Article de méthode

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours C. elegans Embryogenèse

DOI :

10.3791/51188

⸱

12 mars 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit comment l'image des cellules en division dans un tissu en Caenorhabditis elegans embryons. Bien que de nombreux protocoles décrivent comment la division cellulaire de l'image dans l'embryon précoce, ce protocole décrit comment l'image de la division cellulaire dans un tissu en développement au cours de l'embryogenèse tardive milieu.

Résumé

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Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie de fluorescence à l'image à l'intérieur de la division des cellules en développement Caenorhabditis elegans embryons. En particulier, ce protocole met l'accent sur la façon de l'image divisant neuroblastes, qui se trouvent sous les cellules de l'épiderme et peuvent être importants pour la morphogenèse épidermique. formation de tissus est cruciale pour le développement de métazoaires et s'appuie sur des indices externes de tissus voisins. C. elegans est un excellent organisme modèle pour étudier la morphogenèse des tissus in vivo en raison de sa transparence et de l'organisation simple, faire ses tissus faciles à étudier par microscopie. Enceinte ventrale est le processus où la surface ventrale de l'embryon est recouvert d'une seule couche de cellules épithéliales. Cet événement est pensé pour être facilitée par les neuroblastes sous-jacents, qui fournissent orientation chimique indices de médiation migration des cellules épithéliales recouvrant. Toutefois, les neuroblastes sont très proliférante et peuvent également agircomme substrat mécanique pour les cellules épidermiques ventrales. Les études utilisant ce protocole expérimental pourraient découvrir l'importance de la communication intercellulaire pendant la formation du tissu, et pourraient être utilisées pour révéler les rôles des gènes impliqués dans la division cellulaire dans les tissus en développement.

Introduction

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Bien qu'il existe des protocoles décrivant la manière de la division cellulaire de l'image au début C. elegans embryon, ce protocole décrit comment la division cellulaire de l'image dans un tissu à la mi embryogenèse. L'un des principaux défis dans les organismes d'imagerie au cours du développement a été leur sensibilité à la phototoxicité. Cependant, l'augmentation de l'accessibilité à la filature microscopes confocaux disque ou microscopes champ balayé a permis des applications d'imagerie les plus répandues. Les deux systèmes utilisent des lasers à l'état solide et la lumière diffusée, ce qui limite les niveaux de rayons UV que les organismes sont exposés. Toutefois, les peuplements Widefield peuvent encore être utilisés pour l'imagerie in vivo, en particulier s'ils sont équipés de caméras à haute sensibilité (par exemple EMCCD), le contrôle de l'ouverture et contrôle de la lumière (par exemple des LED ou des ampoules de mercure réglables). Ce protocole décrit comment utiliser soit un système confocal base ou un système à grand champ de la division cellulaire de l'image dans le développement C. elegans </ Em> embryons. A titre d'exemple, nous décrivons comment l'image de la division cellulaire des neuroblastes. Neuroblastes peuvent faciliter la morphogenèse épidermique en fournissant des signaux chimiques ou mécaniques pour les cellules de l'épiderme sus-jacentes, et de fournir un excellent exemple de l'importance de la communication intercellulaire dans la formation des tissus.

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle idéal pour les études fondées microscopie en raison de sa transparence et de l'organisation simple tissu 1. Par ailleurs, C. elegans se prête à des méthodes génétiques et RNAi, et puisque plusieurs de ses gènes ont des homologues humains, il peut être utilisé pour identifier les mécanismes conservées pour la formation de tissu 2-5. Dans C. elegans, la formation de l'épiderme survient pendant l'embryogenèse milieu, quand l'embryon a> 300 cellules. Morphogenèse épidermique se compose de plusieurs phases principales, au cours de laquelle l'embryon est enfermé dans une couche de cellules épidermiques qui compriment et s'étendent à transformer le embryo d'une forme ovoïde dans la forme allongée d'un ver 6. Décrit une enceinte ventrale de ces événements morphogénétiques, lorsque les cellules épidermiques ventrales migrent vers la ligne médiane ventrale à couvrir la surface ventrale de l'embryon (figure 1). Tout d'abord, deux paires de cellules de premier plan de bord antérieure située migrent vers la ligne médiane ventrale, où elles adhèrent et fusionnent avec leurs voisins controlatérales 6. Elle est suivie par la migration des cellules de poche postérieure situé, qui forment coin comme des formes en créant une poche ventrale 6-7. Le mécanisme qui ferme la poche n'est pas bien comprise. Une possibilité est que la structure de la myosine contractile actine supracellular lie les cellules de poche ensemble dans une chaîne de sac à main comme la mode, semblable à la cicatrisation des plaies 8. Fait intéressant, la migration d'une partie des cellules de la poche est médiée par des sous-ensembles spécifiques de sous-jacents 9 neuroblastes (précurseurs neuronaux qui se trouvent en dessous de la epidermis, figure 1B).

