L'isolement et la quantification de neurotoxine botulique de matrices complexes utilisant les BoTest matrice dosages

Summary

La neurotoxine botulique BoTest Matrix (BoNT) des tests de détection de purifier rapidement et quantifier BoNT d'une gamme de matrices d'échantillons. Ici, nous présentons un protocole pour la détection et la quantification de la BoNT de matrices solides et liquides et de démontrer l'essai avec BOTOX, les tomates et le lait.

Abstract

Détection précise et la quantification de la neurotoxine botulique (BoNT) dans des matrices complexes est nécessaire pour l'industrie pharmaceutique, l'environnement, et les essais de l'échantillon de la nourriture. Les tests rapides BoNT des denrées alimentaires est nécessaire pendant la criminalistique épidémiologiques, le diagnostic du patient, et des tests de sécurité alimentaire lors des tests d'activité précis est nécessaire pour la fabrication d'un produit médicamenteux à base de BoNT et la sécurité des patients. Le bio-essai souris largement utilisé pour les tests BoNT est très sensible mais manque de précision et le débit nécessaire pour les tests BoNT rapide et la routine. En outre, l'utilisation de l'essai biologique des animaux a suscité des appels par les autorités de réglementation des produits de la drogue et les partisans des droits des animaux aux États-Unis et à l'étranger pour remplacer le bio-essai sur souris pour les tests BoNT. Plusieurs essais in vitro de remplacement ont été développés qui fonctionnent bien avec purifiée BoNT dans des tampons simples, mais la plupart n'ont pas été montré pour être applicable à l'essai dans des matrices complexes. Ici, un protocole pour la détection d'BoNT dans des matrices complexes en utilisant les BoTest matrice essais est présenté. Le test se compose de trois parties: La première partie comprend la préparation des échantillons pour essais, la deuxième partie est une étape d'immunoprécipitation utilisant des anticorps anti-BoNT billes paramagnétiques recouvertes d'anticorps pour purifier BoNT de la matrice, et la troisième partie quantifie la protéolytique de l'isolement BoNT activité en utilisant un journaliste fluorogène. Le protocole est écrite pour le test à haut débit dans des plaques à 96 puits en utilisant des matrices à la fois liquides et solides et nécessite environ 2 heures de préparation manuelle avec le total des temps de dosage de 4-26 heures, selon le type d'échantillon, la charge de la toxine, et la sensibilité souhaitée. Les données sont présentées pour BoNT / A l'essai avec tampon phosphate salin, un médicament, un surnageant de culture, lait 2%, et les tomates fraîches et comprend la discussion des paramètres essentiels à la réussite du test.

Introduction

neurotoxines botuliques (de Bont) sont les substances les plus mortelles connues, avec des doses létales humaines intraveineuses estimés à 1-3 ng / kg ^1,2. Sept sérotypes de BoNT structurellement similaires, marqués de A à G, exister, chacun consistant en un domaine de chaîne lourde responsable de la liaison cellulaire, l'absorption et la translocation dans le cytosol et d'une chaîne légère qui code pour une endopeptidase de zinc ^5.3. La toxicité exquis de BoNT résulte, en partie, son entrée obligatoire et spécifique dans les neurones moteurs à la jonction neuromusculaire ^6. Une fois à l'intérieur du neurone, l'endopeptidase de la chaîne légère clive spécifiquement une ou plusieurs de la N-éthylmaléimide sensible récepteur soluble de la protéine de fixation du facteur (SNARE) des protéines nécessaires à la fusion des vésicules, l'inhibition de la libération de neurotransmetteurs et conduisant à la paralysie flasque ^7-14. Communément appelée la maladie "botulisme" paralysie du diaphragme et des muscles intercostaux par BoNT aboutit finalement dansinsuffisance respiratoire et la mort moins le diagnostic précoce et le traitement sont reçus.

Origine alimentaire humaine botulisme est le plus souvent associée à BoNT sérotypes A, B, E, et F (BoNT / A, BoNT / B, etc) et se traduit généralement par l'ingestion d'aliments contaminés ^15,16; bien que, plusieurs cas de botulisme par blessure ont été signalés chez les usagers de drogues par voie intraveineuse ^17,18. Aux États-Unis, le botulisme infantile résultant de l'ingestion de spores de Clostridium par les enfants de moins de un est la forme la plus commune de botulisme ^19-21. Cependant, les épidémies d'origine alimentaire de neurotoxines botuliques résultant de la mise en conserve domestique inadéquate et la transformation des aliments ont été signalés dans les États-Unis et à l'étranger. Entre 2000-2009, au moins 338 cas de botulisme d'origine alimentaire ont été signalés dans le monde entier, y compris six décès ^22. La capacité de détecter rapidement et de manière sensible des éclosions de botulisme d'origine alimentaire est une indication critique qui pourrait faciliter le diagnostic précoce ^23,24. En outre, les méthodes de détection qui permettent rentable et les tests de routine alimentaire permettront d'améliorer la sécurité alimentaire.

