Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris

18.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/51159

⸱

7 avril 2014

 ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Tulane University, 2Department of Ophthalmology, Tulane University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Néovascularisation (NV) de la cornée peut compliquer multiples pathologies visuelles. Utilisant un modèle de lésion alcalin brûlage dirigé, un niveau quantifiable de la SA de la cornée peut être produite pour l'étude mécaniste de la SA de la cornée et l'évaluation des thérapies potentielles pour les troubles néovasculaire.

Résumé

Dans des conditions normales, la cornée est avasculaire, et cette transparence est essentielle pour maintenir une bonne acuité visuelle. La néovascularisation (NV) de la cornée, qui peut être causée par un traumatisme, une maladie infectieuse ou kératoplastie, se décompose de la soi-disant «privilège angiogénique 'de la cornée et forme la base de plusieurs pathologies visuelles qui peuvent même conduire à la cécité. Bien qu'il existe plusieurs options de traitement disponibles, les besoins médicaux fondamentaux présentés par des pathologies de la cornée néovasculaire reste insatisfait. Afin de développer des thérapies sûres, efficaces et ciblés, un modèle fiable de la SA de la cornée et une intervention pharmacologique est nécessaire. Ici, nous décrivons un modèle de néovascularisation cornéenne blessures en milieu alcalin de brûlure dans la souris. Ce protocole fournit un procédé pour l'application d'une blessure en milieu alcalin combustion contrôlée de la cornée, de l'administration d'un composé d'intérêt pharmacologique, et la visualisation du résultat. Cette méthode pourrait s'avérer instrumentationtal pour étudier les mécanismes et les possibilités d'intervention dans NV cornée et d'autres troubles néovasculaire.

Introduction

Cécité cornéenne est la quatrième cause la plus fréquente de cécité, responsable d'environ 4% de tous les cas 1. Néovascularisation de la cornée (NV) joue un rôle important dans bon nombre de ces pathologies, y compris la kératite herpétique (le leader de cause infectieuse de cécité dans l'Ouest) et le trachome (la principale cause de cécité infectieuse dans le monde) 2. Les traitements actuels comprennent des stéroïdes, des médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), des thérapies anti-VEGF, et la cyclosporine A, ainsi que les techniques chirurgicales conventionnelles ou laser 3. Cependant, la nature débilitante de NV basée pathologies de la cornée, la rareté des installations chirurgicales capables de traiter NV cornée, et l'absence d'une option pharmacologique fortement d'effectuer mené une table ronde d'experts récente de conclure que, malgré les traitements existants, la nécessité médicale fondamentale présenté par ces pathologies reste insatisfait 4.

La cornée humainese compose de 5 couches, 3 couches cellulaires (épithélial, stromales et endothéliales) et 2 interface (membrane de Bowman et de la membrane de Descemet). Il fonctionne comme une barrière mécanique et de la surface de réfraction de l'oeil. Sa transparence est la conséquence d'un équilibre délicat de ses composantes et fait partie intégrante de sa fonction 5. Normalement avasculaire, la cornée reçoit le sang à partir de micro-vaisseaux qui courent le long de son bord extérieur, qui sont alimentés à partir de la ciliaire et des artères ophtalmiques. NV cornéenne se produit quand un stimulus favorise l'angiogenèse de ces vaisseaux ce qui leur permet de se développer vers le centre de la cornée et donc de limiter vision 6. L'angiogenèse cornéenne comprend hemangiogenesis et la lymphangiogenèse, qui donnent lieu à la croissance de vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques à partir de l'arcade vasculaire limbique vers le centre de la cornée. Cela conduit à une rupture de la cornée "privilège angiogénique", une augmentation de l'opacité de la cornée et de la fibrose, la perturbation de la cornée layers, et œdème 7. Les déclencheurs précis de la SA de la cornée sont nombreux, allant d'une réponse aux maladies infectieuses telles que le trachome à un état induit chimiquement provoqué médicaments traditionnels, les produits chimiques industriels, ou des agents de guerre chimiques même.

