Cytotoxique efficacité de la thérapie photodynamique dans les cellules ostéosarcome<em&gt; In Vitro</em

Résumé

Le protocole présenté ici permet l'évaluation de l'efficacité de la thérapie photodynamique (PDT) dans des lignées cellulaires et l'optimisation des paramètres de PDT avant l'application de la thérapie chez des modèles animaux.

Résumé

Au cours des dernières années, on a observé la difficulté de trouver des traitements plus efficaces contre le cancer avec moins d'effets secondaires systémiques. Par conséquent thérapie photodynamique est une nouvelle approche pour un traitement sélectif plus de tumeur.

La thérapie photodynamique (PDT) qui rend l'utilisation d'un photosensibilisateur non toxique (PS), qui, lors de l'activation avec de la lumière d'une longueur d'onde spécifique en présence d'oxygène, génère des radicaux oxygène qui suscitent une réponse cytotoxique ^1. Malgré son approbation il ya près de vingt ans par la FDA, PDT n'est plus utilisé que pour traiter un nombre limité de types (de la peau, de la vessie) et les maladies nononcological (psoriasis, la kératose actinique) ² cancer.

L'avantage majeur de l'utilisation de la PDT est la capacité à effectuer un traitement local, ce qui empêche les effets secondaires systémiques. En outre, il permet le traitement de tumeurs sur des sites sensibles (par exemple autour des nerfs ou des vaisseaux sanguins). Ici, un intraoperative demande de PDT est considéré dans l'ostéosarcome (OS), une tumeur de la moelle, à une cible, les satellites de la tumeur primaire a laissé la tumeur dans les tissus environnants après la résection chirurgicale de la tumeur. Le traitement vise à diminuer le nombre de récidives et à réduire le risque de (post-opératoire) métastase.

Dans la présente étude, nous présentons in vitro procédures PDT à établir les paramètres PDT optimales pour un traitement efficace de lignées cellulaires OS largement utilisés qui sont utilisés pour reproduire la maladie chez l'homme dans les modèles de souris OS intratibial bien établies. L'absorption de la PS mTHPC a été examiné avec un spectrophotomètre et la phototoxicité a été provoqué par une lumière laser excitation de mTHPC à 652 nm pour induire la mort cellulaire évaluée par un test WST-1 et par le comptage des cellules survivantes. Les techniques établies nous permettent de définir les paramètres optimaux PDT pour de futures études sur des modèles animaux. Ils sont un outil simple et rapide pour l'évaluation de l'efficacité de la TPD in vivo.

Introduction

L'état du traitement de l'art de l'ostéosarcome (OS) d'aujourd'hui, une tumeur osseuse primaire, englobe une combinaison de chimiothérapie néoadjuvante et chirurgie. Ce schéma de traitement a révélé une augmentation du taux de patients avec une maladie localisée à partir d'environ 20% avant l'utilisation de la chimiothérapie de survie, à ce moment entre 60 à 70% ^{3, 4.} Cependant, dans les deux dernières décennies, la survie globale des patients atteints de la maladie d'OS locale a atteint un plateau ^{4, 5.} De plus, 30 à 40% de ces patients rechutent dans les 3 ans après le diagnostic et les patients avec une maladie métastatique continuer à avoir un faible taux de survie de 20 à 30% ^{4, 6, 7.} Pour améliorer les résultats de ces patients, de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être développées.

La thérapie photodynamique (PDT), un lieu nouveau traitement anticancéreux, utilise la lumière d'une longueur d'onde spécifique pour l'excitation d'un photosensibilisanttizer (PS), qui s'accumule dans les cellules tumorales après son injection dans la circulation sanguine. La lumière laser d'excitation de la PS génère des radicaux oxygène en présence d'oxygène, qui induisent une réaction cytotoxique dans les cellules tumorales et la mort cellulaire. Outre ce mécanisme primaire, deux PDT supplémentaire évoquée processus biologiques contribuent à la croissance tumorale réduite: PDT provoque une vasoconstriction et la formation de thrombus de la microvascularisation de la tumeur et, par conséquent, l'hypoxie et l'anoxie locale à l'intérieur de la tumeur, ce qui conduit à un infarctus d'une tumeur. Enfin, PDT blessé et les cellules tumorales meurent déclencher une réponse immunitaire locale, une caractéristique assez unique de PDT. Il s'agit du système du complément et l'activation des cellules dendritiques présentatrices d'antigène ^8. Ainsi, des conditions sont créées pour la présentation des antigènes tumoraux avec l'activation subséquente des cellules lymphoïdes, qui conduit à une immunité spécifique de la tumeur.

