Surveillance de la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes par cocultivation de souches marquées par fluorescence

Résumé

Les bactéries peuvent accumuler des mutations néfastes ou bénéfiques au cours de leur vie. Dans une population de cellules, les individus qui ont accumulé des mutations bénéfiques peuvent rapidement surpasser leurs semblables. Ici, nous présentons une procédure simple pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes au fil du temps en utilisant des individus marqués par fluorescence.

Résumé

De nombreux micro-organismes tels que les bactéries prolifèrent extrêmement rapidement et les populations peuvent atteindre des densités cellulaires élevées. De petites fractions de cellules dans une population ont toujours accumulé des mutations qui sont préjudiciables ou bénéfiques pour la cellule. Si l’effet de valeur adaptative d’une mutation procure à la sous-population un fort avantage de croissance sélective, les individus de cette sous-population peuvent rapidement supprèter et même éliminer complètement leurs compagnons immédiats. Ainsi, de petits changements génétiques et l’accumulation pilotée par la sélection de cellules qui ont acquis des mutations bénéfiques peuvent conduire à un déplacement complet du génotype d’une population cellulaire. Nous présentons ici une procédure pour surveiller l’expansion clonale rapide et l’élimination des mutations bénéfiques et néfastes, respectivement, dans une population de cellules bactériennes au fil du temps par cocultivation d’individus marqués par fluorescence de la bactérie modèle Gram-positive Bacillus subtilis. La méthode est facile à réaliser et très illustrative pour montrer la compétition intraspéciféenne entre les individus dans une population cellulaire bactérienne.

Introduction

Les bactéries du sol sont généralement dotées de réseaux de régulation flexibles et de vastes capacités métaboliques. Les deux caractéristiques permettent aux cellules d’ajuster leurs voies cataboliques et anaboliques pour rivaliser avec leurs semblables et d’autres micro-organismes pour les nutriments, qui sont disponibles dans une niche écologique donnée¹. Cependant, si les bactéries sont incapables de s’adapter à leur environnement, d’autres mécanismes peuvent expliquer la survie d’une espèce. En effet, comme de nombreuses bactéries prolifèrent rapidement et que les populations peuvent atteindre des densités cellulaires élevées, les sous-populations peuvent avoir spontanément accumulé des mutations bénéfiques qui procurent aux cellules un avantage de croissance sélective et augmentent donc leur aptitude. De plus, les points chauds mutationnels et la mutagenèse adaptative induite par le stress peuvent faciliter l’évolution d’une bactérie mal adaptée^2,3. Ainsi, l’accumulation de mutations et la croissance sous sélection continue est à l’origine de l’énorme diversité microbienne, même au sein d’un même genre^4,5. Comme dans la nature, la mise en forme des génomes bactériens se produit également en laboratoire en raison de la culture continue sous sélection. Ceci est illustré par la domestication de la bactérie Gram-positive B. subtilis, qui est utilisée dans le monde entier dans la recherche fondamentale et dans l’industrie. Dans les années 1940, B. subtilis a été traité avec des rayons X dommageables pour l’ADN, suivi d’une culture dans une condition de croissance spécifique^6. Les mutations qui se sont accumulées dans les bactéries lors de leur domestication expliquent la perte de nombreuses caractéristiques de croissance, c’est-à-dire que la souche de laboratoire B. subtilis 168 a perdu la capacité de former des colonies complexes^7,8.

De nos jours, pour les bactéries modèles les mieux étudiées Escherichia coli et B. subtilis,une variété d’outils puissants est disponible pour manipuler génétiquement leurs génomes afin de répondre à des questions scientifiques spécifiques. Parfois, l’inactivation d’un gène d’intérêt provoque un grave défaut de croissance, qui est alors clairement visible sur le milieu de croissance standard⁹. En revanche, les mutations qui provoquent un défaut de croissance faible et n’affectent donc que légèrement la forme physique de la souche sont souvent ignorées. Cependant, dans les deux cas, l’incubation et le passaging prolongés des souches mutantes pendant plusieurs générations entraînent généralement l’accumulation de mutants suppresseurs qui ont restauré le phénotype de la souche parente^2,9. La caractérisation des mutants suppresseurs et l’identification des mutations qui ont restauré le défaut de croissance de la souche mutante mère est une approche très utile qui permet d’élucider des processus cellulaires importants et souvent nouveaux^10,11.