Les mécanismes moléculaires de ce processus ne sont pas, encore, entièrement caractérisés; Cependant, quelques joueurs clés ont été identifiés. Dans des conditions normales la cornée possède un «privilège angiogénique» unique maintenu par un réseau redondant de facteurs anti-angiogéniques (tels que VEGF-R1 soluble) 8. Toutefois, en réponse à un stimulus externe (par exemple une blessure), il y aura une régulation à la hausse locale de facteurs pro-angiogéniques (par exemple, VEGF-A). Cette pencher la balance de facteurs pro-et anti-angiogéniques qui sous-tend le privilège angiogénique de la cornée, et conduit à hemangiogenesis, lymphangeogenesis, et l'inflammation, provoquant ainsi une pathologie cornéenne et même la cécité 9.

Compte tenu de l'besoins médicaux non satisfaits de cette pathologie très invalidante, il est de l'intérêt sur le terrain pour avoir un modèle animal fiable de la SA de la cornée. Ici, nous présentons un tel modèle: contrôlé blessure alcali-brûlure. Différents modèles œil blessures basés sur l'utilisation des anneaux de papier filtre ont été utilisés depuis les années 1970 10. En 1989, un groupe d'ophtalmologistes Harvard Medical School caractérisé un modèle standard d'une blessure en milieu alcalin de combustion centrale de la cornée du lapin sur la base de tremper une feuille de papier filtre circulaire avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH) et de l'appliquer à la cornée à une gamme spécifique de 11 concentrations. Depuis lors, cette technique a été adaptée pour une utilisation dans le 12-14 de la souris. Récemment, le laboratoire Wang a étudié les effets thérapeutiques de l'histone déacétylase (HDAC) SAHA dans la pathogenèse de la NV cornéenne à l'aide d'un modèle de lésion de la cornée dans les alcalis brûlure souris 15. La méthodologie de la cornée modèle de lésion alcali-brûlure souris présentée ici a été construitprincipalement sur ​​le travail préalable de deux autres documents 14,16.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Remarque: Le protocole suivant et les résultats représentatifs utiliser l'inhibiteur de HDAC SAHA comme un composé d'exemple. Toutefois, ce protocole n'est en aucun cas limitée à l'utilisation de SAHA, et est recommandée en tant que méthode générale pour tester les effets des composés solubles sur la néovascularisation de la cornée. Des modifications mineures doivent être pris pour que le degré de dilution ainsi que la fréquence et la durée d'application. En outre, des composés qui sont facilement solubles dans l'eau pourront être administrées en l'absence de DMSO.

Engagement éthique: Tous les expériences sur les animaux ne doivent être effectuées en conformité avec la législation nationale et les règlements institutionnels. Ce protocole a été approuvé pour une utilisation par l'Université de Tulane institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

Une. Préparation du matériel (dans l'ordre d'utilisation)