Jusqu'à présent, la PDT a été utilisé pour traiter plusieurs types de tumeurs des tissus mous et hyperplasie du, comme la kératose actinique, l'oesophage de Barrett, une tumeur endobronchique, cancer de la vessie, des carcinomes baso-cellulaires, et le traitement palliatif du cancer tête et cou ^2. Le traitement est connu pour provoquer, à grande échelle d'une nécrose locale avec seulement peu d'effets secondaires, et a donc le potentiel pour éliminer de manière sélective du tissu tumoral. Malgré ces avantages, l'application de la PDT reste techniquement plus exigeant que l'administration de médicaments chimiothérapeutiques. Afin d'obtenir une efficacité maximale, la concentration en PS, le temps d'exposition de lumière et de transfert de l'énergie totale de la lumière doivent être optimisés. Cela peut être fait dans des expériences in vivo, mais, en raison du grand nombre relatif de paramètres qui doivent être optimisé, il est plus efficace de déterminer les conditions optimales d'abord in vitro.

Dans les expériences décrites ci-dessous, nous avons testé l'efficacité in vitro de la PDT en utilisant le PS 5,10,15,20-tétrakis-(méta-hydroxyphényl) chlOrin, en abrégé mTHPC (figure 1A). mTHPC est la substance active dans le médicament Foscan, qui est actuellement utilisé en clinique pour le traitement palliatif du cancer tête et cou. Il est l'un des plus puissants PS, induisant des lésions cellulaires massif déjà à de faibles concentrations, et il a été démontré pour être supérieur à l'autre PS en termes de pénétration de tissu ^{9, 10.} Son spectre d'absorption de la lumière (Figure 1B) montre deux pics importants, l'un à 417 nm et une seconde à 652 nm, qui sont utilisés pour la localisation tissulaire de PS et d'accumulation pour la PDT induction, respectivement.

Actuellement, une formulation liposomale pour mTHPC est en cours de développement. Ici, nous décrivons les procédures de quantifier l'absorption de cette formulation liposomale, et pour effectuer des PDT dans deux lignées de cellules humaines OS, le faible HOS métastatique et les cellules métastatiques 143B élevés. Certaines des données présentées ici ont été signalés plus tôt ^11. Thapproche e décrit ici nous permet d'étudier l'effet d'un phénotype métastatique sur PDT efficacité. Cellules 143B, orthotopiquement injectés dans les membres postérieurs des souris SCID immunodéficientes provoquent des métastases des tumeurs primaires intratibial, un modèle imitant de près la maladie de métastases humaine. Ainsi, les expériences proposées in vitro sont parfaitement adaptés pour évaluer les paramètres optimaux PDT pour être utilisés plus tard dans des expériences in vivo.

Protocole

Une. Comparaison de l'absorption de mTHPC dans le respectifs faible et très métastatique HOS et 143B OS lignées cellulaires

