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Article de méthode

Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct

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DOI :

10.3791/51201

⸱

10 mars 2014

 ,  , 
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

Dans cet article

Résumé

Les cellules phagocytaires jouent un rôle majeur dans le système immunitaire inné en enlevant et en éliminant les micro-organismes envahisseurs dans leurs phagosomes. Phagosome maturation est le processus complexe et étroitement réglementé au cours de laquelle un phagosome naissant subit une transformation radicale par des interactions bien orchestrées avec divers organites cellulaires et des compartiments dans le cytoplasme. Ce processus, qui est essentiel pour la fonction physiologique des cellules phagocytaires en dotant phagosomes avec leurs propriétés lytiques et bactéricides, culmine dans la fusion des phagosomes avec les lysosomes et la biogenèse des phagolysosomes qui est considéré comme la dernière étape critique de la maturation pour phagosomes. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode basée imagerie des cellules vivantes pour l'analyse qualitative et quantitative de la dynamique de lysosome pour phagosome livraison de contenu, ce qui est une caractéristique de phagolysosome biogenèse. Cette approche utilise des microbilles recouvertes d'IgG comme un modèle pour phagocytose et molécules de dextran fluorophore conjugué comme sonde de fret lysosomale luminale, afin de suivre la livraison de contenu dynamique de lysosmal aux phagosomes en temps réel dans les macrophages vivants en utilisant l'imagerie time-lapse et la microscopie confocale à balayage laser. Ici, nous décrivons en détail l'arrière-plan, les étapes de préparation et de la mise en place, étape par étape expérimentale pour permettre un déploiement facile et précis de ce procédé à d'autres laboratoires. Notre méthode décrite est simple, robuste, et surtout, peuvent être facilement adaptés à l'étude des interactions phagosome et la maturation dans les différents systèmes et sous divers paramètres expérimentaux tels que l'utilisation de différents types de cellules phagocytaires, des expériences de perte de fonction, différentes sondes, et particules phagocytaires.

Introduction

Phagocytes professionnels, y compris les macrophages, joue un crucial dans le système immunitaire. En plus d'être la première ligne de défense du système immunitaire inné, ils jouent également un rôle essentiel dans l'activation de l'immunité adaptative par leur signalisation et présentant l'antigène rôle 1-3. Bien que la fonction des phagocytes professionnels est à multiples facettes, phagosome maturation est l'épine dorsale critique de la fonction de traitement bactéricide et l'antigène des phagocytes professionnels 4,5. Lors de l'immersion et de l'absorption d'une cible phagocytaires, tels que des bactéries médiée par le récepteur, le phagosome naissante passe par une séquence complexe et bien orchestrée de l'interaction et des échanges avec des compartiments du réseau d'endocytose et plusieurs autres organites cellulaires 6. La nature des composés échangé avec ces entités cellulaires ainsi que la réglementation et le calendrier des événements de fusion détermine la luminale phagosome milieu et les phagoscomposition de omal de membrane et donc 7, le sort du phagosome échéant le 8.

La pertinence physiologique de maturation du phagosome est illustré par les diverses stratégies employées par les différents agents pathogènes intracellulaires d'échapper, arrêter ou renverser phagosome maturation 9. La plupart de ces stratégies prévenir directement ou indirectement la phase finale et critique du processus de maturation du phagosome: la fusion de phagosome avec des compartiments fin endosomal / lysosomales, qui leur apporte l'essentiel des enzymes hydrolytiques et des facteurs anti-bactériennes du phagosome maturité 7 , 8,10. L'analyse de cette étape finale et critique peut donc nous fournir des indicateurs solides sur l'état de maturation des phagosomes et si l'état physiologique naturel est d'être positivement ou négativement affecté dans les paramètres expérimentaux particuliers qui sont utilisés.

Le compartiment endosomes tardifs / lysosomess sont généralement considérés comme les compartiments de raccordement de la voie d'endocytose, définis et distingués des compartiments d'endocytose début par la présence de divers, en scène, des molécules spécifiques de marqueurs. Par exemple des enzymes hydrolytiques ou composants de la membrane telles que les protéines de la membrane lysosomale associés (lampes) entre autres 11. Le terminal endocytose compartiments-appelée simplement comme lysosomes-servent également de l'emplacement principal pour les phases finales de la digestion à la fin de la voie de phagocytose / 12 endocytose. De cette manière, des sondes non digestibles peuvent être chargés par l'intermédiaire de l'endocytose et macropinocytose le milieu extracellulaire et transportés à travers la voie d'endocytose vers les lysosomes, où il s'accumule 13,14 après avoir suivi un cycle défini de l'absorption et de chasse. sondes conjugué à un fluorophore pour la microscopie fluorescente telle que le dextrane polymère organique non digestible sont couramment utilisés comme endocyticprobes 15-17.

