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Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans

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DOI :

10.3791/51231

⸱

11 mars 2014

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

Dans cet article

Résumé

Un protocole est décrit qui utilise anoxie / famine dans C. elegans pour modéliser l'ischémie / reperfusion. Les résultats fonctionnels incluent une mortalité accrue, des anomalies visibles dans les processus neuronaux GFP-étiquetée, et les réponses comportementales douteux qui nécessitent la fonction neuronale.

Résumé

Protocoles pour anoxie / famine dans le modèle génétique organisme C. elegans simuler une ischémie / reperfusion. Worms sont séparés de l'alimentation bactérienne et placées sous anoxie pendant 20 heures (ischémie simulée), et ensuite déplacés dans une atmosphère normale avec des aliments (par reperfusion simulée). Cette expérimentales résultats de paradigme dans augmentation de la mort et des lésions neuronales et techniques sont présentées pour évaluer la viabilité organisme, altérations de la morphologie des processus contact des neurones, ainsi que la sensibilité tactile, ce qui représente la sortie de comportement de la fonction neuronale. Enfin, une méthode pour construire des pépinières d'hypoxiques en utilisant des conteneurs de stockage de cuisine commune est décrite. L'addition d'une unité de commande de débit massique permet des modifications à apporter au mélange gazeux dans les incubateurs de mesure, et d'un bain à circulation d'eau permet à la fois pour le contrôle de la température et il est facile d'identifier les fuites. Cette méthode offre une alternative à faible coût pour commercialementunités disponibles.

Introduction

C. elegans est un nématode qui a été largement adopté comme un modèle eucaryote organisme multicellulaire depuis son introduction par Brenner 1. Il s'agit d'un modèle simple, pas cher et polyvalent, qui permet un accès facile entre les altérations génétiques et phénotypique change 2.

L'ischémie est caractérisé par un manque de nutriments et de l'apport d'oxygène à un tissu, suivie d'une reperfusion, quand une salve d'espèces réactives de l'oxygène est produit 3 et la plupart des dommages se produisent. En 2002, un modèle d'ischémie / reperfusion (IR) en C. elegans a été développé 4 impliquant soumettre l'ensemble ver à l'anoxie, une carence en nutriments et le stress de la chaleur pendant environ 20 heures puis de 24 heures dans des conditions normales. Bien que ce modèle est techniquement une anoxie-famine (AS) l'état, la mort cellulaire se produit par des mécanismes qui sont conservés chez les mammifères, y compris les dommages induits par les oxydants pendant la reperfusion 5. En outre, même à des mammifères IR, dommages induits par les AS en C. elegans peuvent être évités par le préconditionnement ischémique 6,7 ou préconditionnement anesthésique 8,9.

Les protocoles ci-dessous montrent comment imiter IR en C. elegans en utilisant le modèle AS, comment marquer des anomalies morphologiques et comportementaux qui résultent de l'AS, et comment adapter le protocole d'une manière qui permet l'expérience d'être réalisée avec un investissement initial inférieur en utilisant un, facilement construit alternative chambre sur mesure .

Protocole

Une. C. elegans croissance

  1. Préparer 35 mm nématode croissance médias (NGM) des plaques de gélose ensemencées avec des bactéries OP50, que par les méthodes de culture standards 1.
  2. Synchroniser C. elegans en plaçant 6 adultes gravides sur une plaque NGM graines. Retirez les adultes après ~ 100 œufs ont été pondus (~ h de 3).
  3. Incuber les plaques pendant 3 jours à 20 ° C, à quel point les vers se sont développées en stade jeune adulte et sont optimales pour cette expérience. Des protocoles alternatifs pour synchroniser C. elegans sont décrits ailleurs 10.

2. Matériaux pour AS

  1. Tampon M9 (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM de NaCl, 1 mM de MgSO 4) doit être purgé de l'oxygène par équilibrage avec du N2 (argon peut aussi être utilisé) pendant 30 min avant l'expérience et entretenu, entouré de glace.
  2. Faire un petit trou (3 mmde large) dans le couvercle de 1,5 ml microtubes dans lequel les vers seront placés durant AS. Le trou permet l'échange de gaz sans garder le couvercle ouvert, car cela peut conduire à l'évaporation excessive des médias.

