Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS

Résumé

Ce manuscrit présente une technique d'appliquer ou libérer des forces sur les cellules ou les tissus adhérents utilisant étirement unidirectionnel.

Résumé

Les forces mécaniques qui s'exercent sur les cellules et / ou tissus jouent un rôle important dans de nombreux processus. Nous avons mis au point un dispositif pour étirer les cellules étalées sur un polydiméthylsiloxane (PDMS) membrane, compatible avec l'imagerie. Cette technique est reproductible et versatile. La membrane PDMS peut être microélectrodes pour confiner des cellules ou des tissus à une géométrie spécifique. La première étape consiste à imprimer micropatterns sur la membrane PDMS avec une technique de rayonnement UV lointain. La membrane PDMS est ensuite montée sur un châssis mécanique. Une chambre est tenue au-dessus de la membrane avec de la graisse biocompatible pour permettre glisse pendant l'étirement. Les cellules sont ensemencées et autorisés à se répandre pendant plusieurs heures sur les micropatterns. L'échantillon peut être étirée et non étirée à plusieurs reprises à l'aide d'une vis micrométrique. Il faut moins d'une minute pour appliquer le tronçon à sa pleine mesure (environ 30%). La technique présentée ici ne comprend pas un dispositif motorisé, qui est nécessaire pour unpplying cycles répétés d'étirement rapidement et / ou traction contrôlée ordinateur, mais cela peut être mis en œuvre. Stretching de cellules ou de tissus peut être d'intérêt pour les questions liées aux forces de cellules, la réponse cellulaire au stress mécanique ou la morphogenèse des tissus. Cette présentation vidéo vous montrera comment éviter les problèmes typiques qui peuvent survenir lorsque vous faites ce type d'expérience apparemment simple.

Introduction

Les cellules composant un tissu chez les organismes supérieurs sont soumis à des tensions mécaniques et les forces d'étirage provenant soit du milieu extérieur ou à partir de cellules environnantes ^1,2. Les cellules doivent s'adapter et à résister à ces forces afin de maintenir l'intégrité des tissus. Ces forces sont également importantes pour la morphogenèse des tissus au cours du développement ^{de 3,4.} L'application de forces mécaniques sur des cellules en culture est une façon d'imiter ce qui pourrait arriver dans un tissu, mais avec un contrôle quantitatif et indépendante de la forme des cellules et la déformation de la cellule ^5,6. Pour cela, plusieurs techniques peuvent être utilisées. On peut appuyer sur les cellules (la cellule entière ou une partie de celui-ci), par exemple en utilisant l'AFM ou dérivés ^7,8 ou étirer le substrat, les cellules sont de plus en plus sur.

La méthode décrite dans cet article montre comment étirer un substrat plan avec des cellules plaquées. Cette technique a d'abord été mis au point pour évaluer le rôle des forces exercées sur mles cellules de mammifères itotic ^9. Les cellules mitotiques rester connecté au substrat par des fibres de rétraction et d'étirement de la membrane une force exercée sur ces fibres, ce qui a provoqué la rotation du fuseau mitotique. L'intérêt de combiner micropatterns adhésives et d'étirement est de parvenir à un contrôle indépendant des forces et de la forme des cellules individuelles. Il est par exemple possible d'étirer une cellule ovoïde dans une forme ronde parfaitement isotrope, tandis que l'allongement uniaxial est appliquée. Si les cellules ne sont pas tressé sur micropatterns, étirage uniaxial résultats de l'allongement cellulaire, avec la plupart des cellules ayant un axe longitudinal aligné avec l'axe d'étirage. Il est alors difficile de séparer l'effet de l'alignement de l'axe long et l'effet de l'étirage appliqué aux cellules.

L'appareil est conçu pour toute l'imagerie des cellules vivantes, y compris longtemps microscopie laps de fluorescent, et les médicaments peut être ajouté lors de l'expérience. La méthode profonde UV micromodelage ¹⁰qui a été décrit en détail dans Azioune et al. Patterning ¹¹ sur PDMS a été décrit dans Azioune et al. étirage ¹² La présente protocole est une version vidéo de Carpi et al. ¹³

Protocole

Une. Passivation de l'PDMS

1. Coupez un morceau de PDMS environ 35 mm x 20 mm à partir d'une feuille pré fait (par exemple, GelPak, comme répertoriés dans le tableau des matériaux).
2. Retirer le dessus et les couches de protection du bas du plastique (si nécessaire) et utiliser des pinces pour placer les PDMS dans un plastique (pas de culture cellulaire traité) boîte de Pétri.
3. Laver les PDMS à l'éthanol 70% pendant 5 min sur un rotateur à 30 oscillations / min.
4. Sécher la surface par un courant d'air sur elle.
5. Illuminez UV profond (λ = 180 nm) pendant 5 min à une distance des ampoules UV d'environ 5 cm (voir fiche Matériaux pour la référence de la lampe, les paramètres varient pour différentes lampes).
6. Préparer 200 pi de solution EDC / NHS pour chaque PDMS pièce (ce doit être préparé juste avant utilisation, car la réactivité de la solution se décompose en quelques heures). Pour 1 ml de 0,05 M MES + tampons NaCl 0,5 M à pH 6,0, ajouter 11,5 mg de sulfo-NHS et 19,2 mg d'EDC.
7. Transférer lePDMS feuilles à partir de la boîte de Petri vers le couvercle de la boîte de Pétri, qui n'a pas été allumé. Cela permet de s'assurer que l'environnement des PDMS sont très hydrophobes et de faciliter l'étape suivante.
8. Ajouter la solution EDC / NHS et incuber pendant 15 min à température ambiante.
9. Rincer EDC / NHS avec de l'eau.
10. Ajouter la solution de PLL-g-PEG (0,5 mg / ml dans de l'HEPES 10 mM pH 8,6) et incubation de 3 heures à une nuit à température ambiante.
11. Rincer le PLL-g-PEG avec de l'eau. PDMS passives (fonctionnalisés par PLL-g-PEG) peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 ° C.