Dans cette méthode, nous décrivons l'utilisation de microbilles recouvertes d'IgG en tant que cargaison phagocytaire d'enquêter phagosome maturation par l'analyse de la livraison de contenu lysosomale luminale de phagosomes. En utilisant une sonde dextran conjugué à un fluorophore comme un marqueur facilement détectable des lysosomes dans les macrophages os vivant de moelle dérivés (BMM) et vidéo en temps réel l'imagerie avec un microscope confocal à balayage laser microscope, nous suivons le processus dynamique de la livraison de marchandises en phagosomes à haute résolution temporelle. Nous décrivons ensuite comment les données d'imagerie time-lapse collectées peuvent être évaluées en utilisant open-source et disponible gratuitement le logiciel d'analyse d'image, Fidji (ou ImageJ), une analyse statistique en utilisant Microsoft Excel et présenté en utilisant le logiciel GraphPad Prism 14,18.

Après la description de notre méthode, des expériences analogues peuvent être conçus en utilisant les paramètres et les facteurs modifiés pour étudier leur influence sur la maturation du phagosome, pratiquement n'importe quel otson type de cellules phagocytaires primaires ou de lignées cellulaires adhérentes, perte génétique des expériences de fonction incluant le gène knock-out et knock-down, mutants ou l'expression de protéines de fusion, phagocytaires-cibles, les produits de revêtement de microbilles, des sondes endosomal / lysosomal et des facteurs comme une cytokines, des inhibiteurs chimiques ou siRNA entre autres, sont autant de variables qui peuvent être appliqués à l'approche de base de cette méthode.

Nous définissons l'objectif et les exigences de base de cette méthode comme suit:

  • Objectif de la méthode: pour permettre l'observation directe, quantitative et qualitative et l'analyse de la maturation du phagosome avec une haute résolution temporelle dans les cellules phagocytaires vivre.
  • Cargaison phagocytaire: une microparticule revêtue de manière appropriée ou d'une cible biologique. Ici, nous utilisons recouvertes d'IgG 3 um microparticules sphériques de polystyrène qui sont facilement internalisées via le récepteur Fc-γ phagocytose médiée. Sinon, tout micro-organisme ou micro revêturoparticle pour lequel un récepteur phagocytaire est présent sur les cellules peut être utilisé.
  • Les cellules phagocytaires: les cellules phagocytaires adhérentes exprimant les récepteurs phagocytaires appropriées. Ici, nous utilisons primaires BMMS de souris qui expriment les récepteurs Fc abondamment-γ. En variante, les cellules dendritiques (DC), les monocytes ou les cellules épithéliales phagocytaires ou à leurs mutants ou variants génétiques knock-out peuvent être utilisés.
  • Lysosomale cargaison: Une sonde lysosomale marqué par fluorescence. Ici, le Texas Red-conjugué 70,000 kiloDaltons dextran (Dex70kD) est utilisé en tant que la cargaison de luminal des lysosomes. En variante, n'importe quel marqueur détectable par fluorescence d'un compartiment cellulaire ou organite, ou une sonde appropriée pour les propriétés de phagosome tels que l'acidité ou la capacité de dégradation, peut être utilisée pour étudier la progression de la maturation phagosome.
  • Les facteurs d'influence: Par exemple, les molécules, les composés chimiques, gène knock-down, ou l'expression transitoire de protéines mutantes pourraient signalisation. Ici, nous avons FÖRGun l'utilisation d'un tel facteur pour des raisons de simplicité, mais pour un exemple récent avec l'expression de la protéine mutante et knock-down facteurs influençant s'il vous plaît voir Kasmapour et al. 18 Tout facteur qui peut affecter la phagocytose ou les circonstances et la mobilité des phagosomes et / ou les compartiments qui interagissent avec les phagosomes échéance pourraient être utilisés.