Nous nous intéressons au contrôle de l’homéostasie du glutamate chez B. subtilis¹². Semblable à E. coli, B. subtilis répond à la perturbation de l’homéostasie du glutamate(c’est-à-direle blocage dans la dégradation du glutamate²⁾par l’accumulation de mutants suppresseurs. Les changements genomic de ces mutants suppresseurs qui ont été acquis par mutation spontanée ont été montrés pour reconstituer rapidement l’homéostasie de glutamate^9,13. Par conséquent, il n’est pas surprenant que l’adaptation de B. subtilis à une condition de croissance spécifique lors de la domestication de la bactérie se reflète dans la synthèse enzymatique et dans les activités enzymatiques évoluées, qui sont impliquées dans le métabolisme du glutamate^12. Il a été suggéré que le manque de glutamate exogène dans le milieu de croissance pendant le processus de domestication ait été la force motrice de l’émergence et de la fixation du gène cryptique de la glutamate déshydrogénase (GDH) gudB^CR dans la souche de laboratoire 168^2,14. Cette hypothèse est soutenue par notre observation que la quantité réduite d’activité de GDH dans la souche de laboratoire fournit aux bactéries un avantage de croissance sélective quand le glutamate exogène est rare^2. De plus, la culture d’une souche de B. subtilis, synthétisant le GDH GudB, en l’absence de glutamate exogène entraîne l’accumulation de mutants suppresseurs qui ont inactivé le gène gudB ^2. De toute évidence, la présence d’un GDH cataboliquement actif est désavantageuse pour la cellule car le glutamate produit de manière endogène qui pourrait autrement être utilisé pour l’anabolisme est dégradé en ammonium et en 2-oxoglutarate (Figure 1). En revanche, lorsque le glutamate est fourni par le milieu, une souche de B. subtilis équipée d’une activité GDH de haut niveau a un avantage de croissance sélective par rapport à une souche qui ne synthétise qu’un seul GDH fonctionnel. Il est raisonnable de supposer que l’activité GDH de haut niveau permet aux bactéries d’utiliser le glutamate comme deuxième source de carbone en plus des autres sources de carbone fournies par le milieu² (voir figure 1). Ainsi, l’activité GDH affecte fortement la forme physique des bactéries, en fonction de la disponibilité du glutamate exogène.

Nous présentons ici une méthode très illustrative pour surveiller et visualiser la concurrence intraspécifiques entre deux souches de B. subtilis qui diffèrent par un seul locus sur le chromosome (Figure 2). Les deux souches ont été étiquetées avec les gènes yfp et cfp codant pour les fluorophores YFP et CFP, et cocultivées dans différentes conditions nutritionnelles. En prélevant des échantillons au fil du temps et en plaquant des dilutions appropriées sur des plaques de gélose, les survivants de chacune des cultures ont pu être facilement surveillés à l’aide d’un microscope à fluorescence stéréo commun. Le procédé décrit en ce document est facile à exécuter et approprié pour visualiser l’expansion et l’élimination clonales rapides des mutations salutaires et préjudiciables, respectivement, dans une population de cellules au fil du temps.

Protocole

1. Préparation des plaques de gélose, des milieux de culture, des cryostocks et des précultures

1. Préparer les milieux de croissance et les réactifs requis (voir le tableau des matériaux et des réactifs).
2. Stries les souches de B. subtilis ( par exemple. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) et BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) exprimant respectivement un et deux GDH actifs)² qui seront utilisés dans l’expérience de compétition sur des plaques de gélose moyenne SP pour obtenir des colonies uniques. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.
3. Prendre des colonies simples et inoculer des tubes de culture stériles contenant 4 ml de milieu liquide LB. Cultiver les bactéries pendant la nuit à 28 °C et 220 tr/min.
4. Cultiver des cultures pendant la nuit à 28 °C pour éviter que les cellules ne se lysent ou ne se sporculent.
5. Mesurer la densité optique des cultures à une longueur d’onde de 600 nm (DO₆₀₀₎à l’aide d’un spectrophotomètre étalon.
6. Si les cultures ont atteint une DO₆₀₀ de 2,0, mélanger 0,75 ml des cultures avec 0,75 ml d’une solution stérile de glycérol à 50 % dans des tubes réactionnaires de 1,5 ml. La DO_{finale 600} doit être de 1,0 pour obtenir des cryostocks contenant environ 10⁸ cellules/ml.
7. Conserver les tubes à -80 °C.
8. Faire trois précultures de chaque souche étiquetée avec les gènes cfp et yfp codant pour les gènes fluorophores. Inoculer les précultures (tubes de culture stériles contenant 4 ml de milieu liquide LB) avec des cellules de 1 μl provenant de cryostocks de -80 °C. Incuber les cultures pendant la nuit à 28 °C et 220 rpm.