Spécificité neuronale de BoNT et longue demi-vie biologique rend également une thérapeutique efficace. Aux États-Unis, les médicaments à base de BoNT sont approuvés par la Food and Drug Administration pour le traitement de conditions cosmétiques et de troubles liés neuromusculaires, y compris les rides glabellaires, la dystonie cervicale, des migraines, de la vessie hyperactive, et le strabisme. De nombreuses applications "off-label" sont documentées, y compris les traitements à forte dose pour grave dysfonctionnement musculaire ^25-28. Précise toxine quantification est essentiel pour un dosage correct, comme un sous-dosage peut conduire à un traitement inefficace tout surdosage met les patients à risque d'effets secondaires potentiellement dangereux. Malheureusement, aucun protocole de test de puissance normalisée est partagée entre les fabricants, ce qui entraîne des inégalités de définition de l'unité entre les producteurs de médicaments à base de BoNTcts ^29-31.

Le test standard pour BoNT est le bio-essai souris dans lesquelles des échantillons contenant BoNT sont injectés par voie intrapéritonéale à des souris et le nombre de décès enregistrés plus de 1-7 jours ^16,32,33. Le bio-essai sur souris est très sensible aux limites de détection (LOD) de 5-10 pg BoNT / A ^34, mais les préoccupations éthiques sur l'utilisation des animaux, le coût élevé de la formation du personnel et l'entretien des installations d'animaux, les temps de dosage longues, et le manque de protocoles normalisés ont donné lieu à des appels à se développer, les tests BoNT standardisé sans animaux et méthodes de quantification ^35-39. Récemment, plusieurs méthodes de quantification de neurotoxines botuliques alternatifs ont été développés qui offrent la souris ou à proximité de la souris essai biologique sensibilité ^40-49. Ces méthodes utilisent couramment fluorescence, spectrométrie de masse, ou des méthodes immunologiques et offrent des temps d'analyse considérablement plus courte que le bio-essai sur souris sans l'utilisation d'animaux. Spectrométrie de masse approches combinées avec techniq immunologiqueues ont été présentés pour détecter et quantifier BoNT contenue dans les aliments et autres échantillons complexes; toutefois, les exigences de formation du personnel et la limite de l'équipement spécialisé ces dosages ^50-55. La plupart des autres tests alternatifs ne sont pas facilement applicable à des tests d'échantillonnage complexe ou n'ont pas le débit requis pour les tests de routine BoNT. La nature très variable de la viscosité de l'échantillon alimentaire, le pH, la teneur en sel, et constituants de la matrice présente un défi particulièrement difficile lorsque vous essayez de développer des méthodes d'essai in vitro avec une sensibilité pour correspondre à la puissance extrême de BoNT. De plus, même les systèmes tampons simples et relativement bénignes, telles que celles résultant de la remise en suspension de produits médicamenteux à base de BoNT, contiennent des sels, l'albumine, le sucre et les stabilisants (par exemple excipients) qui ont une incidence significative in vitro BoNT puissance ^56. purification de la toxine est nécessaire pour le contrôle de l'activité précise de tous, mais le plus simple des échantillons ^56-59.

LaBoTest essais de Matrix ont été conçus pour rapide, à haut débit, et la quantification de la BoNT cohérente à partir d'échantillons très complexes utilisant des équipements couramment dans les laboratoires de recherche ^56,60. Ces tests utilisent des billes paramagnétiques liés de manière covalente à des anticorps anti-BoNT sérotypes spécifiques de lier et séquestrer BoNT sur un échantillon, puis retirez interférer composés de la matrice par lavage. Après lavage, l'activité protéolytique de BoNT lié est ensuite quantifiée dans un tampon de réaction optimisé en utilisant un rapporteur compatible avec le sérotype BoNT testé. Ces rapporteurs sont des protéines fluorogènes constitués d'un cyan N-terminal de la protéine fluorescente (PCP) du fragment et un jaune fluorescent dérivé de protéine C-terminal de la fraction (Venus) reliés par un substrat de BoNT, les résidus de SNAP25 141-206 ou les résidus Synaptobrevin 33-94 constituant l' BoTest A / E ou B / D / F / G journalistes, respectivement ^45. Reporter clivage par BoNT est contrôlée en utilisant Förster transfert d'énergie par résonance (FRET). Quand til rapporteur est intact, l'excitation de la PCP en résulte FRET à Vénus, trempe PCP émission et passionnante émission Vénus. Le clivage de la reporter par la BoNT empêche FRET, conduisant à une augmentation de la PCP et de diminution de l'émission de Vénus émission. Activité BoNT peut alors être mesuré quantitativement utilisant le ratio des émissions PCP et Vénus. LOD-dessous de 3 pg sont possibles à partir d'un large éventail d'aliments en utilisant un format de plaque de 96 puits à haut débit ^56. Sensibilité accrue peut être obtenue en utilisant des volumes d'échantillon plus grands depuis la concentration de dosage permet la toxine sur la surface des billes.