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Protocole

Les soins aux animaux et toutes les procédures dans ce protocole respectent les lignes directrices nationales et institutionnelles.

Préparer les préparations qui sont indiqués par «Π» au préalable.

Une. Préparation de BMMS

  1. Effectuer l'abattage de la souris par dislocation cervicale.
  2. Retirer fémur et des os du tibia, les os gratuits à partir de tissu et couper les deux extrémités de l'accessibilité de la moelle osseuse.
  3. Conserver os dans du PBS glacé ou du milieu DMEM glacé (supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, de la glace jusqu'à l'étape suivante.
    Remarque: Effectuez les étapes suivantes sous une enceinte de sécurité biologique de classe II à minimiser le risque de contamination.
  4. Rincer la cavité médullaire avec du PBS froid + pénicilline / streptomycine à l'aide d'un 26 G (0,45 mm) aiguille fixée à une seringue de 1 ml.
  5. Pellet cellules par centrifugation douce à 350 g pendant 10 min, remettre en suspension le culot dans med BMMium et plaque en microbiologie stérile non revêtu des boîtes de Pétri.
    1. Préparation du milieu BMM
      • Eagles modifié milieu DMEM de Dulbecco
      • 10% de FCS inactivé
      • 20% de fibroblastes de souris L929 ligne de cellules du surnageant de culture (source de macrophages facteur de stimulation des colonies, le M-CSF)
      • De sérum de cheval à 5%
      • 2 mM de glutamine
    2. Préparation du milieu de culture de la lignée cellulaire L929;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640
      • 10% de FCS inactivé
      • 2 mM de glutamine
    3. Préparation de la souris fibroblastes L929 lignée cellulaire surnageant de culture;
      • Les cellules confluentes ont été scindées L929 1:4, cultivées dans des flacons de 175 cm 2 pendant 2 jours à l'aide de 20 ml de milieu L929 et le surnageant de culture a été recueilli après 48 heures, filtrés et ajoutés au milieu BMM-
  6. Incuber les cellules vidées dele fémur dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO2 atmosphère.
  7. Après toutes les 48 heures (maximum 72 heures) de l'incubation, aspirer le milieu et le remplacer par un milieu BMM frais, pour un maximum de 10 jours. Plus de 95% des cellules étaient positives pour CD14 tel que testé par cytométrie en flux. CD14 est un récepteur de reconnaissance de motif exprimé principalement par les macrophages. En déterminant le pourcentage de cellules positives pour ce récepteur, une culture pure de BMMS adhérentes a été généré.

Remarque: la préparation et la culture des cellules en conséquence si d'autres types de cellules sont utilisés.

2. Revêtement de microbilles que phagocytaire Cargo

  1. Pour la préparation de 1 ml suspension de billes, utiliser 400 ul de 2,5% 3 um de microparticules de polystyrène carboxyles, ou microparticules alternatives.
  2. Transférer la suspension de billes dans un tube de 1,5 ml, laver 3 fois avec du PBS et ajouter 100 ul de 500 mM de 2 - (N-morpholino) éthanesel de sodium de l'acide ulfonic, tampon MES à pH 6,7 au culot de billes.
  3. Dissoudre 50 ug d'IgG de souris (anticorps polyclonal IgG) dans 50 ul stérile trou DDH 2 O et ajouter à la suspension de billes.
  4. Remplir la suspension à 1 ml avec le trou DDH 2 O stérile (450 ul).
  5. Incuber la solution pendant 15 min sur une roue en rotation à la température ambiante.
  6. Préparer EDAC agent de réticulation, la N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide à une concentration de 10 mg / ml et ajouter 14 ul de la suspension de billes.
    Remarque: EDAC liaisons transversales des groupes amino de l'IgG avec les groupes carboxyle sur la surface des billes et facilite l'immobilisation de l'IgG sur la surface des billes. Cela est essentiel pour bourrelet absorption et donc la solution doit être préparée fraîchement.
  7. Incuber la suspension sur une roue en rotation pendant 1 h à RT.
  8. Ajouter 14 ul de EDAC agent de réticulation et incuber la suspension sur une roue en rotation pendant 1 heure à température ambiante.
  9. Centrifuger la suspension à 10 000 g pendant 2 min dans une microcentrifugeuse.
  10. Laver les billes 3x dans du tampon d'arrêt (1% de Triton-X 100 dans du Tris 10 mM, pH 9,4) afin d'arrêter la réaction de réticulation, en remettant en suspension le culot dans un tampon de butée et le filage de la solution à 10 000 x g pendant 2 min.
  11. Lavez perles 3x dans du PBS et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS.
    Facultatif: Préparer des aliquotes de travail de 30-50 pi.
  12. Conservez la suspension de billes recouvertes d'IgG à 4 ° C pendant plus de 4 semaines et ne laissez jamais la suspension à congeler.