Des études antérieures ont montré que les neuroblastes régulent la migration ventrale des cellules épidermiques et de l'enceinte ventral. VAB-1 (récepteur Ephrin) et (ligand Ephrin) VAB-2 est fortement exprimé dans les neuroblastes et faciliter le tri des antérieur et neuroblastes postérieures les unes des autres, et mutations dans VAB-1 ou VAB-2 provoquent enceinte ventrale phénotypes 10-13. Cependant, les expériences de sauvetage de promoteurs ont montré que VAB-1 est également nécessaire dans les cellules épidermiques ventrales jacentes et des récepteurs pour d'autres signaux de guidage sécrétées par les neuroblastes sont exprimés dans les cellules de l'épiderme ventral 9. Bien que des mutations dans l'un de ces récepteurs provoquent phénotypes de l'enceinte ventrales, il n'est pas clair si les défauts se produisent en raison de problèmes de positionnement des neuroblastes ou en raison de l'échec des cellules épidermiques ventrales pour répondre aux signaux de guidage 14. Modification de la répartition des neuroblastes wiThoout affectant leur capacité à sécréter des signaux de guidage pourrait faire la lumière sur le rôle des neuroblastes et leur capacité à apporter une contribution mécanique au cours de la morphogenèse épidermique. Récemment, il a été constaté qu'un gène de la division cellulaire, ani-1 (anillin) est fortement exprimé dans les neuroblastes (figure 2A) et son appauvrissement provoque neuroblastes défauts de division. Fait intéressant, ces embryons présentent ventrales phénotypes de l'enceinte (Fotopoulos, Wernike et Piekny, observations non publiées).

Anillin est requis pour la division cellulaire, et en particulier pour la cytokinèse, qui décrit le processus par lequel une cellule mère sépare physiquement en deux cellules filles. Cytocinèse est entraîné par la formation d'un anneau contractile actomyosine, qui doit être étroitement contrôlée dans l'espace et le temps pour s'assurer qu'il est correctement couplée avec la sœur de chromatides ségrégation. Le régulateur principal de la cytokinèse métazoaires est RhoA (RHO-1 chez C. elegans), une petite GTPase qui est unctive dans sa forme liée au GTP. La FEM Ect2/ECT-2 RhoA active, après quoi interagit RhoA-GTP avec des effecteurs en aval, qui forment l'anneau contractile et la médiation de son l'admission 15. Anillin est une protéine de domaine qui se lie à plusieurs RhoA via son extrémité C-terminale et à l'actine et de la myosine par l'intermédiaire de son extrémité N-terminale. Anillin est nécessaire pour stabiliser la position de l'anneau contractile dans des cellules de mammifères ou de Drosophila S2 16. Anillin épuisement provoque des anneaux contractiles à des oscillations latérales, et la cytokinèse échoue finalement former des cellules multinucléées 17-19. Fait intéressant, bien que C. elegans ani-1 coordonne actomyosin contractilité dans l'embryon précoce, il n'est pas essentiel pour la cytokinèse. Cependant, comme décrit ci-dessus, ani-1 est requise pour la cytokinèse neuroblastes durant l'embryogenèse (mi-Fotopoulos, Wernike et Piekny, observations non publiées). l'échec de la cytokinèse modifierait le nombre et la position des neuroblastes et pourrait affecter la loction de signaux de guidage chimiques, ou il peut modifier les propriétés mécaniques du tissu. Les deux modèles mettent en évidence le rôle non autonome de neuroblastes pour enceinte ventrale, et l'importance de la communication tissus tissus au cours du développement embryonnaire.

Ce protocole expérimental décrit comment la division cellulaire de l'image pendant C. elegans mi embryogenèse en utilisant la microscopie de fluorescence. La majorité des expériences qui étudient les mécanismes de la division cellulaire ont été réalisées dans des cellules individuelles dans des boîtes de culture (par exemple. Des cellules HeLa ou S2) ou dans les embryons précoces avec un nombre limité de cellules (par exemple C. elegans embryon d'une cellule, Xenopus, ou échinoderme embryons). Cependant, il est également important d'étudier la division cellulaire dans les tissus, car il existe des indices externes qui peuvent influer sur la synchronisation et la mise en place du plan de division. En outre, les cellules peuvent fournir des indices chimiques ou mécaniques d'influencer le développement du tissu voisins, et il est important de comprendre comment la communication intercellulaire aide tissus pour former au cours du développement.

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Protocole

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Une. Préparation des plaques pour le maintien des souches de vers et de la réalisation de RNAi