Les essais de la matrice BoTest pour BoNTs A, B, E, et F ont été développés et testés avec de la nourriture, des produits pharmaceutiques, et les échantillons environnementaux ^56,60. Ici, nous décrivons les procédures pour exécuter ces tests pour la détection des BoNT faible complexité (par exemple, pharmaceutique, BoNT dans le tampon) et haute complexité (par exemple la nourriture, de l'environnement) des échantillons. Méthodes de traitement spécifiquespour plusieurs types d'échantillons sont traités dans ce protocole et les types d'échantillons ne sont pas décrites ici peuvent généralement être adaptées en utilisant une combinaison des méthodes présentées. Le protocole a été développé et testé avec BoNT / A, mais est adaptable à d'autres sérotypes de neurotoxines botuliques en utilisant leurs analyses respectives comme en témoigne d'ailleurs ^56,60.

Protocol

Une. Préparation des réactifs d'essai

1. Dégel dithiothréitol 200x (TNT), 10x matrice tampon de liaison (10x liaison de la suite de tampon), 10x tampon de neutralisation (alimentaires ou de pH des échantillons déséquilibrées seulement), et 10x BoTest tampon de réaction (10x Reaction ci tampon) à température ambiante (RT) pendant 15 min ou jusqu'à ce que complètement dégelé. Voir le tableau 1 pour la liste des tampons et des réactifs utilisés dans ce protocole. Voir le tableau 2 pour une liste des matériaux et l'équipement requis pour ce protocole.
2. Vortex tampons décongelés pendant 5 sec pour mélanger. 10x neutralisation tampon, 200xDTT, et 10x tampon de réaction doivent apparaître clairement alors que le tampon de liaison 10x aura un aspect trouble. Réchauffer le tampon de réaction 10x pendant 5 min à 37 ° C et répéter vortex si elle apparaît trouble après la décongélation.
3. Générer 3,8 ml de tampon de réaction 1 x.
   1. Étiqueter un «tampon de réaction de 1x" 15 ml conique du tube et ajouter 3,42 ml biologie moléculaire qualité water, 380 ul 10x tampon de réaction, et 19 pl 200x TNT. Mélanger tampon bien par inversion.
   2. Inhibiteurs de couper un seul comprimé d'inhibiteur de la protéase sans EDTA dans les quartiers à l'aide d'une lame de rasoir propre et ajouter un quart de la tablette pour le tampon de réaction 1x (la partie de la tablette restant peut être conservé à 4 ° C pour une utilisation ultérieure). NB protéase ne peut pas être nécessaire si vous utilisez toxine purifiée et tampons simples (par exemple, des échantillons pharmaceutiques).
   3. Vortex le tampon de réaction 1 x jusqu'à ce que la tablette de la protéase est complètement dissous.
4. Réchauffez les perles matrice A (perles IP-A ci-après) pendant 20 min à température ambiante.
5. Décongeler le journaliste BoTest A / E (A / E journaliste ci-après) à la température ambiante à l'abri de la lumière.
6. Etiqueter un tube de 15 ml conique "0,5 uM A / E rapporteur" et ajouter 45 ul de 20 uM A / E journaliste actions pour 1,8 ml de tampon 1x de réaction. Bien mélanger par pipetage et stocker sur la glace abri de la lumière.

2. Supporterard génération de l'échantillon de la courbe

La courbe standard décrit ici s'étend 10-30,000 mLD ₅₀ / g d'aliment ou par tampon ml des dilutions demi-logarithmiques (tableau 3). L'utilisateur final est libre d'utiliser des concentrations de remplacement le cas échéant.