2. Cocultivation des bactéries, prélèvement d’échantillons et entreposage des échantillons

1. Préparer fraîchement 100 ml de C-Glc et de milieu minimal CE-Glc (voir tableau des réactifs et des matériaux) et transférer 20 ml de chaque milieu dans des flacons stériles de secouer de 100 ml.
2. Prenez 0,1 ml des précultures qui ont été cultivées pendant la nuit, diluez-les avec 0,9 ml de milieu LB dans une cuvette de 1,5 ml, et déterminez la DO₆₀₀.
3. Pour l’expérience de compétition, prenez les précultures des différentes souches qui ont une DO₆₀₀ similaire entre 1,0 et 1,5.
4. Pour obtenir des populations cellulaires mixtes, diluer les cellules des précultures qui avaient la DO₆₀₀ appropriée à une DO₆₀₀ de 0,05 dans 20 ml de milieu minimal C-Glc et CE-Glc complété dans des flacons de secouage de 100 ml. Pour l’expérience de compétition, les deux souches doivent être mélangées dans un rapport de 1:1.
5. Prélever 10 ml d’échantillons dans les flacons, les transférer dans des tubes en plastique de 15 ml, récolter les cellules par centrifugation pendant 10 min à 4 000 x g dans une centrifugeuse de table standard et jeter le surnageant.
6. Ressusciter les cellules dans 0,5 ml de milieu LB frais et transférer les cellules dans une tasse de réaction stérile de 1,5 ml. Ajouter 0,5 ml de glycérol stérile à 50 %, mélanger la suspension par vortexage rigoureux et conserver les échantillons dans un congélateur à -80 °C jusqu’à un traitement ultérieur.
7. Incuber les cellules laissées dans les ballons de secouage jusqu’à 24 heures à 37 °C et 220 tr/min. Gardez les flacons de secouer dans l’obscurité pour éviter le photo blanchiment des fluorophores.
8. Prendre d’autres échantillons de 0,1 ml après 7 heures et 24 heures de croissance. Mesurer et noter la DO₆₀₀ des dilutions 1:10 (en milieu minimal C-Glc ou CE-Glc) des échantillons.
9. Prenez la quantité appropriée de cellules de chaque culture pour faire des cryostocks qui ont une DO₆₀₀ de 1.0. Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à un traitement ultérieur.

3. Traitement des échantillons, placage et incubation pour les analyses quantitatives

1. Après avoir prélevé tous les échantillons, décongelez les cryostocks et diluez les cellules dans une solution saline à 0,9% (voir tableau des réactifs et des matériaux) jusqu’à^10-3.
2. Plaquer 0,1 ml des^10-3 dilutions sur des plaques de gélose moyenne SP et répartir les cellules à l’aide de pipettes en verre stérile.
3. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C dans l’obscurité jusqu’à ce que des colonies simples apparaissent.

4. Comptage des survivants par microscopie à fluorescence stéréo pour l’analyse quantitative

1. Divisez le fond de la plaque de gélose avec un stylo noir en quatre parties pour une meilleure orientation tout en comptant les survivants sous le microscope à fluorescence stéréoscopique.
2. Placez la plaque à l’envers sous le microscope et ez les colonies au point à l’aide de la source de lumière froide.
3. Une fois que les colonies sont au point, passez au filtre approprié pour cfp pour visualiser les cellules survivantes de la souche marqué cfp. Comptez les survivants de cette souche en étiquetant les colonies avec un stylo et notez le nombre.
4. Retirez les étiquettes avec de l’éthanol et passez au filtre YFP défini pour visualiser les cellules survivantes de la souche étiquetée yfp. Comptez à nouveau les survivants en étiquetant les colonies avec un stylo et notez le nombre.

5. Traitement des échantillons et microscopie pour les analyses semi-quantitatives

1. Pour des illustrations, spot 10 μl de la dilution^10-4 (environ 100 cellules) de l’étape 3.1 sur une plaque de gélose SP (voir figure 3).
2. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C dans l’obscurité jusqu’à ce que des colonies simples apparaissent.
3. Placez la boîte de Pétri sans couvercle sous le microscope et ressettez la tache à l’aide de la source de lumière froide.
4. Prenez des photos des spots pour des figures illustratives. Choisissez un temps d’exposition approprié pour prendre les photos des colonies avec la source de lumière froide.
5. Sans déplacer la plaque, passez à l’ensemble de filtres CFP, ajustez le temps d’exposition et prenez une photo. Faites de même avec le filtre YFP défini et enregistrez les images pour des analyses plus approfondies.