Remarque: un conservateur tel que l'azide de sodium à une concentration finale de 0,02% (p / v) peut être ajouté à la suspension pour empêcher la croissance des bactéries et la contamination. Dans ce cas, le lavage des billes avant de l'utiliser doit être effectuée pour éviter des effets cytotoxiques de l'agent de conservation. Centrifuger une aliquote de la suspension à 10 000 x g pendant 2 min et laver les billes par resuspension du culot dans du PBS. Répétez laver 3x.

3. Préparation de la solution mère Dextran Probe

  1. Dissoudre le rouge Texas 70000 kiloDaltons Dextran (Dex70kD) dans du PBS à 20 mg / ml et conserver à -20 ° C, selon les instructions du fabricant.
    Remarque: Maintenir les stocks à -20 ° C pendant plusieurs mois, ou à 4 ° C pendant quelques semaines, voir la documentation du fabricant.
  2. Préparer la solution de dextrane pour l'expérience à partir de la langue en la diluant dans du milieu complet de culture cellulaire DMEM (DMEM, 10% SVF, 2 mM de L-glutamine) à environ 1 mg / ml (de plusieurs fois la solution concentrée qui sera dilué à l' concentration de travail finale de 20 pg / ml avant l'addition aux cellules).
  3. Utilisez une échographie au bain-marie à soniquer l'aliquote dextran pendant 5 min pour homogénéiser la solution et dissoudre les agrégats qui pourraient plus tard mener à la génération artefact lors de l'imagerie.
  4. Centrifugeuse à g maximalependant 5 min dans une microcentrifugeuse pour éliminer les grumeaux ou de contaminants non dissous de la solution.
  5. Déplacer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube, tout en évitant le culot au fond du tube et on dilue la solution à la concentration de travail finale de 20 pg / ml dans du milieu complet de culture cellulaire DMEM.
  6. Filtre stérile la solution en utilisant une seringue de 0,2 um filtre monté.

4. Dextran préchargement

  1. cellules de semences dans un plat en direct d'imagerie cellulaire de fond de verre et incuber pendant au moins 12 heures (à 37 ° C dans 5% de CO 2 atmosphère) à assurer la fixation et l'acclimatation.
    Remarque: Il ya des plats à fond de verre segmenté disponibles qui permettent d'effectuer des expériences multiples (jusqu'à quatre compartiments) par plat.
  2. Préparer le dextran en solution DMEM tel que décrit dans le protocole 3. Faire chauffer le dextran préparé en solution DMEM, en utilisant un bain d'eau à 37 ° C.
  3. Aspirer un moyennd ajouter une solution de dextrane à des cellules soigneusement et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant 2-8 heures atmosphère pour l'absorption.
    Remarque: planifier et optimiser le protocole sur la base de la sonde et la cellule de type qui est utilisé et strictement conserver à cette durée lors de la répétition des expériences. Ceci est essentiel pour le profil d'accumulation de dextrane dans la voie d'endocytose, et donc la reproductibilité des expériences.
  4. Laver les cellules 3x avec préchauffé milieu DMEM complet; moyen d'aspirer et rincer soigneusement les cellules avec du milieu frais.
  5. Incuber les cellules avec du milieu complet DMEM pendant 4-12 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2, atmosphère.
  6. Laver les cellules une fois avec du phénol filtré du milieu DMEM sans rouge complet préchauffé.
  7. Pour des résultats optimaux d'imagerie, le changement de phénol préchauffé filtré du milieu DMEM sans rouge complète au moins 30 minutes avant le début de l'imagerie. Rouge de phénol peut causer l'extinction des signaux fluorescents, augmenter le bruit de fond etainsi réduire le contraste et la clarté.

Remarque: Configurer le microscope et les paramètres d'imagerie à l'avance, selon le protocole préétabli et optimisé en fonction du type de sonde et les cellules qui sont utilisées.