3. Anoxie / famine

  1. Effectuer toutes les expériences au moins en triple exemplaire.
  2. Ajouter 1 ml de tampon de RT, M9 oxygénée à chaque plaque de 35 mm contenant jeunes vers adultes cultivés comme décrit ci-dessus. Soyez prudent pour éviter l'élimination des bactéries de la plaque (M9 ajouter aux bords où les bactéries ont été ensemencées pas). Après ~ 1 min les vers doivent être nagent dans le M9.
  3. Manteau un embout de pipette de 1 ml avec de la BSA par pipetage et à expulser une solution stérile de la BSA à 1%.
  4. Incliner délicatement la plaque contenant les vers dans un tampon M9, retirez le M9 de l'endroit même où il a été ajouté, et placer la suspension dans les microtubes préparés. Laisser reposer dans la glace jusqu'à ce que les vers ont chuté au fond des tubes (~ 1-2 Min).
  5. Retirez le maximum de M9 possible sans perturber les vers du tube (en laissant environ 100 pi), ajouter 1 ml de la M9 oxygène purgé et glacé et placer le tube sur la glace jusqu'à ce que les vers se déposent au fond de nouveau. Répétez la dernière étape 3x. Dans le dernier lavage, retirer le M9 jusqu'à ~ 100 pi reste dans le tube.
  6. Placer les tubes avec les vers dans désoxygéné M9 l'intérieur d'une chambre anoxique / hypoxique (voir les instructions ci-dessous, la section 3.6.1) ou, à défaut, dans un récipient scellé personnalisé (voir les instructions ci-dessous, la section 3.6.2).
    1. Si une chambre de anoxique / hypoxique commercial doit être utilisé, laissez un M9 purgé l'intérieur de la chambre avant l'étape 3.5 de départ et répétez l'étape 3.5 une fois que les vers sont dans la chambre.
    2. Si une chambre personnalisée doit être utilisé, une description détaillée de la façon de créer un appareil à faible coût est présenté à la fin de ce protocole et a été décrit par un autre groupe auparavant 11. En bref:
      1. Faites deux trous dans un couvercle de 250 ml contenant Tupperware-type et ajouter des connecteurs de tubes pour eux. L'un servira à injecter le mélange gazeux alors que l'autre sera la sortie de gaz dans un bain d'eau.
      2. Placer les vers dans la chambre et fermer la chambre à l'aide du couvercle.
      3. Gaz avec un flux constant de N2 (100 ml / min).
      4. Placer le récipient dans un bain-marie à 26 ° C. Assurez-vous que le tube de sortie est bien immergé dans l'eau donc pas de retour d'air et qu'il n'y a pas de fuites dans le système (apparente par des bulles provenant de la chambre elle-même).
  7. Incuber les vers à 26 ° C pendant 20 heures.

4. Reperfusion simulée

  1. Après 20 heures sous conditions, retirer les tubes de la chambre d'incubation dans l'air ambiant.
  2. Pipette C. elegans avec une pointe BSA enduit (comme dans l'étape 3.3) sur un OP50 ensemencé 35 mm de plaque NGM. Incuber les plaques à 20 ° C pendant 24 heures.Après cela, les vers seront prêts à être marqué.

5. Identifier les morts Versus vers vivants

  1. Avec une pointe de platine, toucher légèrement le dessus de la tête de la vis sans fin. Vers vivants se déplacent vers l'arrière après avoir été touché. Si les vers sont répondaient pas, marquer comme mort. De temps en temps, un ver ne sera pas revenir en arrière, mais peut présenter un léger mouvement de la tête d'un côté à côté. Bien que pas techniquement mort, ces vers sont presque certains d'expirer dans quelques heures, et devraient être marqués comme mort. Si l'on attend trop longtemps pour marquer les vers, l'éclosion interne de la descendance peut se produire et ces «sacs-de-vers" peut se rompre, ce qui rend la détection des carcasses très difficile.
  2. Retirez les deux vers vivants et morts de la plaque, ils sont pris pour éviter des comptes dupliqués. Les vers de terre vivants peuvent être déplacés vers une plaque séparée pour effectuer des essais de comportement. La quantité de vers vivants par rapport au total est représenté comme le% de vers survivants (figure 1A ).