  1. Plaques nématode croissance médias
    1. Plaques
      1. Préparer le nématode croissance médias (NGM) plaques pour maintenir les souches de vers et de réaliser des croisements génétiques. Moissonneuse 3 g de NaCl, 17 g de gélose et de 2,5 g de bactopeptone avec 1 L d'eau distillée dans un flacon de 2 litres et ajoutez un barreau d'agitation de métal.
      2. Autoclave le ballon pour dissoudre l'agar-agar et de stériliser les médias. Ensuite, placer le ballon sur une plaque d'agitation et de permettre aux médias de se refroidir en remuant.
      3. Une fois le support refroidi et est encore un peu chaud au toucher (45-50 ° C), ajouter 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml de solution à 5 mg / ml de cholestérol et 25 ml 1 M tampon phosphate de potassium (PPB; recette dans le tableau de réactifs / matériel; filtre stériliser solutions mères) et verser immédiatement les médias en petites boîtes de Pétri (60 mm x 15 mm; remplir les plats ~ 3/4 vers le haut ou 13 ml / plaque USIng un distributeur automatique). Remarque: Pour le maintien à long terme de certains souches tetracycline peut être ajouté aux plaques (12,5 pg / ml) pour permettre transposon Tn10 inactivation du gène de la RNase III bactérienne.
      4. Que les médias se solidifient pendant une nuit à température ambiante. Remarque: Les plaques doivent être conservés dans une hotte biologique ou dans une zone du laboratoire qui est moins sujette à contamination. En outre, supprimer toute condensation qui s'est accumulée sur les couvercles (par exemple, nettoyer avec du papier de soie) pour limiter la contamination fongique. Si la tétracycline est également ajouté aux plaques, puis les couvrir de papier d'aluminium que cet antibiotique est sensible à la lumière.
      5. Le lendemain, ensemencer les plaques NGM secs avec une suspension de E. coli (souche OP50, voir la section 1.1.2) qui a été doucement au vortex. Pour fabriquer des plaques pour l'accouplement, ajouter ~ 50 pi de OP50 au centre de chaque assiette (pour former un petit cercle). Pour fabriquer des plaques pour maintenir les souches de vers, de semences chaque plaque NGM avec ~ 100-200 pi de OP50 (àveiller à ce qu'elle couvre une plus grande surface de la plaque).
      6. Laissez les plaques ensemencées O sec / N à la température ambiante.
      7. Le lendemain, tourner les plaques NGM séchées à l'envers et les empiler dans des contenants de rangement en plastique à 4 ° C. Remarque: Les plaques sont utilisables jusqu'à ~ 3-4 semaines. Les plaques contenant la tétracycline doivent être maintenus dans l'obscurité.
    2. Nourriture
      1. Utilisez E. coli OP50 [du Caenorhabditis Centre de Génétique (CCG; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] comme une source de nourriture pour C. . elegans Remarque: OP50 peut être stocké sous forme de solutions mères de glycerol à -80 ° C (rapport 1:1 dans 50% v / v de glycerol).
      2. Pour faire OP50 pour les plaques NGM, faire une plaque de série en utilisant une petite aliquote de la stock de glycérol (<10 pi; utiliser une pipette stérile). Répartir les bactéries sur une plaque de gélose LB (recette dans le tableau de réactifs / matériaux) et laissez-le à 37 ° C pendant environ 16 heures. Remarque: S'il ya des problèmes de contamination, la streptomycine OP50 résistant peut être utilisé, unnd streptomycine peuvent être ajoutés à des plaques de gélose LB (50 pg / ml).
      3. Le lendemain, choisir une seule colonie et inoculer 100 ml de milieu liquide LB (recette dans le tableau de réactifs / matériaux) dans un flacon de 500 ml.
      4. Que la culture croître O / N à 37 ° C avec agitation.
      5. Le lendemain, utilisez la suspension bactérienne pour l'ensemencement des plaques NGM. Remarque: OP50 peut être réparti en portions aliquotes dans 50 ml tubes coniques et stocké à 4 ° C pendant ~ 4-6 semaines.
  2. ARNi
    L'alimentation est l'un des principaux moyens pour effectuer l'interférence ARN médiée (ARNi; knockdown à un produit de gène spécifique) en C. elegans. C. hermaphrodites elegans peuvent être alimentés E. coli souche HT115 transformée avec un vecteur d'avance qui exprime l'ARN double brin lors de l'induction. Cet ARN double brin (ou ses fragments) sont transmises à la gonade, qui entraîne en général knockdown substantielle du gène cible spécifique.
    1. ARNi plaques
      1. Préparer des plaques NGM comme décrit ci-dessus (voir la section 1.1.1), mais aussi ajouter 1 ml de 1 M IPTG (isopropyl-beta-D-galactoside, pour induire l'expression de l'ARN double brin) et 500 ul de 50 mg / ml d'ampicilline (Amp; vecteurs exprimant l'ARN double brin sont Amp résistant) à la presse à chaud (45-50 ° C).
      2. Après que les plaques ont séché, les épépiner avec ~ 50-100 ul de E. coli HT115 (voir section 1.2.2). Remarque: les plaques non ensemencés peuvent être stockés à 4 ° C pendant ~ 4-5 semaines.
      3. Laissez les plaques ensemencées sécher toute la nuit à température ambiante.
      4. Le lendemain, tourner les plaques ARNi séchées à l'envers et les stocker dans un conteneur de stockage en plastique à 15-20 ° C. Note: les plaques ensemencées conservent l'efficacité de l'ARNi pour jusqu'à ~ 2-3 semaines.
    2. ARNi alimentaire
      1. Utilisez E. coli HT115 (de la CCG, voir la section 1.1.2) transformée avec le vecteur L4440 d'alimentation, ou L4440 contenant de l'ADNc à un gène d'intérêt. Remarque: L'alimentation de bibliothèques qui ciblent la plupart des cadres de lecture ouverts dans le génomeont déjà été faites et sont disponibles (clones L4440 transformés en HT115, par exemple contenant un fragment de Y49E10.19 pour ani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / pages / rnai.html). Remarque: HT115 peut être maintenu en stock de glycérol à -80 ° C (rapport 1:1 dans 50% v / v de glycérol).
      2. Pour générer une nouvelle construction ciblant un gène d'intérêt, voir la carte vectorielle L4440 et clone ADNc entre les promoteurs T7 accompagnement, qui sont inductible par l'IPTG.
      3. Transformer HT115 avec la construction d'L4440 utilisant un protocole standard pour la transformation (par exemple faire bactéries chimiquement compétentes et effectuer la transformation de choc thermique).
      4. Comme décrit pour OP50 (voir section 1.1.2), les bactéries à balayage du stock de glycérol sur une plaque de gélose LB, mais la plaque doivent également contenir 50 pg / ml d'ampicilline. Remarque: Si vous utilisez une construction pré L4440 existant, passez articles 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Choisissez une seule colonie et inoculer 5 mlde milieu LB contenant 5 ul d'ampicilline de 50 mg / stock ml (LB Amp), et placez-le à 37 ° C avec agitation.
      6. Après ~ 16 heures, inoculer 5 ml de milieu LB frais Amp avec 50 ul de la culture O / N et développer la culture de 7-8 heures avec agitation à 37 ° C.
      7. Centrifuger les bactéries pendant 1 min à 4,000-8,000 xg, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul de milieu LB frais Amp.
      8. Utilisez cette solution bactérienne pour ensemencer les plaques ARNi comme décrit ci-dessus (voir section 1.2.1). Remarque: HT115 doit être utilisé immédiatement et ne doit pas être stockée.