5. Ajouter des perles recouvertes d'IgG

  1. Equilibrer préalablement préparé une aliquote de la suspension de billes de 1% à température ambiante et sonication dans un bain d'eau à ultrasons pendant 2 à 3 min.
  2. Ajouter 1-6 pi de la suspension de billes de 1% au milieu complet filtré de rouge de phénol DMEM sans sous une enceinte de sécurité biologique de classe II à minimiser le risque de contamination (une bonne concentration de départ est de 1 pl / 2 cm 2 de surface de la boîte).
    Remarque: Voici BMMS ont été ensemencées à 25 000 cellules / puits et un 6 pi de 1% stock suspension de billes a été ajouté à la moyenne dans le plat. Ce qui correspond à peu près un rapport billes / cellule de 15:01. Le rapport doit être adapté au type de cellules qui est utilisé et de la matière de tringle; i.e. des billes de latex ont une faible densité et ne tombent pas au fond rapidement, tandis que des billes de polystyrène d'un évier et entrent en contact avec les cellules adhérentes beaucoup plus rapide et donc en plus grand nombre.
    Remarque: En fonction de l'expérience, il peut être avantageux de choisir la région qui sera observée à l'avance. La suspension de billes peut alors être ajouté uniquement à la région spécifique de l'antenne à fond de verre, ce qui augmente la probabilité d'observer des événements d'absorption favorables.
  3. Le nuage dense de billes peut être diffusé par un léger pipetage la suspension dans le plat de fond de verre.
  4. Attendre jusqu'à ce que les perles tombent au fond de la cuvette de fond en verre et sont à peu près dans le même plan avec les cellules phagocytaires adhérentes.
  5. Focus sur la région d'intérêt (ROI) et commencer la imagerie time-lapse.

Remarque: Il peut être nécessaire d'affiner la mise au point en imagerie est en cours, en fonction du système d'imagerie qui est utilisée, son stabilité et la mobilité des cellules observées. Toutefois, notez que cela peut rendre impossible, l'analyse appropriée de phagosomes qui s'écartent fortement du plan de mise au point à la suite de recentrage.

6. Imagerie

Suivez les instructions ci-dessous pour une qualité optimale de l'imagerie;

  1. Utiliser un système d'imagerie confocale, comme un système à balayage laser ou filage disque.
    Remarque: Un Leica TCS SP5 AOBS laser confocale à balayage microscope commandé par le logiciel Leica LAS AF et équipé d'une chambre de contrôle de l'environnement a été utilisé ici pour time-lapse imagerie vidéo.
  2. Optimiser les paramètres d'imagerie telles que la vitesse de balayage, grossissement, la résolution, etc. de manière à permettre un débit d'une trame dans chaque 7-20 sec, en fonction du système utilisé.
    Remarque: Ici, une vitesse de 200 Hz de balayage, 2x scanner zoom et une moyenne de ligne de 2-3x à une résolution de 512 x 512 pixels resuLted dans un temps d'enregistrement entre 3-5 sec / rame. Un taux d'un cadre dans toutes les 10 secondes a été utilisé pour enregistrer des films en accéléré avec des durées d'au moins 120 min.
  3. Utiliser les paramètres d'excitation / émission appropriés basés sur le système d'imagerie utilisé et la sonde (s).
    1. Optimiser les réglages pour éviter excessive photo-blanchiment.
      Remarque: Ici, le Texas Red dextran 70kD était excité à l'aide d'un DPSS (561 nm) et l'émission de lumière laser a été détectée par un détecteur hybride Leica (HYD) à 600-650 nm avec un pic d'émission à 610 nm. l'intensité du laser doit être adaptée à l'intensité du signal et maintenue aussi basse que possible pour minimiser photo-blanchiment du fluorophore (s) et l'image un effet de toxicité de la lumière laser sur les cellules. En règle générale, il est important d'équilibrer la vitesse de balayage, la ligne moyenne, la résolution de balayage, l'intervalle de trame et la durée de la formation d'image afin d'obtenir une intensité de signal adéquate et stable et capturer toute la durée de l'absorption de talon et phagosome maturation proprocessus.
  4. Inclure un canal clair (BF) pour observer les billes si elles ne sont pas conjugués avec un fluorophore.
    Remarque: Outre le canal rouge Texas, canal BF a été utilisé pour visualiser les perles, le même laser DPSS a été utilisé comme source de lumière et le signal a été détecté avec un photomultiplicateur (PMT) détecteur.
    Remarque: Assurez-vous d'appliquer les paramètres d'enregistrement identiques lors de l'acquisition de données qui doit être assemblé. Paramètres les plus importants sont: l'intensité laser d'excitation, réglage du détecteur, les paramètres d'acquisition, d'agrandissement et des intervalles de trame. Ne pas utiliser des intervalles de trame identiques nécessitera une étape courbe moyenne que les points de données d'observation ne se chevauchent pas (par exemple, pour rassembler une observation avec des cadres acquis à chaque 7 secondes avec un autre jeu avec des cadres à toutes les 12 sec). Cela permettrait d'accroître les mesures nécessaires pour l'évaluation des données et nécessitent un logiciel supplémentaire avec la fonction courbe moyenne, comme OriginLab 's Origine logiciel de statistiques Pro ( http://www.originlab.com/ ).
  5. De préférence, enregistrer la vidéo time-lapse dans le format de fichier natif du système d'imagerie utilisée et éviter d'exporter dans des formats compressés.