6. Touchez Essai de réponse

  1. Une description détaillée de ce protocole a été présenté dans Hart, Anne C., ed. Comportement (Juillet 3, 2006), WormBook, éd. Le C. Communauté elegans recherche, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
    1. Pour marquer la réponse au toucher, identifier les vers qui se déplacent et appuyez légèrement sur ​​le côté de la tête de la vis sans fin (près de la partie centrale du pharynx) avec un pic à cil (figure 3).
    2. Si le ver se déplace vers l'arrière, marquer le plus sensible, si pas, marquer comme non (figure 1B). Répétez cette étape 10-15x pour chaque ver avec des intervalles de 10 sec. Sonder au moins 10 vers dans chaque groupe de disposer de données précises. La même analyse peut être utilisée pour évaluer les changements avant de locomotion suivante légère touche à la paroi postérieure du corps. Veillez à ne pas toucher la tête ou la queue du ver, car cela stimule un comportement distinct.
    3. Enfin,souches génétiques de contrôle des sociétés [de type sauvage N2 Bristol, mec (mécano) mutant positif pour le négatif - par exemple CB1338 mec-3 (e1338) IV] pour calibrer la force avec laquelle toucher les vers. Trop dur d'une stimulation seront obtenir une réponse comportementale chez les mutants de mec, trop peu ne sera pas obtenir un effet dans les contrôles N2 type sauvage.

7. Neuronale modifications

  1. Pour visualiser poste AS modifications neuronales, utiliser une souche qui exprime la GFP dans les neurones mec tactiles répondant 4,5. Ces neurones ont un long processus qui courent le long de la paroi du corps et sont facilement avantage des anomalies morphologiques. En outre, l'information morphologique peut être intégré avec les mesures comportementales de la fonction neuronale, tels que décrits ci-dessus. Une souche qui peut être utilisé à cette fin est TU2583, qui est disponible auprès de la C. elegans Centre de Génétique et contient le transgène intégré de uIs25 exprimant la GFP vientm le promoteur mec-18, ou en variante TU2562, qui contient un mec-3 :: GFP fusion intégré.
  2. Préparer un tampon d'agarose.
    1. Faire fondre 2% d'agarose dans l'eau, porter à 1x M9 avec un 10x stock, et maintenir la solution à 70 ° C.
    2. Déposer une goutte (~ 20 ul) de cette solution sur une lame de verre (25 mm x 75 mm) qui a été placé entre deux autres diapositives, chacun d'eux ayant un seul morceau de ruban adhésif sur leur côté inférieur.
    3. Placer une lame de verre finale perpendiculaire à la première au-dessus de la solution d'agarose à 2%, et le laisser refroidir à température ambiante. Cela devrait former un tampon qui est l'épaisseur de la bande.
    4. Retirer la lame supérieure et ajouter 10 ul de M9 contenant 0,1% tetramisole, qui immobiliser les vers.
  3. Déplacez une partie (~ 10) vers vivants sur la lame d'agarose à 2%. Placer une lamelle couvre-objet sur eux et de visualiser la GFP en utilisant un microscope à fluorescence sous un objectif 100X avec un éclairage approprié.
  4. Endommagéneurones vont montrer une chaîne cytosolique de la membrane de motif de perles dans les procédés, qui comprend punctum multiple (figure 2A), et / ou des anomalies où les procédés semblent être rompu (figure 2B). Comptez punctum et des anomalies dans les deux neurones pour chaque ver, en utilisant un total d'au moins 10 vers.