2. Culture de souches de vers

Maintenir C. souches elegans commandés de la CCG sur des plaques NGM selon le protocole standard 1. Souches utilisées pour ce protocole sont: C. elegans var Bristol, de type sauvage (souche ID au CCG N2); unc-119 (tm4063); wgIs102 [jambon-1 :: TY1 :: EGFP :: 3xFLAG + unc-119 (+)] (souche ID au CCG OP102); unc-119 (ed3); ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (souche ID au CCG OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (souche ID au CCG SU159); unc-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + unc-119 (+)] (souche ID au CCG FT250).

  1. Choisissez ~ 3 jeunes hermaphrodites adultes qui affichent le phénotype correct pour une plaque NGM frais. Note: N2 (var. Bristol; type sauvage) peut être maintenue entre 15-25 ° C, mais ils atteindra densité plus rapidement à des températures plus élevées. Nouvelles actions doivent être effectuées lorsque la densité de ver est élevé.
  2. Gardez toutes les souches fluorescentes (par exemple GFP et / ou les vers mCherry exprimant) à 20-25 ° C pour une expression optimale des protéines fluorescentes. Nouvelles actions doivent être effectuées lorsque la densité de ver est élevé et la nourriture est faible.
  3. Pour reprendre les vers, utiliser unchoisir fabriqué à partir d'une pipette de verre tiré avec un fil de platine fusionné à l'extrémité tirée (~ 3-5 cm de longueur). Aplatir le fil avec un bord lisse. Utilisez la pioche de scoop 'jusqu'à hermaphrodites et les transférer sur de nouvelles plaques. Flamber le fil entre chaque utilisation pour éviter la contamination croisée des souches.