1. Préparer un milieu de culture cellulaire contenant du DMEM, Ham F12, et inactivé sérum de veau foetal de chaleur dans un rapport 4.5:4.5:1.
   Remarque: La formulation liposomale de la PS mTHPC a été dissous dans de l'eau à une concentration finale de 1,5 mg / ml mTHPC.
2. Plaque de 0,2 x 10 ⁶ cellules HOS et 143B / puits dans des plaques 6 puits (triple pour chaque condition) et laissez les cellules adhèrent nuit.
   Remarque: le nombre doit être ajusté à des lignées de cellules individuelles. A une confluence de 80-90% est le plus approprié au moment de l'expérience.
3. Le jour suivant, incuber les cellules avec une concentration fixe de mTHPC pour différentes périodes de temps (de l'absorption en fonction du temps), ou avec des concentrations croissantes de mTHPC pendant une période de temps fixe (dose d'absorption dépendant).
4. Incuber les cellules avec mTHPC pendant p spécifiqueoints ou concentrations de mTHPC.
   Nota: Dans cette étude, à la fois le HOS et les lignées de cellules 143B ont été mises en incubation avec 0,6 ug / ml mTHPC pendant 0, 2,5, 5, ou 10 heures, ou avec 0, 0,6, 2,5 et 10 pg / ml mTHPC pendant 5 heures. Les périodes de temps et les doses appliquées peuvent varier en fonction de la lignée cellulaire qui est utilisée.
5. Rappelez-vous de toujours travailler dans l'obscurité ou dans des conditions de lumière tamisée pour éviter l'exposition de la lumière directe des cellules.
6. Après incubation des cellules dans des conditions indiquées, aspirer le milieu et laver les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, détacher les cellules avec 0,5 ml de trypsine / EDTA et compter les cellules.
7. Après détachement, centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 minutes, aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans du PBS à une densité finale de 200 000 cellules / ml.
8. Introduire à la pipette 100 ul de la suspension cellulaire obtenue (soit 20 000 cellules) dans une plaque de 96 puits et de mesurer la fluorescence de ces cellules dans un spectrophotomètre à fluorescence. Le paramètres pour les mesures de fluorescence sont mTHPC: 417 nm pour l'excitation et 652 nm pour l'émission.
9. Pour calculer la quantité de mTHPC intériorisée par cellule, normaliser l'unité de fluorescence relative (RFU) pour le nombre de cellules et le volume des cellules de la manière suivante:
10. Préparer une courbe d'étalonnage en utilisant des concentrations différentes de mTHPC dans du PBS 0-4 pg / ml (mesures en triple utilisation). Introduire à la pipette 100 ul de chaque dilution dans une plaque de 96 puits et de mesurer la fluorescence des puits en utilisant les paramètres décrits dans l'étape 1.6.
11. Diviser la RFU (obtenu pour 20 000 cellules) par la pente de la courbe d'étalonnage linéaire de mTHPC, ce qui donne la concentration de mTHPC (en pg / ml) dans le puits.
12. Diviser cette concentration mTHPC par 10 pour obtenir le montant total de mTHPC dans un puits (en ug, soit 100 pi de suspension cellulaire) et diviser cette valeur par le volume de 20.000 cellules.
13. Calculer le volume de la formule pour une sphère: (4/3 x π) xr ^3. Obtenir le rayon r en mesurant le diamètre de 20 cellules trypsinisées sous un microscope, et en divisant cette valeur par deux.
14. Enfin, normaliser toutes les valeurs à celles obtenues pour les cellules HOS après 10 h d'incubation (dose d'absorption dépendant) ou traitées avec 10 pg / ml mTHPC (absorption en fonction du temps), ce qui a été défini à 100%.

