Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

Summary

Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants.

Abstract

Imagerie time-lapse est une technique qui permet l'observation directe du processus de morphogenèse, ou la génération de forme. En raison de leur clarté optique et la susceptibilité à la manipulation génétique, la embryon de poisson zèbre est devenu un organisme modèle populaire avec laquelle effectuer l'analyse time-lapse de la morphogenèse des embryons vivants. L'imagerie confocale d'un embryon de poisson zèbre direct requiert qu'un tissu d'intérêt est constamment marqué avec un marqueur fluorescent, comme un transgène ou d'un colorant injecté. Le processus exige que l'embryon est anesthésié et maintenu en place de manière à ce que le développement sain se déroule normalement. Paramètres pour l'imagerie doivent être définis pour tenir compte de la croissance en trois dimensions et à concilier les exigences de la résolution des cellules individuelles tout en obtenant des clichés de développement. Nos résultats démontrent la possibilité d'effectuer à long terme dans l'imagerie in vivo d'embryons de poisson zèbre de marquées par fluorescence et de détecter des comportements de tissus variés dansla crête neurale crânienne qui causent des anomalies cranio-faciales. Les retards de développement causés par l'anesthésie et le montage sont minimes, et les embryons sont sains et saufs par le processus. Embryons Time-lapse imagées peuvent être retournés pour un milieu liquide et ensuite imagés ou fixés à des points plus tard dans le développement. Avec une abondance croissante des lignes de poisson zèbre transgénique et cartographie sort bien caractérisé et techniques de transplantation, imagerie n'importe quel tissu désiré est possible. En tant que tel, time-lapse imagerie in vivo combine puissamment avec des méthodes génétiques de poisson zèbre, y compris les analyses des embryons mutants et micro-injection.

Introduction

Morphogenèse craniofaciale est un processus multi-étapes complexe qui nécessite des interactions coordonnées entre plusieurs types de cellules. La majorité du squelette cranio-facial est dérivé de cellules de la crête neurale, dont beaucoup doivent migrer du tube neural dorsal dans des structures appelées transitoires arcs branchiaux ^1. Comme avec de nombreux tissus, la morphogenèse du squelette cranio-facial est plus complexe que ce qui peut être compris par des images statiques d'embryons à des points spécifiques de temps de développement. Bien que cela prend beaucoup de temps pour réaliser, in vivo microscopie time-lapse donnent un aspect c....

Protocol

Une. Elevage et Mutant allèles

1. Élever du poisson zèbre comme décrit ^21.
2. Allèles mutants de poisson zèbre utilisés dans cette étude étaient PDGFRA ^{b1059 16, B1100} Smad5 ^22, et SMO ^{b577 23.} Sources de ces souches de poisson zèbre comprennent ZIRC.

2. Préparation des solutions et met en œuvre

Remarque: Toutes les solutions et les outils peuvent être faites à l'avance et stockés pour une utilisation future.

1. Sensibiliser les médias de l'embryon (EM) comme décrit précédemment ^21.
2. Faire 4 g / L MS-222 (Trica....

Results

Chez les embryons de type sauvage, à la suite de neurones population de crête, les arcs pharyngiens allongés le long des antérieure / postérieure et dorsale / ventrale axes tout en se déplaçant dans une direction rostrale (Film 1). 30 heures après la fécondation (HPF), la longueur antérieure / postérieure du premier arc pharyngien est comprise entre 1.8 à 1.9 fois sa dorsale / ventrale hauteur. Dorsale / ventrale allongement procède régulièrement, plus rapide que l'extension antérieure / postérieure jus.......

Discussion

Time-lapse microscopie confocale est un outil puissant pour l'analyse du développement. Ici, nous démontrons l'utilité de la méthode dans l'étude de la morphogenèse arc branchial chez le poisson zèbre qui sont mutantes pour voies de signalisation importantes en utilisant un transgéniques qui marque les cellules de la crête neurale. En plus du niveau des tissus analyses, des analyses de déchéance de temps sont également applicables à des analyses à l'échelle cellulaire ^28. De nombreuses méthode.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Ligne monofilament d’essai	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Laser à argon	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	C8106
Tube capillaire, 100 mm, 0,9 mm ID	FHC	30-31-0
Huile de clou de girofle	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
Graisse sous vide poussé	Dow Corning	2021846-0807
Incubateur à bain sec Isotemp	Fisher Scientific	2050FS
Microscope à balayage laser	Carl Zeiss AG	LSM 710
Sulfate de magnésium hexahydraté	Sigma-Aldrich	230391
Verre de protection de microscope, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Verre de protection de microscope, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Chlorure de potassium	Fisher Scientific	M-11321
Phosphate de potassium dibasique	Sigma-Aldrich	P3786
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	M-11624
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.