8. Lab-fait hypoxique Chambre

  1. Un style Tupperware, refermable, contenant hermétique pouvez rajouter comme une chambre anoxique. Prenez soin de sélectionner un conteneur qui est aussi petit que possible. Un petit récipient crée un environnement hypoxique plus rapide et plus facile à tenir dans le bain d'eau (figure 4).
  2. Faites deux trous sur le couvercle (qui peut être fait avec un tournevis ou en chauffant forceps et en forçant dans le couvercle) et insérer un connecteur en plastique ou en métal qui s'adapte le tube (figure 5A). Utilisez de la colle qui peut être placé sous l'eau, et obtient également dur après séchage, évitant mouvement dele connecteur et donc de réduire le risque de fuite (Figure 5B).
  3. Le récipient doit être placé dans le bain d'eau de sorte qu'elle soit complètement immergé (figure 4). Pour plonger le récipient, utiliser un poids de bouteille ou un poids de plongée.
  4. L'un des raccords de tubes seront utilisés pour introduire un mélange de gaz et l'autre tube agira comme un limiteur de pression, d'où il doit être laissé sous l'eau de sorte que le récipient est étanche par rapport à l'environnement extérieur (figure 4).
  5. La composition de l'air peut être modulée à l'aide de gaz fait sur commande, des régulateurs de débit de masse ou n'importe quel dispositif qui mélange les gaz souhaités. Le débit de gaz doit être contrôlée, comme à haut débit peut créer une évaporation excessive. Par exemple, dans un ml contenant 250, 100 ml / min de gaz fournira un bon espace pour les vers et un flux approprié.
  6. La longueur du tube doit être maintenue à un minimum, car ils peuvent être perméable au gaz, unllowing l'entrée de O 2. Il est important d'éviter d'utiliser du silicone, tubes Tygon que ces matériaux sont perméables aux échanges gazeux. Nous préférons des tubes en polypropylène ou en nylon. Verre ou tubes métalliques maintiennent les gaz bien, mais est aussi plus difficile de travailler avec.

Résultats

Soumettre C. elegans à 20 h de l'AS à 26 ° C dans une chambre d'incubation de laboratoire faits sur mesure comme décrit (section 3.6.2) a entraîné une mortalité significative (figure 1A) 5. L'imagerie de fluorescence suite de punctum et les pauses dans les GFP étiqueté processus neuronaux de survivants a confirmé la présence d'anomalies morphologiques (Figure 2). Les survivants ont également répondu mal à la lumière paroi du corps contact (figure 1B). Ce modèle a été utilisé par plusieurs groupes pour étudier la façon dont la prédisposition génétique, l'intervention pharmaceutique, et la plasticité métabolique affecte les résultats dépendant 4-6,8,9,12,13.

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Figure 1. C. elegans survie et touche réponse aprèsAS. A) Pourcentage de vers qui présentent 24 h post-AS survie. La souche N2 est le fond génétique de type sauvage, et KWN85 contient un transgène intégré qui marque les neurones mec avec la GFP. B) de réponse au toucher stimuli de la vie C. elegans (N2 Strain) après AS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Toucher modifications neuronales après AS. Neurone tactile (PLML et PLMR) anomalies telles que les processus et les pauses (A) ou l'accumulation des agrégats de la GFP dans les processus (B) tortueuses ont été suivis en survivant anesthésié C. eleg ans après AS.

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Figure 3. Choix des cils. Un choix de cil assemblé. Dans le médaillon, un détail du cil collé au bois de cure-dents.

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Figure 4. Lab-made chambre hypoxique à l'intérieur du bain d'eau. Récipient fermé prêt à commencer l'expérience. Les flèches indiquent l'entrée et la sortie de gaz et le poids de la bouteille utilisée pour l'empêcher de flotter.

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Figure 5. Les détails de la face interne et externe du couvercle de récipient. A) côté extérieur du couvercle du récipient, ce qui indique le tube et son connecteur attaché au trou préalablement réalisé. B) du côté externe du couvercle de récipient, indiquant le connecteur de tube fixé dans le trou préalablement réalisé.