1. Enrichir et incubation des matrices avec des matériaux de référence. Générer la courbe standard en utilisant un diluant de la même matrice que l'inconnu, si possible, afin de réduire les effets de matrice. Utiliser de la gélatine tampon phosphate (GPB) ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme diluant si d'autres matrice, BoNT négatif n'est pas disponible (par exemple champ ou test de l'échantillon de l'éclosion BoNT). Générer la courbe standard par dopage BoNT / A dans la matrice de choix en suivant le protocole approprié ci-dessous.
   1. Échantillons de faible complexité (par exemple PBS, GPB, ou pharmaceutique)
      1. Ajouter 10 ml de tampon approprié à un tube de 15 ml conique et mettre de côté. Cet exemple sera utilisé comme diluant pour la standard courbe et dilutions inconnus (section 4).
      2. Ajouter 1,2 ml de tampon dans un tube à centrifuger.
      3. ATTENTION: Cette étape utilise BoNT et une extrême prudence doit être utilisé lors de la manipulation et de l'élimination de tous les réactifs et les matériaux qui entrent en contact avec la toxine. L'utilisation des équipements de protection individuelle et l'élimination de tous les matériaux doit être effectuée selon le ministère de lignes directrices du travail de l'OSHA pour BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) des États-Unis. Ajouter BoNT / A à 1,2 ml de l'échantillon de telle sorte que la concentration finale est de 30.000 MLD ₅₀ / ml (36000 mLD ₅₀ au total).
   2. Échantillons d'aliments liquides (ou d'autres échantillons de liquides complexes) Note: le test initial est recommandé de déterminer le volume de surnageant récupéré à partir d'échantillons clarifié que la matière particulaire (. Des pâtes par exemple) dans des matrices liquides varie. Ce protocole suppose au moins 1,2 ml de surnageant clarifié seront récupérés à partir d'un samp 1,4 mlle. Augmenter la taille de l'échantillon si nécessaire.
      1. Ajouter 10 ml de liquides alimentaires dans un tube conique de 15 ml et le mettre de côté. Cet échantillon sera utilisé comme diluant pour la courbe d'étalonnage et les dilutions inconnus (section 4).
      2. Peser un tube de 1,5 ml microtubes vide et enregistrer sa masse.
      3. Ajouter 1,4 ml de l'aliment liquide au tube à centrifuger pesé.
      4. Peser à nouveau le tube de microcentrifugeuse et calculer la masse de la prise alimentaire ajoutée en soustrayant la masse du tube vide.
      5. ATTENTION: Cette étape utilise BoNT et une extrême prudence doit être utilisé lors de la manipulation et de l'élimination de tous les réactifs et les matériaux qui entrent en contact avec la toxine. L'utilisation des équipements de protection individuelle et l'élimination de tous les matériaux doit être effectuée selon le ministère de lignes directrices du travail de l'OSHA pour BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) des États-Unis. Ajouter BoNT / A à l'échantillon de 1,4 ml à une concentration finale de 30 000 mLD ₅₀ / g d'aliment.
      6. IncubationTE et le diluant des échantillons dopés à la température ambiante ou à 4 ° C pendant 2 heures pour donner le temps de BoNT d'interagir avec la matrice alimentaire, imitant une contamination naturelle.
   3. Les échantillons solides alimentaires (ou d'autres échantillons solides) Remarque: le test initial est recommandé de déterminer le volume de surnageant récupéré à partir d'échantillons homogénéisés et clarifiées suite à l'ajout de 1 ml GPB / g d'aliment. Ce protocole suppose que au moins 1,2 ml clarifiées surnageant sera récupéré à partir d'un échantillon de 2 g. Augmenter la taille de l'échantillon si nécessaire.
      1. Peser 10 g d'échantillon solide dans un tube conique de 50 ml et mettre de côté. Ceci sera utilisé comme diluant.
      2. Peser 2 g de solide échantillon de produit alimentaire dans un second tube conique de 50 ml.
      3. ATTENTION: Cette étape utilise BoNT et une extrême prudence doit être utilisé lors de la manipulation et de l'élimination de tous les réactifs et les matériaux qui entrent en contact avec la toxine. L'utilisation des équipements de protection individuelle et l'élimination de toutes les matièress doivent être effectuées selon le ministère de lignes directrices du travail de l'OSHA pour BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) des États-Unis. Ajouter BoNT / A à la surface de l'échantillon 2 g à une concentration finale de 30 000 mLD ₅₀ / g nourriture (total 60000 mLD _50).
      4. Incuber les échantillons dopés diluant et à la température ambiante ou à 4 ° C pendant 2 heures pour donner le temps de BoNT d'interagir avec la matrice alimentaire, imitant une contamination naturelle.
2. homogénéisation de l'échantillon et le tampon ajustement. Traiter l'échantillon de courbe standard enrichi et diluant généré ci-dessus selon le type d'échantillon.
   1. Les échantillons de faible complexité
      1. Aucun autre traitement de l'échantillon est nécessaire.
   2. échantillons d'aliments liquides (ou d'autres échantillons de liquides complexes)
      1. Aucun échantillon homogénéisation est nécessaire.
      2. Ajouter 140 pi de tampon 10x de neutralisation de 1,4 ml échantillon enrichi et 1 ml 10x Neutralization tampon à l'échantillon de 10 ml de diluant. Bien mélanger les échantillons par inversion.
      3. Clarifier partiellement les deux échantillons par centrifugation pendant 10 min à 6000 x g et 4 ° C. Retirer immédiatement les surnageants et transférer dans de nouveaux tubes.
   3. Échantillons d'aliments solides (ou d'autres échantillons solides)
      1. Ajouter 2 ml GPB (1 ml GPB / g d'aliment) à la 2 g BoNT / A-échantillon enrichi de nourriture solide et 10 ml GPB à l'échantillon de 10 g de diluant.
      2. Homogénéiser les échantillons à l'aide d'un pilon jusqu'à ce que bien mélangé. En fonction de la nature de l'échantillon, il peut y avoir de petits morceaux de matériau qui ne peut pas être homogénéisée, ce qui est acceptable. Alternativement, les méthodes d'homogénéisation mécaniques peuvent être utilisés. L'utilisation d'un mélangeur n'est pas recommandé car il peut inactiver ainsi que aérosoliser la toxine.
      3. Ajouter le volume de 1/10e de tampon 10x neutralisation de l'échantillon de diluant sur ​​la base du volume total approximatif (par exemple 2 ml, si le volume est de 20 ml). Extrapolerle volume total de l'/ A-échantillon enrichi BoNT et ajouter du volume de 1/10e de 10x tampon de neutralisation. Bien mélanger les échantillons par inversion.
      4. Clarifier partiellement les deux échantillons par centrifugation pendant 10 min à 6000 x g et 4 ° C. Retirer immédiatement les surnageants et transférer dans de nouveaux tubes.
3. Préparer des dilutions en série de courbes standards pour les tests
   1. Utilisation de la BoNT / A-dopés exemple de courbe d'étalonnage comme D1 et l'échantillon nonspiked comme diluant, de générer les échantillons restants de la courbe standard de 1,5 ml microtubes selon le tableau 3.

