Les méthodes de détection quantitative d'anticorps induite par l'activation du complément sur les globules rouges

Summary

Nous décrivons ici deux dosages pour mesurer l'activation du complément induite par des anticorps contre les globules rouges. L'avantage majeur sur les tests actuels est leur nature quantitative et facile à interpréter.

Abstract

Les anticorps contre les globules rouges (hématies) peuvent conduire à l'activation du complément entraîne une clairance accélérée via les récepteurs du complément dans le foie (hémolyse extravasculaire) ou conduisant à la lyse des globules rouges intravasculaire. Allo-anticorps (par exemple ABO) ou auto-anticorps contre les antigènes RBC (comme on le voit dans l'anémie hémolytique auto-immune, AIHA) conduisant à l'activation du complément sont potentiellement dangereux et peuvent être - surtout quand conduisant à la lyse intravasculaire - fatale ^1. Actuellement, l'activation du complément en raison de (auto)-anticorps sur les globules rouges est évaluée in vitro en utilisant le test de Coombs reflétant dépôt du complément sur ​​RBC ou par un dosage hémolytique non quantitative reflétant lyse RBC ^1-4. Cependant, pour évaluer l'efficacité des inhibiteurs du complément, il est obligatoire de disposer de techniques quantitatives. Nous décrivons ici deux de ces techniques. Tout d'abord, un dosage pour détecter C3 et C4 sur le dépôt de globules rouges qui est induite par des anticorps dans le sérum du patient est préprésentés. Pour cela, on utilise une analyse par FACS avec anticorps anti-C3 ou C4 anti-marquées par fluorescence. Ensuite, une analyse quantitative hémolytique est décrite. Dans ce dosage, l'hémolyse, médiée par le complément induite par le sérum du patient est mesurée usage de la fabrication de détection spectrophotométrique de l'hémoglobine libérée. Ces deux essais sont très reproductible et quantitative, ce qui facilite les études de l'activation du complément induite par des anticorps.

Introduction

Les anticorps contre les globules rouges (hématies) peut être induite par la transfusion de globules rouges exprimant un antigène qui n'est pas présent sur les globules rouges de destinataire. Ces allo-anticorps peuvent provoquer de graves réactions transfusionnelles hémolytiques aiguës dues à l'activation du complément sur ​​la transfusion ⁵ suivant. En cas d'anémie hémolytique auto-immune (AHAI), les patients ont des auto-anticorps contre leurs propres globules rouges. Cela conduit à la clairance accélérée des cellules via l'interaction de l'IgG lié à hématies avec les récepteurs Fcy sur des phagocytes dans la rate et / ou dans les ca....

Protocol

Une. Préparation des globules rouges broméline traités

1. Globules rouges Laver 0 typées 3x avec 1x PBS (centrifugation à 664 g pendant 2-5 min).
2. Incuber 1 volume de globules rouges emballées avec deux volumes d'une solution de broméline à 0,5% pendant 10 min à 37 ° C.
3. Laver les cellules 3x avec PBS 1x.
4. Les cellules peuvent être stockées sous la forme d'une solution à 3% à 4 ° C dans 1 x de PBS pendant au moins une semaine.

2. C3 et C4 dépôt analyse des globules rouges par FACS

1. Inactiver à la chaleur la quantité requise de sérum d'un patient (ou une autre source d'anti....

Results

La figure 2A montre un nuage de points représentant des globules rouges. Déclenchement adapté pour les globules rouges simples peut être vu dans de FSC-W - FSC Une parcelle (P1). Habituellement, environ 95% des globules rouges entrent dans cette grille de P1 (cellules simples), mais quand un pourcentage élevé de sérum du patient est utilisé, cela peut tomber à 70-80%, en particulier lorsque des IgM anti-RBC est présent dans le sérum du patient.

Les résultats représentatifs d.......

Discussion

Les dosages ci-dessus sont reproductibles et robuste. Ils sont faciles à réaliser et il est possible de les réaliser avec de nombreux échantillons à la fois (dans une plaque à 96 puits). Par conséquent, cette approche serait également approprié pour un système entièrement automatisé, par exemple un système de robot ELISA. Par contraste avec les techniques actuellement utilisées, ces dosages sont quantitatifs et cela aide par exemple dans l'étude de l'effet des inhibiteurs du complément. En outr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Fresenius Kabi		;
BSA	Sigma	B-4287	;
Barbital	Fagron	0261	Ce produit chimique est soumis à la réglementation des médicaments.
Sodium Barbital	Fagron	0263	Ce produit chimique est soumis à la réglementation des médicaments.
Gélatine	Merck	1.0470.0500	;
Chlorure de sodium	Merck	1.06404.1000	;
Chlorure de magnésium	Merck	1.05833.0250	;
Chlorure de calcium	Merck	1.0238.0500	;
Dylight 488 amine colorant réactif	Pierce	46402	;
Dylight 650 amine colorant réactif	Pierce	62265	;
et alpha ; C5 (Eculizumab)	Alexion Pharmaceuticals		;
FACS (Canto)	BD		On peut utiliser n’importe quel FACS doté des lasers appropriés.
Spectrophotomètre (par exemple spectre Multiskan)  ;	Thermo Labsystems	1500-193	Tout spectrophotomètre avec la bonne gamme de longueurs d’onde peut être utilisé
BD FACSDiva software v 6.1.2	BD	643629	Tout logiciel d’analyse FACS compatible peut être utilisé
Bromelain  ;	Sanquin	K1121	;