de tous les segments de néphron et peuvent contenir des protéines, des ARNm et des microARN représentatifs de leur type d’origine cellulaire. Dans des conditions de dysfonctionnement ou de lésion rénale, les exosomes peuvent contenir des proportions modifiées de ces composants, qui peuvent servir de biomarqueurs de la maladie. Il existe actuellement plusieurs méthodes disponibles pour l’isolement des exosomes urinaires, et nous avons déjà effectué une comparaison expérimentale de chacune de ces approches, dont trois basées sur l’ultracentrifugation, l’une utilisant un concentrateur d’ultrafiltration à nanomembrane, l’autre utilisant un réactif de précipitation commercial et la dernière utilisant une modification de la technique de précipitation à l’aide du réactif ExoQuick que nous avons développé dans notre laboratoire. Nous avons constaté que la méthode de précipitation modifiée produisait le rendement le plus élevé de particules d’exosomes, de miARN et d’ARNm, ce qui rend cette approche adaptée à l’isolement des exosomes pour le profilage ultérieur de l’ARN. Nous concluons que la méthode de précipitation des exosomes modifiés offre une alternative rapide, évolutive et efficace pour l’isolement des exosomes de l’urine. Dans ce rapport, nous décrivons notre technique de précipitation modifiée à l’aide du réactif ExoQuick pour isoler les exosomes de l’urine humaine.

Introduction

Exosomes urinaires sont de petites vésicules internes de 100 nm de corps multivésiculaires (MVB) provenant de tous les types de cellules dans des conditions normales et pathologiques dans l'espace urinaire y compris podocytes glomérulaires, les cellules des tubules rénaux et les cellules qui tapissent les systèmes de drainage urinaire qui semblent être enrichi pour miARN ^{1 -2.} De nombreux chercheurs ont détecté des protéines distinctes dans exosomes isolés à partir de l'urine d'individus sains ainsi que ceux atteints d'insuffisance rénale et / ou de maladies systématiques ^3-5. Les exosomes peuvent être isolés en utilisant différentes méthodes telles que deux étapes ultracentrifugation différentielle avec ou sans saccharose ^6-7, combinant filtre nanomembrane avec ultracentrifugation ^{8-9, 10-11} ou précipitation. Nous avons récemment développé une méthode simple, rapide, évolutive et efficace pour isoler les exosomes urinaires et de détecter les miARN et des biomarqueurs protéiques ^11. Bien que les biomarqueurs peuvent être détectés dans une variété de différents fluides biologiques, urine est le choix le plus pratique pour les patients atteints de maladies du rein et des voies urinaires, car il peut être obtenu en grandes quantités d'une manière relativement non invasive.

Bien qu'il existe plusieurs méthodes pour isoler les exosomes urinaires ^6-11, le procédé le plus couramment utilisé dépend ultracentrifugation différentielle avec un coussin de saccharose à 30%. Bien que cette méthode soit efficace et la qualité des exosomes isolés résultant de cette procédure est élevée, la technique elle-même requiert un personnel qualifié et prend beaucoup de temps, ce qui nécessite plusieurs étapes d'ultracentrifugation. D'autres méthodes, telles que la filtration et la précipitation, ont été développés pour l'isolement d'exosomes, y compris une qui utilise un réactif de précipitation propriétaire (ce est à dire, ExoQuick-TC: Biosciences système; Mountain View, CA). Bien que les précipitations en utilisant ce réactif est rapide et relativement facile, la pureté des exosomes isolés est faible par rapport à la meth ultracentrifugationod. Récemment, nous avons comparé les six procédés pour l'isolement d'exosomes urinaires, y compris une modification de la méthode de précipitation au moyen ExoQuick-TC que nous avons développé dans notre laboratoire ^11. Nous avons constaté que cette méthode de précipitation modifiée a donné de plus grandes quantités de protéines, de miARN et ARNm et la procédure elle-même était plus rapide et plus facile à mettre en œuvre que ultracentrifugation. Ici, nous décrivons le protocole expérimental de notre méthode de précipitation modifiée de manière progressive, et inclure une discussion sur les avantages et les inconvénients de cette technique par rapport à d'autres méthodes d'isolement de exosomes. Le procédé de précipitation modifié implique une précipitation initiale de particules d'exosomes, suivie de l'élimination de la protéine de Tamm-Horsfall, qui est corrélée avec des protéines exosomales, et connu pour réduire le rendement des exosomes à partir d'urine. Nous avons constaté que ces modifications ont augmenté le rendement et la pureté de la préparation de exosomal de l'urine.