3. Préparer des échantillons inconnus

Cette section peut être complété en parallèle à la section 2.

1. Déterminer le nombre et les dilutions d'inconnues. Testez inconnues en triple exemplaire, si possible.
   1. Pour les analyses qualitatives, exécutez les inconnues sans dilution supplémentaire n'est requis pour traiter l'échantillon comme descriLit ci-dessous.
   2. Pour des dosages quantitatifs, préparer au moins deux échantillons de dilution 1:10, tel que décrit ci-dessous, afin de s'assurer que un ou plusieurs échantillons tombent dans la plage linéaire de la réponse du dosage. Générer des dilutions en utilisant un diluant de la même matrice que l'inconnu, si possible, pour réduire les effets de la matrice comme décrit dans la section 3. Sinon, utilisez PBS ou GPB comme diluant.
2. La génération et la dilution des échantillons inconnus d'après le type d'échantillon.
   1. Inconnues faible complexité (par exemple PBS, GPB, ou pharmaceutique)
      1. Ajouter au moins 750 pi inconnus dans un tube à centrifuger pour générer Inconnu dilution 1.
      2. Ajouter 675 pi de diluant pour deux tubes à centrifuger marqués Inconnu dilution 2 et 3. Le diluant est le même matériau utilisé pour la génération de la courbe standard.
      3. Série diluer dilution 1 en transférant 75 ul de dilution 1 dans le tube dilution 2 et mélanger.
      4. Série DILUTe dilution 2 en transférant 75 ul de dilution 2 dans le tube dilution 3 et mélanger.
   2. Inconnues alimentaires liquides (ou d'autres échantillons de liquides complexes) Note: le test initial est recommandé de déterminer le volume de surnageant récupéré à partir d'échantillons clarifiés comme indiqué à la section 3. Augmenter la taille de l'échantillon si nécessaire.
      1. Ajouter ≥ 875 pi de l'inconnu liquide dans un tube à centrifuger.
      2. Ajouter le volume de 1/10e de tampon 10x neutralisation de l'échantillon (par exemple 87,5 pi d'un échantillon de 875 pi).
      3. Clarifier partiellement l'échantillon par centrifugation pendant 10 min à 6000 x g et 4 ° C. Transférer immédiatement le surnageant dans un nouveau tube. C'est Inconnu dilution 1.
      4. Ajouter 675 pi de diluant pour deux tubes étiquetés Inconnu dilution 2 et 3. Le diluant est le même matériau traité utilisé pour la génération de la courbe standard.
      5. Série diluer dilution 1 par transfertanneau 75 ul de dilution 1 dans le tube dilution 2 et le mixage.
      6. Série diluer dilution 2 en transférant 75 ul de dilution 2 dans le tube dilution 3 et mélanger.
   3. Inconnues solides alimentaires (ou d'autres échantillons solides) Remarque: le test initial est recommandé de déterminer le volume de surnageant récupéré à partir d'échantillons clarifié comme on le verra dans la section 3. Augmenter la taille de l'échantillon si nécessaire.
      1. Peser 2 g de l'échantillon inconnu solide dans un tube conique de 50 ml.
      2. Ajouter 2 ml GPB (1 ml GPB / g d'aliment) à l'échantillon de 2 g solide.
      3. Homogénéiser les échantillons comme décrit dans la section 3.2.3.2.
      4. Ajouter le volume de 1/10e de 10x tampon de neutralisation de l'échantillon sur la base du volume total approximatif (par exemple 0,4 ml si le volume est de 4 ml). Bien mélanger les échantillons par inversion.
      5. Clarifier partiellement l'échantillon par centrifugation pendant 10 min à 6000 x g et 4 ° C. Immediateltransfert de 750 ul de y ≥ surnageant dans un tube à centrifuger. C'est Inconnu dilution 1.
      6. Ajouter 675 ml de diluant à deux tubes étiquetés Inconnu dilution 2 et 3. Le diluant est le même matériau traité utilisé pour la génération de la courbe standard.
      7. Série diluer dilution 1 en transférant 75 ul de dilution 1 dans le tube dilution 2 et mélanger.
      8. Série diluer dilution 2 en transférant 75 ul de dilution 2 dans le tube dilution 3 et mélanger.