  1. Couper un morceau de papier filtre de cellulose (11 um) en deux cercles mm.
  2. Préparer une solution à 1 M de NaOH pardissolvant 20 g de NaOH dans 500 ml d'eau distillée H 2 O. Stocker à température ambiante. ATTENTION: des solutions de NaOH sont corrosifs et peuvent causer des brûlures alcalins.
  3. Préparer un cocktail anesthésiant en diluant 10 ml de 100 mg / ml de kétamine et de 2,5 ml de 20 mg / ml de xylazine dans 37,5 ml de 1 x PBS pour obtenir une concentration finale de 20 mg / ml de kétamine et de 4 mg / ml de xylazine.
  4. Préparer une solution à 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne (pour une analgésie topique) en dissolvant 500 mg de chlorhydrate de proparacaïne dans 100 ml de PBS filtré.
  5. Préparer 1x PBS en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 et 0,23 g de NaH 2 PO 4 dans 900 ml d'H 2 O. distillée Ajuster à pH 7,4. Porter la solution à un volume final de 1000 ml avec de l'H 2 O distillée et de filtrage pour assurer la stérilité.
  6. Préparer 1000 x solutions de stockage de SAHA à ~ 100 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) en dissolvant 26,4 mg de SAHA dans 1 ml de DMSO. Diluer à un 1x (~ 10 M)solution dans du PBS filtré à chaque utilisation. Conserver la solution stock à -20 ° C pendant un mois. ATTENTION: Le DMSO est une toxine et mutagène connu.
  7. Préparer une solution à 4% de paraformaldéhyde (PFA) pour la fixation. Sous une hotte chimique, dissoudre 4 g de PFA dans 90 ml de PBS. Porter le mélange à 65 ° C et titrer jusqu'à un pH de 7,4. Une fois que le PFA est dissous, porter la solution à un volume final de 100 ml. Stocker à 4 ° C pendant un mois. ATTENTION: Le PFA est un allergénique connue, cancérigènes et toxiques.
  8. Préparer du tampon de blocage 1x par dilution de 5 ml de sérum de chèvre et de 500 ul de Triton X-100 dans 94,5 ml de PBS.
  9. Préparer le tampon de lavage en diluant 1 x 500 ul de Triton X-100 dans 99,5 ml de PBS.

2. Alkali-Burn traitement des blessures et composé

  1. Faire tremper un morceau rond de papier filtre, ~ 2 mm de diamètre, dans une solution de 1 M de NaOH.
  2. Anesthésier les souris avec une injection de 100 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine, which est ~ 100 pi de cocktail anesthésie de l'étape 1.3 par 25 g souris. Anesthésie devrait prendre ~ 1-2 min à mettre po profondeur de l'anesthésie peut être déterminée en pinçant doucement la pointe ou de la queue de l'animal, si l'anesthésie est suffisante il devrait y avoir aucune réponse. Remarque: Il faut veiller à assurer la souris ne succombe pas à l'anesthésie hypothermie induite.
  3. En utilisant une pipette, appliquer localement une baisse de 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne à la surface de la cornée pour l'analgésie locale.
  4. En utilisant des pinces stériles, ramasser un morceau de papier filtre imbibé NaOH. Si vous remarquez un excès de NaOH accroché à ou s'égoutte par le papier filtre, appuyez brièvement sur le papier filtre imbibé sur un morceau sec de papier filtre pour absorber l'excès. Placer le morceau de papier filtre imbibé de NaOH sur la cornée centrale. Laissez-le pendant 30 secondes pour produire un alcali-brûlure aiguë de ~ 2 x 2 mm 2 de surface. Un microscope d'opération est utile pour placer correctement le papier filtre. Remarque: Seul un œil de la souris should se blesser avec l'autre servant de témoin.
  5. Retirez le papier filtre. En utilisant une seringue de 10 ml, rincer doucement l'œil avec 10 ml de PBS 1x deux fois pour laver résiduelle NaOH 1.
  6. Appliquer immédiatement une goutte de solution de travail 1x SAHA (ou un contrôle de véhicule constitué de PBS dilué DMSO contenant pas SAHA) par voie topique à la cornée. Répétez l'application 3 fois par jour pendant 14 jours. Remarque: au cours de cette période, un onguent antibiotique topique n'est pas recommandé car il peut interférer avec le développement de la blessure et la livraison du composé. Utilisez une solution antibiotique liquide, solution de gentamicine tels que de 3%, à la place.
  7. Passez directement à l'évaluation clinique (protocole n ° 3 ci-dessous) ou de sacrifier la souris et énucléer les yeux pour la cornée montage plat (protocole n ° 4 ci-dessous) ou de la paraffine / histologie conventionnelle congelé.