Protocole

REMARQUE:. Les étapes impliquées dans l'isolement des exosomes urinaires en utilisant le procédé de précipitation modifiée sont illustrés dans la Figure 1 Les premières étapes impliquent l'enlèvement de grandes cellules mortes et les débris cellulaires par centrifugation. Le culot final obtenu à partir du surnageant recueilli à partir de chaque étape subséquente correspond à la exosomes, qui est dissous dans une solution d'isolation pour une extraction supplémentaire de la protéine, d'ARN et de l'ADN.

1. Collecte de l'urine

1. Avant la collecte de l'urine, préparer inhibiteur de protéase cocktail selon les instructions du fabricant et ajouter 3,125 ml de ce cocktail à une prise vide et stérile. Le tube contenant le cocktail d'inhibiteurs de protéase peut alors être distribué aux bénévoles pour la collecte d'urine.
   REMARQUE: La raison de l'ajout d'un inhibiteur de protease est de réduire au minimum la dégradation des protéines dans l'échantillon d'urine. Bien que nous avons utilisé spécifiquement un cocktail d'inhibiteurs de protéase duSigma, d'autres inhibiteurs de protease disponibles dans le commerce peuvent être substitués.
2. Prélever environ 10 ml d'urine de la première miction. Traiter l'urine immédiatement après la collecte sans stockage ou de réfrigération. Isoler les exosomes urinaires en double en utilisant le procédé de précipitation modifié; un des exemplaires est pour l'ADN, l'ARN total et l'extraction des protéines, tandis que l'autre est pour la quantification des particules d'exosomes urinaires.
   REMARQUE: Un échantillon d'urine de 24 heures peut être recueilli pour l'isolement de exosomes en stockant à 4 ° C.

2. Elimination des débris cellulaires et Tamm-Horsfall Protein (THP)

1. Transfert des échantillons d'urine tubes de 15 ml de centrifugeuses. Centrifugeuse de 10 ml d'urine à 17 000 xg pendant 10 min à 37 ° C pour éliminer les cellules et les débris cellulaires (figure 1).
2. Aide d'une pipette, transférer le surnageant dans un nouveau tube pour un traitement ultérieur. Remettre en suspension le culot dans 500 pl de solution d'isolation (250 mM de saccharose, 10 mM qui éprouveanolamine, pH 7,6), suivi par 10 minutes d'incubation avec DL-dithiothréitol (DTT: concentration finale de 200 mg / ml) à 37 ° C.
   REMARQUE: la TNT est ajouté à dégrader THP, qui emprisonne exosomes, conduisant à une diminution des rendements. Prenez soin de laisser le culot sans être dérangés pendant le transfert du surnageant, et vérifiez que le surnageant est clair de granulés de bois.
3. Des échantillons de granulés Vortex toutes les 2 min jusqu'à ce que le culot soit complètement dissous. Ensuite, ajouter 500 ul de solution d'isolation pour le culot dissous.
4. Immédiatement après l'addition de solution d'isolation de la pastille, centrifuger à 17 000 xg pendant 10 min à 37 ° C. Déposer le surnageant et de combiner avec le surnageant recueilli plus tôt.
5. Reprendre le culot dans 50 ul de solution d'isolation pour l'analyse SDS-PAGE.
   REMARQUE: PBS TBS ou peuvent être utilisés à la place de la solution d'isolation pour remettre en suspension le culot.

3. Isolement de Exosome Pellet

1. Pour 11 ml de la Supern recueilliesatant, ajouter 3,3 ml de réactif ExoQuick-TC et incuber à 4 ° C pendant au moins 12 h.
   REMARQUE: le rapport du volume de surnageant de réactif ExoQuick-TC peut être réglée pour augmenter ou diminuer le rendement de exosomal. Nous avons observé que les volumes moindres de réactif ajouté produisent des rendements inférieurs de exosomes.
2. Après incubation, centrifuger le mélange échantillon / ExoQuick-TC à 10 000 g pendant 30 min à 25 ° C.
3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube pour analyse par SDS-PAGE.
4. Le culot d'exosomes peut être conservé à -80 ° C pour l'ADN, l'ARN et l'extraction des protéines et la quantification des particules d'exosomes en utilisant ELISA ¹¹ CD9.
   NOTE: Le culot d'exosomes peut être conservé à -80 ° C pendant 1 an avec congélation et de décongélation limitée.