6. Analyse des données

1. Utilisez un logiciel tel qu’Excel pour les analyses de données quantitatives. En fonction des colonies comptées, calculer le pourcentage de colonies jaunes et bleues par rapport au nombre total de colonies, qui sont fixées à 100 %.
2. Utilisez les nombres calculés pour créer un diagramme à barres empilées (voir Figure 4 et Figure 5). Utilisez un programme de traitement d’image tel qu’Adobe Photoshop pour construire des images fusionnées des images prises à partir des différents endroits. Alternativement, le logiciel disponible gratuitement ImageJ, téléchargeable à partir de http://rsbweb.nih.gov/ij/ peut être utilisé pour le traitement d’image.
3. Ouvrez les photos à partir d’un emplacement qui ont été prises avec le jeu de filtres CFP et le jeu de filtres YFP. Optimisez le contraste et la luminosité pour réduire toute fluorescence d’arrière-plan à partir du support.
4. Accédez à l’une des images et sélectionnez tout. Copiez l’image et collez-la sur l’autre image.
5. Utilisez la fonction « dodge couleur » pour fusionner les images ou superposez les images fluorescentes à l’aide de l’onglet canaux. Des images fusionnées des colonies de différents milieux et de différents points temporels représentent la croissance des différentes souches au sein de la culture liquide.

7. Conseils spécifiques: Expérience de commutation de colorant et cocultivation de souches isogéniques étiquetées avec cfp et yfp

L’expression de l’un ou l’autre des deux gènes codant pour les fluorophores chez B. subtilis pourrait influencer la condition physique et donc le taux de croissance des bactéries. Par conséquent, il est recommandé d’effectuer les expériences suivantes afin d’exclure que l’élimination d’une souche concurrente de la population cellulaire pendant la culture soit simplement due à un effet négatif du fluorophore:

1. Répétez l’expérience entière et cocultivate inversement marqué souches(par exemple, la souche antérieure marqué cfpest maintenant étiquetée avec le gène yfp et vice versa). Bien qu’inverses, les résultats obtenus doivent être comparables à l’observation précédente selon laquelle une souche a un avantage de croissance sélective par rapport à l’autre souche.
2. Répétez l’ensemble de l’expérience et cocultivate souches isogéniques étiquetées avec yfp et cfp (par exemple BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE: :P_gudB-yfp) et BP41 (rocG⁺ gudB^CR amyE: :P_gudB-cfp)). Estimer l’effet négatif de l’un ou l’autre des deux fluorophores sur la valeur adaptative de la bactérie en suivant la composition de la population cellulaire au fil du temps.

Résultats

La méthode décrite ici a été appliquée avec succès pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population cellulaire constituée de souches de B. subtilis qui ont été marqués avec les gènes cfp et yfp codant pour les fluorophores CFP et YFP, respectivement. Comme le montre la figure 3,la méthode peut être utilisée pour visualiser la concurrence intraspécifeur d’une manière très illustrative. En repérant les échantillons sur de petites zones, la composition clonale de...