Remarque: Ici, les films de time-lapse ont été enregistrés dans le format natif Leica LAS AF de fichiers, qui ont ensuite été directement importé d'ouvrir à Fidji (FRV).. Fidji est capable de lire les formats de fichiers natifs de la plupart des fabricants de microscopes utilisant le Bio formats importateur plug-in inclus. Exportation du fichier vidéo en time-lapse d'une série d'image JPG ou TIFF ou un fichier vidéo dans un format conteneur AVI n'est pas nécessaire ou recommandé. En plus de préserver la qualité d'image optimale à partir de l'observation originale en évitant les algorithmes de compression avec perte (par exemple JPEG), en utilisant le format de fichier de microscope natif assure que les méta-données du fichier (horodatage, grossissement, laser et d'acquisition des intensités, Les paramètres de détection, etc) est conservée et disponible pour Fidji. Toutefois, si pour une raison quelconque, les fichiers vidéo time-lapse doivent être exportés dans un format différent pour l'analyse, assurez-vous d'utiliser des formats de fichiers non compressés tels que série d'images TIFF et couleur RVB séparé (rouge, vert, bleu) canaux déjà à ce étape, les Fidji ne peuvent souvent pas réussi à séparer le canal de BF à partir d'autres canaux de couleur dans les fichiers exportés. Aussi, assurez-vous de conserver les fichiers originaux de microscope comme une référence.