3. ARNi

  1. Exécution d'ARNi
    1. Tout d'abord, lieu ~ 8 hermaphrodites L4 sur une plaque non ensemencée NGM pour ~ 30-60 min pour éliminer les bactéries OP50 des vers.
    2. Ensuite, placez les 8 hermaphrodites sur une plaque NGM Amp IPTG ensemencé avec HT115 qui porte le plasmide L4440 exprimant l'ARN double brin à un gène d'intérêt (par exemple, de l'anus-1;. Voir 1.2) pour ~ 24 h. Remarque: Selon le gène d'intérêt, ou les phénotypes souhaités (qui peut dépendre de la force du knockdown), les vers peuvent être laissés sur les plaques d'ARNi pour des périodes plus ou moins longues (après 24 h, placer les hermaphrodites sur ARNi frais plaques).
    3. Pour un negcontrôle ative, place des vers sur une plaque ARNi ensemencées avec HT115 portant le L4440 vecteur vide. Remarque: Ces embryons ne devraient pas avoir phénotypes.
    4. Pour un contrôle positif, placer vers sur une plaque ARNi exprimant l'ARN double brin qui cible un gène à des phénotypes bien caractérisés. Remarque: Pour rho-1 (Y51H4A.3), les embryons sont 100% mortelle après 24 h et les hermaphrodites sont stériles après 48 heures.
  2. ARNi efficacité
    Les niveaux de knockdown par ARNi doivent être testés, en particulier depuis certains tissus peuvent être plus résistantes que d'autres. Au cours de l'embryogenèse précoce milieu, la plupart des tissus sont sensibles à l'ARNi, mais à la fin de l'embryon ou de larve, les neurones sont des RNAi-résistant. Différentes souches peuvent être utilisées pour améliorer la sensibilité de l'ARNi (par exemple, far-3), ou pour produire de l'ARNi spécifique à un tissu (par exemple sid-1 en combinaison avec un transgène exprimé par le promoteur neuronal unc-119).
    1. Western Blot
      Immunoblot en utilisant C. elegans protéines peuvent êtreeffectuée selon le protocole standard 22.
      1. Après avoir effectué l'ARNi, collecter ~ 10 gravide (rempli d'embryons) hermaphrodites dans un tube à centrifuger, ajouter 20-30 ul 1x tampon d'échantillon SDS-PAGE et lyse par ébullition pendant ~ 2 min. De même, ramasser les vers N2 dans un tube séparé de l'échantillon de contrôle. Note: Le nombre de hermaphrodites variable en fonction de la sensibilité des anticorps primaires.
      2. Créer des dilutions de l'échantillon de contrôle (par exemple de 3 à 100%) dans du tampon d'échantillon. Chargez le contrôle et les échantillons de RNAi et géré par SDS-PAGE selon le protocole standard (le% de gel varie en fonction de la taille de la protéine d'intérêt).
      3. Transférer le gel à une membrane et effectuer immuno selon le protocole standard. Remarque: Utilisez différentes dilutions d'anticorps primaires et secondaires comme l'a recommandé pour chaque anticorps.
      4. Développer (par exemple si vous utilisez chimiluminescence) ou scanner (par exemple si vous utilisez fluorescence) l'immunoblot et comparer èmedensité de e de bandes dans les voies N2 vs la voie ARNi, et déterminer le niveau d'effet de choc (par exemple, la densité de la voie de l'ARNi correspondant à la voie de contrôle de 12%, ce qui suggère que la protéine est réduite de 88%). Remarque: Pour voir l'efficacité de l'ANI-1 knockdown, voir Maddox et al 23.
    2. Immunocoloration
      Immunocoloration en C. elegans peuvent être effectuées selon le protocole standard 22.
      1. Après avoir effectué l'ARNi, recueillir des hermaphrodites gravides et les embryons de récolte à l'aide de l'une des deux méthodes. Pour l'une des méthodes, place des hermaphrodites dans un tampon M9 (recette dans le tableau de réactifs / matériaux) dans 1,5 ml siliconées microtubes et culot par centrifugation (1,000-4,000 xg). Remarque: même collecter N2 hermaphrodites gravides.
      2. Retirer la solution M9.
      3. Expulser les embryons en ajoutant 1 ml de solution de blanchiment (NaOH 1 M, 5% de l'eau de Javel) dans le tube à centrifuger pendant 3 min. De même, l'eau de Javel N2 ilrmaphrodites à faire des diapositives de contrôle.
      4. Vortex doucement, puis culot immédiatement les embryons par centrifugation (4,000-8,000 xg) et retirer la solution de blanchiment. Remarque: Le temps total que les vers sont incubées avec l'eau de Javel ne doit pas dépasser 5 minutes.
      5. Lavez les embryons 3x avec du Tris Buffered Saline (SCT; 50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM) et d'embryons de transfert à l'aide d'une pipette Pasteur en verre sur un L-lysine poly lame de microscope. Remarque: Pour revêtir une lame de microscope en verre avec de la poly-L-lysine, essuyez d'abord la diapositive, puis ajouter une goutte (~ 20-30 pi) de poly-L-lysine et l'étaler uniformément sur toute la surface et laisser sécher. Pour des résultats optimaux, enduire les lames deux fois plus. Une autre méthode pour recueillir des embryons (Sections 3.2.2.1-3.2.2.5) consiste à placer une goutte de M9 sur un L-lysine poly lame de microscope et prendre ~ 10 hermaphrodites gravides dans la goutte.
      6. Ajouter une lamelle sur le dessus de chaque lame de microscope (à la zone qui contient la plupart des embryons) et le lieules lames dans de l'azote liquide. Remarque: Pour hermaphrodites placés directement dans la chute, mettre la pression sur la lamelle à casser les hermaphrodites et expulser les embryons.
      7. Congelez-fendre les embryons par effleurant les lamelles immédiatement après leur congélation dans l'azote liquide.
      8. Placer les lames dans la glace méthanol froid pendant 20 min pour fixer les embryons. Remarque: Pour certains antigènes, un fixateur comme le paraformaldéhyde réticulation peut être préférable. Voir le protocole de Duerr 22.
      9. Réhydrater et perméabiliser les embryons par lavage des lames 4x avec du Tris Buffered Saline contenant du Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1% Tween-20) pendant 10 minutes chacun.
      10. Sécher chaque diapositive autour de la zone qui contient la plupart des embryons et dessiner un cercle autour des embryons en utilisant un stylo de blocage de liquide (par exemple PAP stylo).
      11. Ajouter ~ 100 ul de TBST avec 5% de sérum d'âne normal (NDS; bloc) à chaque diapositive (zone cerclée) et incuber20 min à température ambiante. Remarque: Placez les diapositives dans une «chambre humide» (par exemple, un plat avec un couvercle contenant des serviettes en papier humide).
      12. Supprimer le blocage, ajouter ~ 50-100 ul d'anticorps primaire (dilué dans du TBST) à chaque coulisseau (zone cerclée) et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Remarque: En fonction de l'anticorps, le temps d'incubation et la dilution variable. Pour détecter la GFP, on utilise un anticorps primaire anti-GFP anti-souris à une dilution de 1/200. Pour détecter ANI-1, nous utilisons un anti-ANI-1 anticorps primaire anti-lapin dans une dilution au 1/1600 (aimablement fourni par Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). Pour de plus longues durées d'incubation, placer les lames à 4 ° C.
      13. Éliminer les anticorps primaires (si possible, conserver pour une utilisation future) et laver les lames 3x avec le SCT pour 5 min chacun.
      14. Retirer le dernier lavage et ajouter de 50 à 100 pl ~ des anticorps secondaires (dilué dans du TBST) à chaque coulisseau (zone cerclée) et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Remarque: Selon l'anticorps, la dilution peut varier. Pour détecter la GFP, nous utilisons un unnti-souris Alexa Fluor 488 anticorps secondaire à une dilution de 1/250. Pour détecter ANI-1, on utilise un Alexa Fluor 568 anticorps secondaire anti-lapin à une dilution au 1/250.
      15. Suppression des anticorps secondaires et laver les lames 3x avec le SCT pour 5 min chacun. Remarque: Pour colorer l'ADN, ajouter ~ 50-100 ul de DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole; 1 mg / ml) à 1/500 dans du TBST dilution pendant 5 min.
      16. Retirer DAPI et laver les lames 2x avec le SCT pour 5 min chacun. Remarque: Si la coloration DAPI n'est pas effectuée, ignorez cette étape de lavage supplémentaire.
      17. Effectuer un lavage rapide avec 0,1 M Tris (pH 9), supprimer et ajouter environ 15 pi de milieu de montage préchauffé à 37 ° C (4% de n-propyle 3.4.5-trihydroxybenzoate (gallate de propyle), Tris 50 mM, pH 9 50% de glycérol) à chaque diapositive (zone cerclée).
      18. Ajouter une lamelle de chaque diapositive (au-dessus du support de montage dans la zone encerclée), évacuer l'excès de liquide et sceller les diapositives avec du vernis à ongles. Remarque: Les diapositives peuvent être stockés à -20 ° C.
      19. Respecter les embryons surles lames en utilisant un microscope à fluorescence à grand champ ou de microscope à balayage laser confocal. Surtout, ajuster les paramètres pour recueillir des images d'intensité de pixel optimale en utilisant le contrôle (N2 ou non ARNi) embryons. Ensuite, recueillir des images à partir d'embryons ARNi utilisant les mêmes paramètres. Exemples d'images recueillies pour le contrôle vs ani-1 embryons d'ARNi sont présentés dans la figure 2B.