Discussion

Plusieurs méthodes ont été développées pour analyser l’aptitude compétitive des bactéries¹⁶. Dans de nombreux cas, les bactéries ont été étiquetées avec différentes cassettes de résistance aux antibiotiques¹⁷. Semblable à notre approche, l’étiquetage des cellules avec des cassettes de résistance aux antibiotiques permet l’évaluation de l’aptitude compétitive des bactéries lors de la cocultivation dans des conditions de croissance définies. De plus, cette méthode peut être utilisée pour déterminer l’...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(NH4)2SO4  ;	Roth, Allemagne	3746
Agar	Difco, États-Unis	214010
Citrate ferrique d’ammonium (CAF)	Sigma-Aldrich, Allemagne	9714
CaCl2  ;	Roth, Allemagne	5239
Glucose	Applichem, Allemagne	A3617
Glycérol	Roth, Allemagne	4043
K2HPO4&bull ; 3H2O	Roth, Allemagne	6878
KCl	Applichem, Allemagne	A3582
KH2PO4	Roth, Allemagne	3904
KOH	Roth, Allemagne	6751
MgSO4&bull ; 7H2O  ;	Roth, Allemagne	P027
MnCl2  ;	Roth, Allemagne	T881
MnSO4&bull ; 4H2O	Merck Millipore, Allemagne	102786
NaCl	Roth, Allemagne	9265
Bouillon nutritif	Roth, Allemagne	X929
Glutamate de potassium	Applichem, Allemagne	A3712
Tryptone	Roth, Allemagne	8952
Tryptophane	Applichem, Allemagne	A3445
Extrait de levure	Roth, Allemagne	2363
1,5 ml Tubes	de réaction Sarstedt, Allemagne	72 690 001
2,0 ml Tubes de réaction	Sarstedt, Allemagne	72 691
15 ml Tubes en plastique avec bouchon à vis	Sarstedt, Allemagne	62 554 001
Boîtes de Pétri	Sarstedt, Allemagne	82.1473
1,5 ml Cuvettes en polystyrène	Sarstedt, Allemagne	67 742
15 ml Tubes de culture en verre  ;	Marque, Allemagne	7790 22
100 ml Flacons agitateurs avec bouchons en aluminium	Marque, Allemagne	928 24
Pipettes stériles en verre de 10 ml	Marque, Allemagne	278 23
Incubateur (28 et 37 ° ; C)	Nouveau-Brunswick	M1282-0012
Ensemble de pipettes standard (2-20 &mu ; l, 10-100 &mu ; l, 100-1 000 &mu ; l)	Eppendorf, Allemagne	4910 000.034, 4910 000.042,
Centrifugeuse de table pour tubes à réaction de 1,5 et 2 ml	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Allemagne	75002425
Centrifugeuse de table pour tubes en plastique de 15 ml	Heraeus Biofuge Primo R, Allemagne	75005440
Spectrophotomètre standard	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Allemagne	80-2112-21
Microscope à stéréofluorescence	Zeiss SteREO Lumar V12, Allemagne	495008-0009-000
Congélateur (-20 et -80 ° ; C)	-
; C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4,	Allemagne-pH-mètre
pH-mètre 766, Calimatic, Knick, Allemagne	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Allemagne	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Allemagne	remplacé par
Stylo noir (marqueur permanent)	Staedler, Allemagne	317-9
Programme Powerpoint		Microsoft, USA-Office
Programme Excel	Microsoft, USA-Programme		pour le traitement des données
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	remplacé par CS6, télécharger Programme	informatique pour le traitement d’images
Logiciel PC ou	Mac-ZEN
pro 2011 pour le microscope	à stéréofluorescenceZeiss, Allemagne	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtenu par Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Bouillon
0,25 mg MgSO4&bull ; 7H2O
1 g de KCl
15 g de gélose pour milieu SP solide	si nécessaire
H2O			pendant 20 min à 121 ° ; C
1 ml de CaCl2 (0,5 M), stérilisé par filtration
1 ml de MnCl2 (10 mM), stérilisé par filtration
2 ml de citrate ferrique d’ammonium (CAF, 2,2 mg/ml), stérilisé par filtration
LB Moyen
10 g Tryptone
5 g d’extrait
10 g de NaCl
15 g de gélose pour milieu			si nécessaire
ajouter 1 L avec un autoclave H2O			pendant 20 min à 121 ° ; C
C-Glc Minimal Moyen
200 ml 5 x sels C
10 ml L-Tryptophane (5 mg/ml), stérilisé par filtration
10 ml de citrate ferrique d’ammonium (CAF, 2,2 mg/ml), stérilisé par filtration
10 ml sels
25 ml Glucose (20 %)			autoclavé pendant 20 min à 121 ° ; C
add 1 L avec H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x sels C 10
ml de L-Tryptophane (5 mg/ml), stérilisé par filtration
10 ml de citrate ferrique d’ammonium (CAF, 2,2 mg/ml), stérilisé par filtration
10 ml III’ sels
20 ml Glutamate (40 %)
25 ml Glucose (20 %), autoclavé pendant 20 min à 121 ° ; C
ajouter 1 L avec des sels stériles de H2O
5 x C
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4&bull ; 3H2O
16,5 g (NH4)2SO4
add 1 L avec autoclave stérile H2O			pendant 20 min à 121 ° ; sels
			C III'
0,232 g MnSO4&bull ; 4H2O
12,3 g MgSO4&bull ; 7H2O
ajouter 1 L avec H2O stérile, autoclave pendant 20 min à 121 ° ; C
40 % de solution de glutamate
200 g d’acide
ajuster le pH à 7,0 en ajoutant environ 80 g de KOH
ajouter 0,5 L avec un autoclave H2O			stérile pendant 20 min à 121 ° ; C
<>solution saline (NaCl)
ajouter 1 L avec un autoclave stérile H2O			pendant 20 min à 121 ° ; C
50 % Solution de glycérol
295 ml Glycérol (87 %)
ajouter 0,5 L avec un autoclave stérile H2O			pendant 20 min à 121 ° ; C
Bactéries (Toutes les souches sont basées sur la souche Bacillus subtilis 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE ::P gudB-yfp)  ;	Collection de souches
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE ::P gudB-cfp)  ;
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE ::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE ::P gudB-yfp)