7. Analyse des time-lapse Films

  1. Utilisez ImageJ, Fidji ou tout autre logiciel qui fournit une capacité d'analyse analogues d'association de signal.
    Remarque: Ici, Fidji a été utilisé pour l'analyse des films time-lapse. Fidji est une distribution ImageJ contenant un logiciel de traitement d'image avec des menus de l'outil réorganisées et plug-ins natifs supplémentaires, disponibles en téléchargement gratuit sur ​​http://fiji.sc . Le procédé décrit dans ce section est représenté sur la figure 2.
  2. Ouvrez le fichier à Fidji en cliquant sur "Fichier", "Ouvrir" et en choisissant le fichier, ou en faisant glisser le fichier à Fidji.
  3. Choisissez les options suivantes;
    1. Empilez visualisation: Voir pile avec HyperStack,
    2. Options de couleur: Mode couleur teintées,
    3. Canaux divisé en fenêtres séparées: les chenaux séparés (pour chaque canal RVB couleur qui a été enregistrée une fenêtre séparée seront ouverts).
  4. Dans le cas d'une série d'image doit être utilisée, charger la série à Fidji en allant dans "Fichier", "Importer", "séquence d'images" et choisissez un fichier image dans le dossier qui contient la série d'image cible.
    1. Définissez des filtres et les conditions de chargement des images sélectionnées dans la série, par exemple;
      1. Nombre d'images: le nombre d'images à charger.
      2. Image de départ: quelle image est l'image de départ de la série.
      3. Incrémenter: l'incrément entrecadres à charger (chaque cadre, chaque deuxième trame, etc.).
      4. Nom du fichier contient: filtrage pour le canal spécifique en utilisant le nom du fichier (en créant par exemple "c001", qui est de savoir comment normalement les images "Channel 1" sont marquées après séparation des couleurs d'un multi-time-lapse vidéo).
  5. Retirer l'échelle en allant dans "Analyser", "Set échelle ...", cocher la case "Global" et en cliquant sur "Cliquez pour enlever le tartre".
    Remarque: Cette étape permet d'analyser les images en cas différents grossissements ont été utilisés pour les différents ensembles expérimentaux qui doivent être évalués à base de pixels. Si les paramètres d'agrandissement ont toujours été maintenue constante et le fichier natif microscope a été importée directement à Fidji, cette étape peut être sautée, comme Fidji peut comprendre et utiliser les données d'agrandissement et d'échelle de métadonnées du fichier de microscope.
  6. Mettre en place des paramètres de mesures en allant dans "Analyser", "Set mesures" et cochant les cases suivantes: "Zone", "écart-type", "densité intégrée», «étiquette d'affichage" et "Mean valeur de gris".
  7. Redirection vers le canal de couleur qui contient le signal de la sonde qui doit être mesuré et confirmer avec "OK".
  8. Aller à la trame dans laquelle les mesures doivent être commencé et sélectionner la fenêtre du canal de BF en cliquant sur le bord supérieur de la fenêtre.
  9. Utilisez le "outil de sélection ovale" pour sélectionner une région d'intérêt (ROI), c'est à dire un retour sur investissement circulaire sur la perle intériorisé. S'assurer que la sélection est montée serrée sur le bord extérieur du bourrelet comme visible dans le canal de BF.
    Remarque: Si vous utilisez un PC, maintenez la touche Shift tout en utilisant l'outil de sélection pour assurer un retour sur investissement circulaire.
  10. Lancer la mesure optimale de quelques images avant la pleine immersion de la perle est terminée et noter latrame dans laquelle un bourrelet phagosome naissant entièrement formé est formé et la coupelle phagocytaire est fermé. Cela devrait être relativement clairement discernable dans le canal de BF.
  11. Allez sur "Analyser" et cliquez sur "mesure" pour exécuter la mesure, le résultat s'affiche dans une fenêtre distincte intitulée «Résultats».
  12. Aller à l'image suivante, ajuster la position de la ROI dans le cas où le cordon a été déplacé, et répéter la mesure. Le résultat sera ajouté à la liste dans la fenêtre de résultat, chaque trame analysée peut être identifié sur la base de la valeur de la colonne "Label".
    Remarque: l'utilisation des touches de raccourci (par exemple, «M» pour la mesure) peut considérablement accélérer le processus d'évaluation, voir la liste des raccourcis et affecter les costumes dans le menu "Plugins".
  13. Après avoir terminé la mesure de tous les cadres concernés, les résultats peuvent être copiés sur un tableur comme MS Excel. La colonne "IntDen" dépeint la intensities de la région sélectionnée dans le canal de ce que la mesure a été redirigé vers.

8. Blanchiment correction

En fonction de la sonde utilisée et les paramètres de formation d'image, de photo-blanchiment peut se produire. En fonction de son étendue, ce qui pourrait affecter fortement le résultat de l'évaluation. Cependant, cet effet peut être partiellement corrigé en appliquant un taux égal mais opposé de modification des valeurs mesurées. S'il est présent, le coefficient de photo-blanchiment peut être calculée en mesurant la diminution de l'intensité en fonction du temps du signal dans la trame entière, ou de la zone cultivée en particulier de la trame, pendant la durée de temps pertinente pour l'analyse de chaque phagosome. Ce processus est représenté sur les figures 3 et 4.

  1. Dans le menu "Plugins" de Fidji, utiliser la série "Analyseur Temps" plug-in pour déterminer la diminution générale de l'ensemble du cadre, ou ROI spécifique intensité du signal de la sonde au cours du temps (figure 3).
    Remarque: Time Series Analyzer plug-in est disponible pour le téléchargement à http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , dans le cas n'est pas déjà présent dans le menu Plugins.
  2. Tracer la mesure du temps (en secondes) dans MS Excel, uniquement pour les cadres qui correspondent aux cadres d'un phagosome analysé.
  3. Appliquer une ligne de tendance linéaire (figure 4A) à l'intrigue; une pente négative pour diminuer le signal indique la présence d'un effet de photo-blanchiment.
  4. Appliquer la pente inversée de valeurs d'un phagosome analysé (figures 4B et 4C): intensité du signal corrigé (SI) = SI brut + (temps en secondes * inverser la pente)

Remarque: chaque phagosome analysé unique aura un laps de temps spécifique (à partir de châssis de l'absorption complète) au cours d'une séquence vidéo enregistrée time-lapse, la photo-bleaching doit être recalculée pour que la durée spécifique et sera valable que pour corriger les valeurs mesurées à partir de ce phagosome spécifique.