4. Clarification de l'échantillon final

Si le liquide d'essai ou des échantillons d'aliments solides, centrifugeuse tous les échantillons pendant 5 min à 14 000 xg ≥ dans une micro pour clarifier pleinement les échantillons. Retirer immédiatement les surnageants et transférer dans de nouveaux tubes.

5. Configuration de la plaque et BoNT / un menu déroulant

1. Le plan de plaque spécifique dépend de l'application, mais ne pas utiliser les puits à l'extérieur de manièrepour éviter les effets de bord. Chaque échantillon inconnu et un échantillon de courbe standard D1-D8 nécessite 3 puits tandis que l'échantillon D9 nécessite 6 puits. Un plan de plaque suggéré est représenté sur la figure 1.
2. Ajouter 20 ul de 10 x tampon de liaison à chaque puits pour être utilisé.
3. Ajouter 200 ul de chaque dilution clarifié et inconnu à chacun des trois puits (six puits pour D9) pour les tests de trois exemplaires. Mélanger la plaque pendant 10 secondes sur un mélangeur à microplaque.
4. Ajouter les perles IP-A.
   1. Vortex les perles IP-A pendant 10 secondes à la vitesse la plus élevée. Continuer vortex si perles ne sont pas entièrement remises en suspension et homogène.
   2. Pipette 20 ul IP-A perles à chaque échantillon ainsi.
   3. Mélanger la plaque pendant 30 secondes sur un mélangeur à microplaque.
5. Incuber la plaque à l'aide d'une plaque de l'incubateur rotatif pendant 2 heures à 750 tours par minute, 25 ° C ou à la température ambiante. Les performances du test est très dépendante de la génération et le maintien de l'IP-A suspension de billes pendant toutes les étapes d'incubation. Toujours perles resuspendre avec un microPmélangeur tard après la granulation et de maintenir la suspension à l'aide d'une plaque de microtitration agitation pendant toutes les étapes d'incubation.