2. Mesure de la phototoxicité de PS In Vitro

1. Fleurs 3000 cellules / puits dans une plaque de 96 puits (triple pour chaque concentration de mTHPC utilisés) et permettent de faire adhérer la nuit. Préparer même une plaque de 96 puits supplémentaires et de traiter les cellules comme décrit ci-dessous, puis les mettre de côté pour l'imagerie de contraste de phase.
   Remarque: le nombre doit être ajusté pour chaque ligne de cellule individuelle. A une confluence de 50 à 60% au moment de l'expérience est idéal.
   1. Gardez à l'esprit pour ajouter le contrôle de toxicité dans l'obscurité correspondant de cellules pour chacune des concentrations mTHPC. Lasoi sont des cellules qui seront incubés en l'absence ou en présence de concentrations sélectionnées de mTHPC, mais ne sera pas allumé.
2. Le jour suivant, incuber les cellules avec des concentrations différentes de mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 et 10 pg / ml) en fonction des lignées cellulaires et les garder dans l'obscurité pendant 5 heures.
   1. Reportez-vous à la section 1.3.2
      Remarque: Le temps d'incubation avant l'illumination dépend de la lignée cellulaire et le PS utilisé, par conséquent, il est recommandé de tester des concentrations différentes et de différents points dans le temps dans des expériences séparées.
3. Après incubation pendant la période indiquée, laver les cellules deux fois avec du PBS et ajouter de nouvelles du milieu frais sans mTHPC.
4. Éclairer les cellules avec une diode laser de 652 nm, spécifique pour le spectre d'absorption mTHPC (voir la figure 1).
   1. Réglez le laser à 21.88 mW / cm ² puissance à une hauteur de 13,5 cm distance à partir des cellules, afin d'obtenir une dose d'énergie de 5 J / cm ^2. Éclairer les cellules pour 230 sec. Ne pas éclairer les cellules sombres de contrôle de la toxicité (avec et sans mTHPC).
      Remarque: Toujours porter des lunettes pour protéger les yeux de la lumière laser utilisée pour l'excitation du PS.
5. Après l'illumination, maintenir les cellules dans l'obscurité à 37 ° C pendant 24 heures. Par la suite, ajouter de l'eau tétrazolium soluble (WST-1) réactif (10 μl/100 ul de milieu).
6. Trois heures après l'addition du réactif WST-1, mesurer l'absorbance de chaque puits de la plaque à 96 puits à 415 nm.
7. Afin de calculer le pourcentage de cellules survivantes, réglez la moyenne des valeurs obtenues pour les cellules non traitées mTHPC pour chaque condition à 100% (c.-à-éclairés, sans mTHPC et non éclairée, sans mTHPC).

3. Estimation du nombre de cellules par Comptage des cellules

1. Semences cellules 20000 / nousll dans une plaque de 24 puits et permettent de faire adhérer la nuit.
2. Incuber les cellules pendant 5 heures avec mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, et 1,25 pg / ml) et de les illuminer, comme décrit ci-dessus.
3. Recueillir le milieu, laver les cellules une fois avec du PBS, trypsiniser eux et à leur rassemblement par centrifugation à 400 g pendant 5 min.
4. Après centrifugation, aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de milieu frais.
5. Compter les cellules dans une chambre de Neubauer.

Résultats

Avec les techniques ici rapportés, nous avons étudié PDT à base de mTHPC dans les cellules du système d'exploitation de l'homme. En premier lieu, l'heure et la dose d'absorption dépendant mTHPC a été étudiée dans le bas HOS métastatique et dans les lignées cellulaires hautement métastatiques 143B OS. mTHPC absorption peut être évaluée en mesurant la fluorescence de mTHPC avec un spectrophotomètre de fluorescence (figure 2, reproduite avec la permission de Reidy et al. ^11).<...

Discussion

Pour atteindre la cytotoxicité optimale en réponse à la PDT, il est essentiel de choisir les bons réglages de lumière laser et des temps d'incubation. Les procédures décrites ici sont cohérentes et efficaces pour déterminer PS absorption et de quantifier la cytotoxicité induite par PDT in vitro. En utilisant les longueurs d'onde d'absorption spécifique de la PS mTHPC, l'absorption cellulaire de PS peut être déterminée d'une manière directe, et le PS peut être activé afin de générer des espèc...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	PAA GmbH, Fribourg, Allemagne	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Fribourg, Allemagne	E15-817
Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur	GIBCO, Bâle, Suisse	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Iéna, Allemagne		Comme cette formulation liposomale est issue de la R& D aucun numéro de catalogue n’est disponible pour le moment. Bouillon : 1,5 mg/ml ; fourni dans un mélange 9:1 de dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) et de dipalmitoylphosphatidylglycérol (DPPG ; pureté >99 %)
Spectramax Gemini XS lecteur de plaques	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Allemagne
Ceralas PDT 652 nm Laser	biolitec AG, Jena, Allemagne	LD652nm2W400u
Réactif de tétrazolium soluble dans l’eau (WST)	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suisse	1644807