4. Préparation des lames pour l'imagerie en direct et récolte des embryons

  1. Préparation des plaquettes d'agarose pour l'imagerie en direct
    1. Placez une lame propre pré réchauffé de microscope entre deux autres diapositives, chacune avec 1-2 bandes de ruban adhésif sur eux.
    2. En utilisant une pipette Pasteur en verre, ajouter une goutte de 2% en poids / volume d'agarose (en solution dans l'eau distillée chauffée) de la glissière.
    3. Placer rapidement d'une seconde, lame de microscope propre au-dessus de la première diapositive d'une manière perpendiculaire à aplatir la goutte d'agarose. Remarque: La bande sur le voisin a glissées fournit l'épaisseur de la garniture.
    4. Laissez le agarose sec pad pour un 1-2 min avant de retirer la lame supérieure. Faites glisser le chariot supérieur attentivement pour éviter de casser le tampon d'agarose dessous. Remarque: Parfois, le tampon est transféré à la glissière en haut et est encore utilisable, tant qu'il reste intact.
    5. Transférer les embryons sur le bloc d'agarose en quelques minutes après sa préparation comme décrit ci-dessous (voir l'étape 4.2). Remarque: Le tampon doit avoir un aspect opaque, une fois il est clair, il est trop sec à utiliser.
  2. embryons de récolte
    1. Utiliser le protocole suivant pour la collecte d'embryons pour l'imagerie en temps réel, qui est dérivé de Sulston et al. 24
    2. Choisissez environ 4-6 adultes gravides (pas affamés) à partir de plaques NGM ou ARNi et les placer dans 20-30 pi de tampon M9 dans un puits sur une lame de dépression.
    3. Utiliser un scalpel stérilisé pour couper les vers de chaque côté de la spermathèque (ou encore près de la vulve) àlibérer les embryons dans la solution.
    4. Utiliser un tuyau en caoutchouc avec un embout buccal relié à un capillaire de verre / pipette tiré d'avoir un petit trou et aspirer les embryons par pipetage à la bouche. En variante, recueillir des embryons avec un tube de verre capillaire qui est attaché à une poire en caoutchouc de pipette Pasteur.
    5. Transférer les embryons aspirées à un second puits contenant également tampon M9, pour les aider à séparer des débris de ver.
    6. Ensuite, aspiration des embryons sur un bloc d'agarose fraîchement préparé (voir étape 4.1).
    7. embryons de s'agglutiner en utilisant un cil (collé à une sélection de dent) d'augmenter le nombre d'embryons qui peuvent être filmées dans un plan x, y. Remarque: Pour éviter la privation d'oxygène, ne pas s'agglutiner plus de 10 embryons ensemble.
    8. Ensuite, recouvrir la lame avec une lamelle couvre-objet et sceller partiellement avec pré valap de liquide chauffé (la vaseline, de la lanoline et de la paraffine; fondu et combiné 01:01:01) pour éviter la déshydratation des embryons au cours de l'imagerie. Remarque: supplémentaires M9 tampon can être ajouté au tampon pour faire en sorte que les embryons ont suffisamment de liquide pour l'imagerie. Au lieu de valap, la gelée de pétrole peut être utilisé pour sceller partiellement lamelles, mais il est moins rigide provoquant les lamelles de glisser et pourrait obtenir sur les objectifs de microscope.