6. Plaque à laver et perle Resuspension

1. Laver les plaques à la main ou à l'aide d'une plaque magnétique automatisé laveur de perles-compatible. Une machine à laver automatique de plaque configuré pour billes magnétiques augmente considérablement le débit dosage.
   1. Lave-Manuel
      1. Etiqueter un tube conique de 50 ml "tampon 1x Wash" et ajouter 45 ml d'eau de qualité de biologie moléculaire et 5 ml 10x matrice tampon de lavage. Mélanger tampon bien par inversion.
      2. Retirer la plaque de la plaque tournante incubateur.
      3. Placer immédiatement la plaque sur une bille magnétique plaque de 96 puits de séparation pendant 5 min.
      4. Tout en gardant la plaque sur la plaque de 96 puits séparation par billes magnétiques, retirez délicatement et jeter les surnageants des puits d'échantillon à l'aide d'une pipette multi-canal unique ou. Ne pas aspirerperles visuellement surveiller le tampon aspiré dans la pointe de pipette pour le retrait accidentel du cordon. Si le retrait est témoin, ajouter délicatement le contenu de la pointe vers le bien, reséparer, et répéter l'enlèvement.
      5. Ajouter 300 ul de tampon de lavage 1x pour chaque échantillon.
      6. Remettre en suspension les billes entièrement en mélangeant la plaque pendant 30 secondes sur un mélangeur à microplaque.
      7. Incuber la plaque sur la bille magnétique plaque de 96 puits de séparation pendant 2 min.
      8. Retirez et jetez les surnageants des puits d'échantillon comme avant.
      9. Répétez les étapes 6.1.1.5-6.1.1.8 trois fois pour un total de 4 lavages.
      10. Avec la plaque sur la bille magnétique plaque à 96 puits de séparation, inspecter visuellement les puits pour confirmer la suppression même surnageant; utiliser une pipette pour enlever l'excès de tampon résiduel nécessaire. Certains tampon restera dans les puits et des précautions doivent être prises pour éviter le retrait de talon ou de séchage des billes.
      11. Ajouter 50 ul de tampon de réaction 1x pour chaque échantillon et mélanger la plaque 30 sec sur un mélangeur à microplaque pour remettre en suspension les billes entièrement. Si nécessaire, utiliser une pipette pour remettre en suspension entièrement les perles.
   2. Lave-automatique de plaques
      1. Configuration de la machine à laver et d'un programme selon le tableau 4. Nettoyez et rincez la vaisselle de haute qualité (par exemple nanopure) de l'eau.
      2. Premier de la rondelle en exécutant le programme "Premier".
      3. Retirer la plaque de la plaque tournante incubateur.
      4. Placer immédiatement la plaque sur la bille magnétique plaque de 96 puits de séparation sur la rondelle de la plaque.
      5. Exécutez le programme de lien "Maître Wash". La première étape du programme est une étape d'incubation de 5 min lorsque la rondelle est à l'arrêt.
      6. Après l'achèvement du programme, retirez la plaque de la machine à laver, ajouter un tampon de réaction 1x 50 pi de chaque échantillon, et mélanger la plaque pendant 30 secondes sur un mélangeur de microplaques pour remettre en suspension entièrement les perles. Si nécessaire, utiliser une pipette pour remettre en suspension entièrement les perles.

7. Essai Initiation et incubation

1. Ajouter 50 ul de 0,5 uM A / E journaliste (voir chapitre 1) pour chaque échantillon et mélanger pendant 30 secondes sur un mélangeur de microplaques pour remettre en suspension entièrement les perles.
2. Ajouter 100 ul d'eau à chaque puits utilisé sur la plaque pour éviter les effets de bord.
3. Sceller la plaque avec la plaque film adhésif et incuber la plaque à l'aide d'une plaque incubateur tournant à 750 tours par minute, 25 ° C ou RT. Protéger la plaque de la lumière pendant l'incubation.

8. Collecte et analyse des données

Remarque: Cette analyse est une analyse en temps réel qui peut être mesurée à plusieurs reprises jusqu'à ce que la sensibilité souhaitée est obtenue, il n'y a pas de butée de réactifs nécessaires. Recommandés temps de lecture initiales sont 2, 4, et 24 heures de temps d'incubation avec la sensibilité du test augmente avec le temps d'incubation.