9. évaluation des données

  1. Rassembler les données et calculer l'erreur moyenne et statistique des valeurs de blanchiment corrigée dans le logiciel approprié.
  2. Tracer les données évaluées sous une forme appropriée.

Remarque: Ici, les statistiques scientifiques et tracer le logiciel GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ) a été utilisé. logiciel Prism est capable de générer et de tracer une courbe moyenne avec les indicateurs d'erreur correspondants aussi longtemps que toutes les données ont le même taux de trame (c'est à dire tous ont été acquis avec les mêmes intervalles, comme une image toutes les 10 secondes).

Nota: Les grandes variations des valeurs absolues à l'intérieur de l'IS répétitions de la même expérimensemble ent présentera très grande erreur statistique et de rendre les données inutilisables. Cela peut être le cas si le protocole, par exemple les paramètres d'imagerie, ne sont pas tenus strictement identiques entre les différentes répétitions d'expérimentation qui doivent être rassemblées.

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Résultats

La préparation correcte des cellules et les billes pour l'imagerie est critique. Figure 1 montre le contour de l'ensemencement, la sonde de chargement et les étapes de formation d'image initiaux dans ce procédé, sur la base de notre protocole optimisé pour BMMS. Il est donc essentiel que les paramètres de protocole être testées et optimisées en fonction du type de cellules et des sondes qui doivent être utilisés.

Après addition des billes recouvertes d'IgG au...

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Discussion

Dans la section suivante, nous allons discuter des étapes critiques de la méthode présentée et de ses limites. En outre, nous allons connecter certains des problèmes communs avec leurs solutions, apporter des modifications possibles et considérer les avantages de notre méthode ainsi que les méthodes complémentaires appropriés pour cette approche.

La préparation des billes, y compris le couplage de l'IgG à la surface des billes, est essentielle et l'utilisation de préparations unfresh...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions les membres du Laboratoire de Biologie Phagosome pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail est soutenu par une subvention de Helmholtz Young Investigator (Initiative et les fonds de mise en réseau de l'Association Helmholtz) et un programme de priorité SPP1580 Grant du Conseil de recherches en allemand (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu Dulbecco’s Modified Eagles (D-MEM)PAA, AutricheE15-009
Milieu Dulbecco’s Modified Eagles sans rouge de phénol (D-MEM)PAA, AutricheE15-047
Sérum fœtal de bovin (FBS)PAA, AutricheA15-151
L-GlutaminePAA, AutricheM11-004
PBSPAA, AutricheH15-002
Pénicilline/StreptomycinePAA, AutricheP11-010
WillCo-dish® ; Plat à fond en verre (35 mm &empty ;, #1.5)WillCo Wells, Pays-BasGWSt-3522
CELLviewTM Plat à fond en verre, 35 mmGreiner Bio one, Allemagne627871Alternative : Disponible en microsphères de
latex carboxyléesPolysciences, USA#09850Disponible en différents diamètres, nous avons utilisé 3 &mu ; m
Microparticules de polystyrèneKisker Biotech, AllemagnePPs-3.0COOH
Triton-X 100ROTH, Allemagne305.1.3
souris entière IgGRockland, États-Unis010-0102
Réticulant EDACSigma-Aldrich,États-Unis E6383-1g
10 mM TrisSigma-Aldrich, États-UnisT1503
Seringue de 1 ml Omnifix -FB.Braun, Allemagne9161406V
26  ; Aiguille G (0.45*25 mm)B.Baun, Allemagne4657683
RPMI 1640PAA, AutricheE15-039
Sérum de chevalGibco, USA16050-122
MES hydrateSigma-Aldrich, USAM2933
0.2 &mu ; Filtre monté sur seringue MSartorius, Allemagne83.1826.001
segmentées

Références

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