5. Imagerie en direct

  1. Pour visualiser les neuroblastes, obtenir une souche de ver qui exprime une protéine spécifique neuroblastes attaché à une protéine fluorescente (par exemple HAM-1: GFP, souche ID au CCG OP102). Pour détecter les membranes cellulaires, utiliser une souche de ver qui exprime aussi un domaine protéique qui reconnaît lipides attachés à une protéine fluorescente différente (par exemple mCherry:. PH, souche ID au CCG OD70).
  2. embryons de récolte de hermaphrodites fluorescentes conservés sur le contrôle ou ani-1 plaques d'ARNi (voir Protocoles 3 et 4), et de préparer les lames comme décrit ci-dessus (voir le protocole no 4).
  3. embryons de l'image en 4D (x, y, z et time-lapse) par microscopie à épifluorescence. Utilisez un wisystème defield [microscope à fluorescence automatisé avec des filtres pour la GFP et TexasRed, objectifs jusqu'à 60X ou 100X, un CCD haute résolution (dispositif à couplage de charge) appareil photo, très platine motorisée (par exemple. Piezo Z) et le logiciel d'acquisition spécialisé] ou un livescan balayé champ microscope confocal [automatisé fluorescent microscope à balayage à 488 nm et 561 nm lasers, les objectifs à 100X, un EMCCD (électrons CCD multipliant) appareil photo, très platine motorisée (par exemple piézo Z) et le logiciel d'acquisition spécialisée]. Remarque: Pour le système à grand champ, utilisant des LED et une caméra EMCCD limitera phototoxicité. En outre, un microscope confocal à disque rotatif peut être utilisé à la place du système de champ balayé.
  4. Pour la division cellulaire image neuroblastes de chaque système, trouver x, cadres y d'embryons en utilisant les 10X ou 20X objectifs, et choisir une optimales x, y cadre où les embryons sont en cours dorsale intercalation (étape préalable à l'enceinte ventrale; figure 1A) ou sont à un stade précocede l'enceinte ventrale (~ 350 min après la première division cellulaire; figure 1A).
  5. Sur le microscope de champ balayé, utilisez le 488 nm et 561 nm lasers 100 mW à 40% de la puissance d'une fente de 50. Sur le système de grand champ, utiliser les filtres GFP et TexasRed avec une intensité de lumière faible à moyenne (si commandé). Remarque: Pour le système à grand champ, les LED ont une faible phototoxicité et sont préférables.
  6. Sur l'autre système, utiliser les objectifs à immersion d'huile 60X ou 100X et collecter 20 Z-piles de 0,2 um toutes les 2 minutes pour un total de 10 min. Remarque: Bien que la HAM-1: GFP et mCherry: sondes PH expriment à des niveaux relativement élevés, les temps d'exposition pour chaque sonde devront être optimisés pour différents microscopes. Remarque: Pour le système de champ large, moins de Z-piles est recommandé de limiter la phototoxicité et de l'imagerie sur des périodes de temps plus longues, utilisent moins de points dans le temps.
  7. Pour minimiser la phototoxicité causée par l'exposition des embryons à la lumière UV sur le système à grand champ (si vous utilisez un mercenaireampoule ury), fermer l'ouverture à 30% et de diminuer l'intensité lumineuse (en utilisant un système d'éclairage réglable). Remarque: Bien que le gain n'est pas nécessaire en utilisant soit le système, d'autres microscopes peuvent avoir des sources de lumière avec des intensités plus faibles ou des objectifs avec des ouvertures numériques différentes, ce qui pourrait nécessiter l'utilisation d'un gain pour obtenir des images d'intensité de pixel optimale. Testez les conditions en utilisant un embryon de contrôle pour s'assurer que les phénotypes observés ne sont pas dus à un artefact phototoxicité.