Discussion

Comme il a été largement utilisé dans C. elegans pour modéliser blessure IR. Quelques points clés doivent être mis en évidence pour ce protocole: C. elegans sont résistants à un large éventail de blessures, ce qui justifie la nécessité pour 3 insultes concomitants (chaleur, la famine et l'anoxie) pour atteindre la mort en utilisant ce système. Anoxie seul ne tue pas les vers dans ce laps de temps 14. En outre, l'augmentation de température est un stress supplémentaire, il est donc important de surveiller de près. Strictement parlant, la famine ne contribue pas de manière significative le degré de mortalité observée 7, en soi, mais elle semble réduire la variabilité entre les différents récipients expérimentaux. Étant donné qu'il peut y avoir une grande variabilité de jour en jour, il est extrêmement important de comparer des échantillons testés directement en parallèle, et de répéter des expériences sur plusieurs jours. En général, les résultats sont mesurés pour trois plaques distinctes de 50-100 vers / condition expérimentale et ce sont lesn moyenne et considérée comme une seule répétition expérimentale. Généralement, entre sept et neuf répliques semblent être suffisantes pour atteindre ou exclure la signification statistique.

Le stade de développement des vers utilisés dans l'expérience doit également être soigneusement surveillée comme la sensibilité des différentes étapes de l'AS dommages varie considérablement 15,16. L'utilisation des jeunes adultes est la norme, et le stade larvaire (L3 et L4) vers semblent être plus résistants aux effets néfastes de l'AS (données non publiées).

Ce protocole présente deux façons d'effectuer les expériences, l'une utilisant un appareil de laboratoire réalisés (en utilisant des récipients de type Tupperware et entrée de gaz 11) et l'autre en utilisant une chambre hypoxique commerciale 4,6. Anoxie peut être obtenue par d'autres moyens qui consomment de l'oxygène, comme décrit par ailleurs 13,17. L'utilisation de techniques alternatives pour créer un environnement hypoxique peut changer le temps d'incubation nécessaire ASpour créer la quantité désirée de la mort. Ciblage ~ 20% de survie est un point de départ idéal pour étudier les interventions de protection, tandis que 80% est tout aussi idéal pour les interventions qui aggravent les effets néfastes de l'AS. Une autre mise en garde importante est l'heure à laquelle les scores d'observation morts / vivants vers. Si le temps de l'analyse est prolongée au-delà de 24 heures, les données peuvent être trompeuses car les vers morts deviennent de plus en plus difficiles à identifier. Cela peut être dû à des carcasses de ver devenir relativement transparent au fil du temps, mais aussi au fait que les embryons fécondés peuvent se développer dans la descendance post-mortem à l'intérieur des carcasses et perturber eux comme ils émergent.

L'analyse de la morphologie neuronale peut être modifié pour examiner des profils d'expression de protéines de 18, 4 fragmentation nucléaire et d'autres paramètres 19 de par son remplacement par une souche de vis sans fin qui exprime le marqueur génétiquement codé approprié. Une mise en garde finale est que la visualisation de l'processus neuronaux doivent être effectués moins de 30 minutes après le placement des vers sur la diapositive. Les animaux gardés sous anesthésie sur des lames pour des périodes plus longues peuvent présenter des dommages AS-indépendante. Ajustez la quantité d'animaux par diapositive selon le temps nécessaire pour suivre et analyser.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les figures 1 et 2 ont déjà été publiés en biologie et médecine (Queliconi et al. 5) Free Radical et avoir le droit d'auteur détenus par Elsevier. Ce travail a été soutenu par le Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), l'Instituto Nacional de Tecnologia e Ciência de Processos Redox lui Biomedicina, Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox lui Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), et USPHS GM087483 (KN ). BBQ est un étudiant au doctorat soutenue par une bourse FAPESP.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
N2  ; soucheCGCde type sauvage.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

TU2583 uIs25 (Pmec-18 ::GFP)CGCTU2583transgène fluorescent intégré utilisé pour marquer les neurones tactiles.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

CB1338 mec-3 (e1338)IVCGCCB1338mutant canonique mec-3 qui est insensible au toucher.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

Tube de microcentrifugationEppendorf0030 120.086
Microscope Nikon Eclipse TE2000-U  ;Nikon USATE2000-U
Sheldon Manufacturing Inc.Modèle 2005
Pic à cils Un cure-cilspeut être préparé en fixant un cil sur un cure-dent en bois, puis en fixant le cure-dent dans une pipette Pasteur en verre (Figure 3).
Chambre hypoxiqueCoy8307030Boîte à gants hypoxique équipée d’un catalyseur au paladium et d’un contrôleur CO2.
Incubateur basse température

Références

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