4. biomarqueurs de détection et analyse des Exosome Pellet

1. Pour les analyses en aval, extraire l'ADN, de l'ARN et de protéines à partir de la pastille de exosomes en utilisant le / ARN / kit d'isolement de protéines de l'ADN et un Ki d'isolement d'ARNt selon les instructions du fabricant. Déterminer les concentrations en utilisant un spectrophotomètre à Nanodrop en mesurant l'absorbance à 260 et 280 nm avec 2 pi d'échantillon.
2. Effectuer quantitative en temps réel RT-PCR (qPCR) en utilisant des tests de microARN TaqMan (dans notre cas, nous avons utilisé les droits de miR-192- et miR-spécifiques 1207-5p-tests) ou des amorces spécifiques miARN.
3. Pour l'analyse SDS-PAGE, en utilisant 4-12% Bis-Tris gel et les échantillons de protéines séparées par électrophorèse unidimensionnelle. Visualiser gels en utilisant le kit de coloration à l'argent conformément aux instructions du fabricant.
4. Effectuer une analyse de buvardage de Western en utilisant des membranes de PVDF selon les instructions fournies par le fabricant. Utilisation anticorps polyclonal de lapin lié à l'apoptose gène-interacting protein 2 ou X Alix et un anticorps monoclonal de souris à gène de susceptibilité à la tumeur 101 protéine TSG101 ou à la détection par transfert de Western. Quantifier la densité des bandes par accès ouvert logiciel NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ouun programme similaire.
5. Quantifier le nombre de particules d'exosomes urinaires obtenus en utilisant un kit ELISA CD9 selon les instructions du fabricant.

Résultats

Exosomes urinaires portent protéines, miARN et ARNm biomarqueurs sécrétées par les cellules épithéliales rénales. L'isolement et la détection de ces exosomes peuvent fournir un outil diagnostique utile pour la détection précoce des maladies rénales telles que la néphropathie diabétique. Il existe plusieurs méthodes pour l'isolement d'exosomes à partir d'échantillons d'urine prélevés chez des sujets humains. Nous avons déjà comparé six méthodes d'isolement de l'urine exosomes et étudié les protéines, les niveaux d'ARNm e...

Discussion

La plupart des procédés impliquant la précipitation des exosomes à partir d'urine ne abordent pas le retrait du réseau polymère formé par la protéine de Tamm-Horsfall (THP). Cette protéine est présente en grandes quantités dans l'urine, où il pièges putativement exosomes pendant la centrifugation à basse vitesse initiale. Dans notre méthode modifiée, nous avons réduit THP utilisant la TNT avant la précipitation exosomes. Comme le montre la Figure 2, une plus grande quantité de THP a été observée...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Corning 15 ml Tube à centrifuger	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Cocktail inhibiteur de protéase	Sigma Aldrich	P8340
Centrifugeuse	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	utilisé à la concentration finale de 200 mg/ml
Novex NuPAGE SYSTÈME SDS-PAGE (4-12 % Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 puits	Invitrogen	NP0321BOX	Pour l’analyse SDS-PAGE
ECL Advance Western blot detection	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	Pour la détection par western blot de biomarqueurs
Exoquick-TC Reagent	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Pour l’isolement des exosomes
Exosome CD9 ELISA Complete	Kit System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Pour la quantification des exosomes
AllPrep DNA/ARN/Protéines mini kit	Qiagen	80004	Pour l’isolement de l’ADN, de l’ARN et des protéines
Rneasy MinElute Kit de nettoyage	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 Spectrophotomètre UV-Vis	Thermo Scientific		Pour la quantification des protéines
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	Pour la coloration des gels
SDS-PAGESystème d’électrophorèse mini-cellulaire Xcell SureLock	Life Technologies		Pour l’exécution des gels SDS-PAGE Dosages
microARN TaqMan	Technologies		Pour les tests RT-PCR
Logiciel qBasePlus v1.5	Biogazelle NV		Pour l’analyse des données de test RT-PCR
Anticorps polyclonal de lapin contre ALIX	Millipore		Pour la détection de biomarqueurs
par transfert westernAnticorps monoclonal de souris contre TSG101	Abcam		Pour la détection de biomarqueurs par transfert Western