3. Évaluation clinique

  1. Procéder à un examen quotidien de la souris à l'aveugle sous un microscope chirurgical et marquer corneal NV basée sur l'opacité de la cornée, NV, et la taille du navire. Utiliser au moins deux observateurs, et enregistrer un résultat final qui est la moyenne des deux.
    1. Note opacité de la cornée sur une échelle de 0-4. 0 = pas du tout claires; 1 = légèrement brumeux, iris et la pupille facilement visible; 2 = légèrement opaques, iris et la pupille encore détectable; 3 = opaques, des élèves à peine détectables; et 4 = complètement opaques sans vue de l'élève.
    2. Note NV sur une échelle de 0-3. 0 = pas de néovaisseaux; 1 = néovaisseaux au limbe cornéen; 2 = néovaisseaux enjambant le limbe cornéen et s'approchent du centre de la cornée; 3 = néovaisseaux couvrant le centre de la cornée.
    3. Note taille du navire sur une échelle de 0-3. 0 = pas de néovaisseaux; 1 = néovaisseaux détectables au microscope chirurgical; 2 = néovaisseaux facilement vu sous microscope chirurgical; 3 = néovaisseaux facilement vus sans microscope.
  2. L'utilisation d'un appareil photo numérique, prendre des images représentatives de l'œil à 7 jours et 14 jours.

4.Cornée coloration et supports plats

  1. Corrigez les yeux énucléés dans 4% PFA pendant au moins 1 heure à 4 ° C.
  2. Transfert à l'œil de 1x PBS et utiliser une pince pour retirer soigneusement l'excès de tissu.
  3. Avec l'aide d'un microscope chirurgical, utiliser une aiguille (calibre 18) ou micro-couteau pour perforer la région péricornéenne de l'oeil (note: cela devrait libérer le fluide de l'oeil).
    1. De la perforation réalisée dans la section 4.3.1 en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper la partie antérieure de l'oeil (cornée) de la partie postérieure.
  4. Transférer la cornée de retour dans 4% PFA pour la fixation nuit à 4 ° C.
  5. Jeter la PFA 4% (ATTENTION: PFA est dangereux et doit être éliminé conformément à la réglementation institutionnels) et rincer la cornée trois fois avec PBS 1x pour enlever tout résidu PFA.
  6. Incuber dans du tampon de blocage 1x pendant au moins 2 heures à la température ambiante pour perméabiliser le tissu et empêcher la liaison non spécifique de l'anticorps primaire.
    1. Appliquer un anticorps primaire dans un tampon de blocage 1x, à une dilution 100-500. (Par exemple de rat anti-souris-PECAM-1 pour détecter les vaisseaux sanguins à 1:100, de lapin anti-souris-LYVE-1 pour détecter des vaisseaux lymphatiques à 1:500, et / ou de rat anti-mouse-F4/80 pour détecter les macrophages à 1:100). Incuber à 4 ° C pendant une nuit.
    2. Laver six fois avec 1x tampon de lavage pendant 1 heure à chaque fois à la température ambiante pour éliminer totalement anticorps primaire non lié.
    3. Appliquer un anticorps secondaire en 1x tampon de blocage à une dilution 500-1000. (Par exemple, une lampe fluorescente de 488 nm marqué de chèvre anti-rat-IgG à 1:800 ou une lampe fluorescente de 594 nm marqué de chèvre anti-lapin IgG à 1:800). Incuber à 4 ° C pendant une nuit.
    4. Laver trois fois avec PBS 1x pendant 1 heure chacun à la température ambiante à supprimer complètement anticorps secondaire non lié.
  7. Transférer la cornée en frais 1x PBS et, à l'aide d'un microscope chirurgical, faire attention quatre incisions de la périphérie vers le center. Cela devrait diviser la cornée en quatre quadrants de taille à peu près égale (la forme résultante devrait ressembler un peu comme un papillon) et lui permettre de reposer à plat sur une diapositive.
  8. Monter avec un milieu approprié de montage pour l'imagerie de fluorescence. Pour de meilleurs résultats, les échantillons doivent être visualisés immédiatement et photographies numériques prises, mais peuvent être stockés pendant plusieurs semaines à l'abri de la lumière à 4 ° C.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Après une blessure en milieu alcalin brûlure, NV cornéenne se produit dans un mode dépendant du temps prévisible. Figure 1 montre la différence rigide à la fois dans la néovascularisation et l'opacité de la cornée entre un animal non traité (figure 1A) et un animal traité avec l'inhibiteur de HDAC SAHA (Figure 1B ) au point de temps de 7 jours.