6. Analyse des données de microscopie

  1. Pour analyser les images, les fichiers d'exportation que TIFF et ouvrir les fichiers TIFF comme une pile en utilisant un logiciel spécialisé comme un programme de traitement d'image basé sur Java (par exemple ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Remarque: Selon le logiciel d'acquisition utilisé pour recueillir les images, les fichiers peuvent être conservés dans leur forme originale et ouverts dans ImageJ. Ceci est préférable que les métadonnées sont conservées avec les fichiers.
  2. Séparer la pileen «images» et choisir les points de temps et Z-plans comme vous le souhaitez. Remarque: Même si une pile de 20 Z-avions est prise, la plupart des neuroblastes sont <1 um d'épaisseur en moyenne embryogenèse tardive et seulement quelques Z-plans sont nécessaires.
  3. Réempilez les plans de Z sélectionnés pour chaque point de temps et de faire des projections Z-stack distincts. Ensuite, pile des projections pour chaque point de temps ensemble pour faire une séquence de temps.
  4. Faire des ajustements à la luminosité / contraste et ou pour chaque canal.
  5. Ensuite, sélectionnez une région d'intérêt, la culture (et tourner si nécessaire) de la région.
  6. Créez des images fusionnées en utilisant la fonction 'chaînes fusionnées de et choisir une couleur différente pour chaque canal. Autre images fusionnées en RVB.
  7. Inversez les images en niveaux de gris pour chaque canal à partir des étapes 6.3 ou 6.4 (utiliser la fonction 'inverti' sous 'edit') pour visualiser des images plus clairement.
  8. Enregistrer toutes les images finales que TIFF 8 bits pour faire des figures dans le vecteur basé softwsont des programmes ou que des fichiers Quicktime pour faire des films.
  9. Si les mesures de la taille de pixel sont nécessaires (par exemple pour inclure une barre d'échelle avec les images), utiliser ImageJ, ou un autre logiciel de traitement d'image pour mesurer la taille de l'embryon. Remarque: Les images recueillies à l'aide des objectifs différents auront différentes tailles de pixels.

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Résultats

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Ce protocole expérimental décrit la façon de la division cellulaire de l'image en C. elegans embryons en moyenne embryogenèse. En particulier, il décrit comment les neuroblastes de l'image, ce qui peut faciliter la morphogenèse épidermique. Épidermique morphogenèse est due à une combinaison de changements de forme des cellules épidermiques, la migration et l'adhérence, mais aussi s'appuie sur des indices chimiques ou mécaniques des neuroblastes sous-jacents (figure 1B). Les neuroblastes sécrète...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit l'utilisation de divers types de microscopie à des divisions cellulaires de l'image au cours de l'embryogenèse milieu. En particulier, ce protocole met en évidence comment l'image de la division des neuroblastes, des cellules qui peuvent faciliter la morphogenèse épidermique. La communication cellulaire est important pour la formation des tissus au cours du développement de métazoaires et C. elegans est un excellent modèle pour étudier la formation du tissu in vivo. ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à reconnaître que ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en génie du Canada de subvention (CRSNG) en sciences naturelles et.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgarBioShop Canada Inc.#AGR001.1Pour la fabrication des plaques C. elegans NGM et ARNi
AgarBio Basic Inc.#9002-18-0Pour la fabrication de bactéries LB plaques de gélose
Agarose BioShopCanada Inc.#AGA001.500
Anticorps anti-souris Alexa Fluor 488Life Technologies Corporation (Invitrogen)#A11029
Anticorps anti-souris anti-GFPRoche Applied Science#11814460001
Anticorps anti-lapin Alexa Fluor 568Life Technologies Corporation (Invitrogen)#A11011
AmpicillinBioShop Canada Inc.#AMP201.5Conserver la poudre à 4 ° ; C et ampicilline dissoute à -20 ° ; C
Bactopetone  ; (peptone-A)Bio Basic Inc.
CaCl2 (chlorure de calcium)BioShop Canada Inc.#C302.1
CholestérolBioShop Canada Inc.#CHL380.25Dissoudre dans l’éthanol
DAPI  ;Sigma-Aldrich#D9542Utiliser pour colorer les acides nucléiques (ADN)
GlycérolBioShop Canada Inc.#GLY001.1
IPTG (isopropylthio-&beta ;-galactoside)Bio Basic Inc.#367-93-1Conserver la poudre et l’IPTG dissous à -20 ° ; C
KH2PO4 (phosphate de potassium, monobasique)BioShop Canada Inc.#PPM666.1
K2HPO4 (phosphate de potassium dibasique)BioShop Canada Inc.#PPD303.1
L4440  ; (vecteur d’alimentation)Addgene#1654Conserver comme stock de glycérol à -80 ° ; C
MgSO4  ;   ; (sulfate de magnésium)BioShop Canada Inc.#MAG511.500
NaCl (chlorure de sodium)Bio Basic Inc.#7647-14-5
Na2HPO4 (phosphate de sodium, dibasique)Bio Basic Inc.#7558-79-4
Sérum d’âne normal (NDS)Wisent Bioproducts#035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (gallate de propyle)Alfa Aesar#A10877
Poly-L-lysineSigma-Aldrich#P8920Pour des résultats optimaux, appliquez trois fois sur les lames de microscope.
StreptomycineBioShop Canada Inc.#STP101.50Conserver la poudre à 4 ° ; C et streptomycine dissoute à -20 ° ; C
TetracyclinBioShop Canada Inc.#TET701.10Conserver la poudre à 4 ° ; C et tétracycline dissoute à -20 ° ; C
Tween-20Bio Basic Inc.CAS#9005-64-5
TryptoneBioShop Canada Inc.#TRP402.500
Extrait de levureBio Basic Inc.Référence 8013-01-2
#G213

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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