2. Structuration de la PDMS

1. Prenez une feuille de PDMS et le placer sur un photomasque de quartz synthétique portant les microcaractéristiques pour motif (voir la figure 1). Placez le côté PDMS portant le PLL-g-PEG face au côté chrome du photomasque.
2. Illuminer pendant 7 min à travers le photomasque à une certaine distance des ampoules UV d'environ 5 cm.
3. Ajouter de l'eau sur le masque + PDMS et éplucher les PDMS lentement le masque.
4. Incuber avec une solution de fibronectine à 50 mg / ml dans du tampon HEPES à pH 8,6 pendant 1 h à température ambiante. Il est possible d'utiliser d'autres protéines de la MEC, mais ceux-ci n'ont pas été testés avec ce protocole.
5. Rincer avec du PBS.

3. Montage du périphérique

1. Montez les PDMS auparavant passives sur le dispositif d'étirement (voir Discussion pour le dépannage).
   1. Fixer un côté des PDMS à la partie fixe de la civière.
   2. Fixer l'autre côté à la partie mobile de la civière sans trop serrer la feuille de PDMS.
2. Découpez un rectangle de PDMS (22 mm x 19 mm) dans un coup de PDMS d'épaisseur et couper un autre rectangle à l'intérieur afin d'avoir une piscine (ou cadre) qui va retenir les cellules et les médias (voir la figure 2).
3. Ajouter de la graisse de silicone sous ce PDMS piscine et placer sur le dessus de la feuille de PDMS pour créer un medium conservant piscine. La graisse permettra le glissement de la piscine sur la feuille PDMS pendant l'étirement.

4. Modeler les cellules

1. Détacher les cellules à partir d'un flacon de culture de confluence de 50% avec Versene.
2. Compter les cellules et remettre en suspension à une concentration de 200 000 cellules / ml.
3. Ajouter 1 ml de suspension de cellules dans la piscine (voir la discussion pour plus de détails).
4. Laisser les cellules se lient aux modes de 10 à 30 min (selon le type cellulaire, les cellules RPE-1 auront 10 minutes et les cellules HeLa 20 min).
5. Rincez délicatement les cellules flottantes avec un milieu équilibré (s'équilibrer moyen dans l'incubateur).
6. Laissez les cellules réparties pour quelques heures sur les modèles (RPE-1 aura besoin d'au moins 2 heures, les cellules HeLa devront 3 h).
7. Ajouter une lamelle sur le dessus de la piscine pour éviter les fuites d'évaporation et moyennes dans le cas où les PDMS pauses.
8. Mettre l'appareil sur un microscope inversé et commencer imagerie. Éviter l'utilisation de l'huile à immersion obtifs comme il ne fonctionnera pas en raison de problèmes de focalisation.

5. Étirage

1. Tourner la vis micrométrique tout en corrigeant la position de phase dans les directions x, y et l'axe z (x principalement). La position de phase doit être corrigé pour compenser l'élargissement des PDMS et la perte de concentration. (Voir «Pendant l'étirement" paragraphe de la discussion).

Résultats

La technique présentée dans ce protocole vidéo a permis l'application de forces sur les fibres de rétraction de la mitose des cellules de mammifères. En effet, au cours de la division cellulaire, dans la phase mitotique des cellules de mammifères se rétractent pour prendre la forme d'une sphère et laisser derrière les câbles d'actine minces entourées de membrane qui sont fixés au substrat. Ces câbles (fibres de rétraction), sont la mémoire de la géométrie de la cellule avant d'entrer dans la divisi...

Discussion

Bien que cette technique a été utilisée à de nombreuses reprises et est testé en profondeur, il ya plusieurs étapes critiques qui peuvent conduire à une expérience ratée.

A propos des PDMS:

Pour ce travail, GelPak, une feuille de PDMS mince disponible dans le commerce, a été utilisé. Sinon feuilles PDMS peuvent être lancés directement à partir de PDMS mélange. Nous vous recommandons d'utiliser GelPak parce qu'il est plus reproductible, et est moins susceptib...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Différentes épaisseurs/adhérences sont disponibles. Une alternative pourrait être de caster votre PDMS  ; toi-même.
Graisse silicone	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste Celle-ci	est biocompatible
Dispositif d’étirement	GREM mé ;	Canique Brancard 2011	;
EDC (chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N&prime ;-éthylcarbodiimide)	Sigma	3450	Stable 6 mois à -20 ° ; C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protéger de l’humidité
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)		;
Photomasque en quartz synthétique	Toppan		Prenez un photomasque binaire standard en
fibronectine de quartz à partir du plasma bovin	Sigma	F1141	.