1. La collecte des données
   1. A chaque temps de lecture, retirez la plaque de la plaque tournante incubateur, retirer le jointment du ruban, et placer immédiatement la plaque sur la bille magnétique plaque de 96 puits de séparation. Permettre aux billes de se séparer pendant 2 min.
   2. Placer la plaque dans le lecteur de microplaques et de mesurer les émissions à ~ 470 et ~ 526 nm sous excitation à 434 nm ~.
   3. Si le temps de lecture supplémentaires sont souhaités, remettre en suspension les perles pendant 30 secondes sur le mélangeur de microplaques, refermer la plaque, et retourner la plaque à la plaque tournante incubateur.
2. L'analyse des données
   1. Calculer le rapport d'émission pour chaque échantillon en divisant l'unité de fluorescence relative (RFU) de la valeur à 526 nm par la valeur de la RFU à 470 nm.
   2. Tracer le rapport d'émission en fonction du log [BoNT / A] pour les points de données de courbe standard. Selon la BoNT / A Gamme de puissance testé, une courbe dose-réponse sigmoïde sera obtenue (voir Résultats représentant).
   3. Monter les données de la courbe standard avec la courbe dose-réponse à pente variable Y = Bottom + (Haut-Bas) / (1 ​​+10 ^ ((logEC _50-X) * versant)) où X est lelogarithme de la concentration, Y est la réponse, et Y commence à fond et va de la page avec une forme sigmoïde.
   4. Déterminer les limites de détection (LOD), limites de quantification (LQ), et la concentration efficace demi-maximale (CE _50). Les limites de détection sont définis comme un échantillon ayant un rapport d'émission moins de 3 écarts-types (DS) ci-dessous les témoins à blanc (n = 6). Limites de quantification sont définis comme un échantillon ayant un rapport d'émission moins de 10 DS ci-dessous les témoins à blanc (n = 6). CE ₅₀ est déterminée à partir de l'ajustement de courbe dose-réponse sigmoïdale.
   5. Interpoler la puissance de tous les échantillons inconnus contre la courbe standard dose-réponse sigmoïde.
      1. Pour obtenir des résultats quantitatifs, l'échantillon inconnu devrait idéalement s'inscrire dans la partie linéaire de la courbe étalon. Approximation de la partie linéaire de la courbe d'étalonnage en calculant le total fenêtre de réponse de dosage de 20 à 80% (par exemple, si le rapport d'émission de la courbe r-typeanges de 0,5 à 2,5, la plage linéaire serait la portion de la courbe d'étalonnage qui varie de 0,9 à 2,1).
      2. Pour obtenir des résultats qualitatifs, comparer l'échantillon inconnu contre la LD et la LQ de la courbe standard.
      3. Ne pas extrapoler les échantillons inconnus au-delà des limites de la courbe standard.

Results

Un diagramme résumant les étapes du protocole décrit est représenté sur la figure 2. Le dosage nécessite entre 4-26 heures à compléter en fonction du type d'échantillon et la sensibilité du test désiré, mais seulement ~ 2 heures de temps de manipulation. Le dosage est réalisé dans des plaques à 96 puits et, en fonction du type de test en cours d'exécution, permet de tester trois exemplaires de jusqu'à 20 échantillons par plaque y compris les normes.

La figure 3

Discussion

Ce protocole décrit les procédures permettant de quantifier BoNT / A complexe, holotoxine, ou Clostridium surnageant de culture dans des matrices complexes. Le protocole est le même, cependant, lors de l'essai d'autres sérotypes BoNT (par exemple de BoNT / B, E et F) avec leurs dosages matricielles respectives ^56,60, même si la sensibilité dosage variera selon les sérotypes et dosages. Ce protocole ne tient pas compte de tous les types d'échantillon possible et certaines modifica...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de détection de la neurotoxine botulique BoTest Matrix A	BioSentinel	A1015	Des kits de détection pour BoNT/B et F sont également disponibles.
Lecteur de microplaques à fluorescence Varioskan Flash	Thermo Fisher Scientific	5250040	La plupart des unités à base de monochromateurs ou de filtres avec une excitation de 434 nm et une capacité d’émission de 470 nm et 526 nm peuvent être utilisées.
Plaque de séparation de billes magnétiques à 96 puits	V& P Scientific	VP771H	D’autres plaques magnétiques peuvent être utilisées, mais la plaque doit être conçue pour séparer les billes sur le côté du puits.
Laveuse de plaques compatible avec les billes magnétiques	BioTek	ELx405 VSRM	En option, uniquement nécessaire pour le lavage automatisé des plaques. D’autres rondelles de plaques compatibles avec les billes magnétiques peuvent également être utilisées, mais doivent être testées avant utilisation.
Microcentrifugeuse			En option, elle n’est nécessaire que pour les échantillons nécessitant une centrifugation.
Mélangeur à plaques MixMate	Eppendorf	22674200
Agitateur			Utilisé à température ambiante ou à 25 ° ; C Si le contrôle de la température est disponible
Comprimés inhibiteurs de protéase sans EDTA	Roche	4693132001	Uniquement requis pour les tests alimentaires ou environnementaux. Les inhibiteurs de la protéase doivent être exempts d’EDTA.
BoNT/A	Métabiologics		Facultatif, requis uniquement à des fins de normalisation et de quantification
Plaques noires, à fond plat à 96 puits	NUNC	237105	Les plaques ne doivent pas être traitées
Ruban d’étanchéité à 96 puits Thermo	Fisher Scientific	15036