Les figures 2A et 2B montrent un support plat de la corn...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Le protocole présenté ici résulte des niveaux reproductibles de hemangiogenesis, lymphangiogenèse, et l'inflammation, ce qui en fait un système idéal pour étudier ces trois processus interdépendants (). Bien que cette méthode produit NV cornée centralisée, plusieurs méthodes ont été développées pour provoquer plus dirigé NV, à savoir la suture de la cornée 17 et implantés facteur de croissance exprimer pastilles 18, pourrait également être d'intérêt. Notre protocole est conçu pour être util...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants de l'aide du Dr Li Xinyu dans la préparation du manuscrit. SW a été soutenue par un fonds de démarrage de la Tulane University, New Investigator Award Conseil de recherches du président de l'UT Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, une bourse de développement de carrière de la recherche visant à prévenir fondation cécité, et un prix brillant Focus à l'âge Dégénérescence Maculaire Liée à la recherche .

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue 1 mlBD309659
Aiguille BD 18 G305918
Seringue 10 mlBD306575
Aiguille BD 25 G
Anti-F4/80 (anti-rat anti-souris)AbD SerotechMCA497RT
Anti-LYVE-1 (anti-souris lapin)Abcamab14917
Anti-PECAM-1 (anti-rat anti-souris)BD553370
Anti-IgG Alexa 488 (chèvre anti-rat)InvitrogenA11006
Anti-IgG Alexa 594 (chèvre anti-lapin)InvitrogenA11012
CaméraTucsenTCC 5.0 ICE
CoverslipsFisher12-548-B
DMSOSigmaD4540-1LAttention : Mutagènes, Pinces toxiques
(contondantes), IrisWPI15915
Forceps (tranchantes), Dumont #4WPI500340
KClFisherP217-500
Kétamine SolutionMedVetRXKETAMINESubstance contrôlée, licence appropriée requise pour l’utilisation.
Source lumineuse pour microscopeMicroscopeAmScope LED-14M-YA
(Stéréo 7X-45X)AmScopeSM-1B
Support de montage, VECTASHIELDVectorH-1000
NaClFisherS271-10
NaH2PO4FisherS397-500
NaOHFisherS318-1Attention :
ParaformaldéhydeP6148-500GAttention : Allergène, cancérogène, toxique
Chlorhydrate de proparacaïneSigmaP4554-1G
Ciseaux (lame de 5 mm), VanasWPI14003
Sérum de chèvreMPBio92939249
Lames de microscopeFisher12-550-15
Triton X-100SigmaT8787-100ML
Whatman Grade 1 Papier filtreWhatman1001-6508
Xylazine SolutionMedVetRXANASED-20
305916 corrosif

Références

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).
  2. Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).
  3. Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).
  4. Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).
  5. Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
  6. Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).
  7. Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).
  8. Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).
  9. Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).
  10. Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).
  11. Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).
  12. Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).
  13. Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).
  14. Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).
  15. Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).
  16. Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).
  17. Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. , (2012).
  18. Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).
  19. Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).
  20. Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Modèle murinThérapie anti-angiogéniqueÉvaluation cliniqueMarquage par immunofluorescenceMarqueur endothélial vasculaireMarqueur endothélial lymphatiqueInfiltration macrophagiqueScore d'opacité cornéenne
Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.