Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Un modèle murin de la moelle épinière cervicale blessures à étude post-lésionnelle respiratoire neuroplasticité

13K vues

⸱

DOI :

10.3791/51235

⸱

28 mai 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1UFR des sciences de la santé - Simone Veil, Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines, 2Service de Physiologie - Explorations fonctionnelles, Hôpital Ambroise Paré, 3Services de Physiologie, Explorations Fonctionnelles, Réanimation Médicale et Centre d'Investigation Clinique et d'Innovation Technologique (Unité Inserm 805), Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines

Dans cet article

Résumé

L'insuffisance respiratoire est la principale cause de décès suite à une blessure de la moelle épinière cervicale. Avoir un modèle animal pré-clinique reproductible, quantifiable et fiable de l'insuffisance respiratoire provoquée par une blessure cervicale partielle aidera à comprendre la neuroplasticité respiratoire et non respiratoire ultérieure et permettra de tester des stratégies de réparation putatifs.

Résumé

Une lésion de la moelle épinière cervicale induit une paralysie permanente, et conduit souvent à une détresse respiratoire. À ce jour, aucun thérapeutiques efficaces ont été développées pour améliorer / améliorer l'insuffisance respiratoire suite à une blessure cervicale haute de la moelle épinière (SCI). Ici, nous proposons un modèle pré-clinique murin de haute SCI au col de l'utérus 2 (C2) niveau métamérique à étudier divers neuroplasticité respiratoire post-lésionnelle. La technique consiste en une lésion chirurgicale partielle au niveau de C2, qui va induire une hémiparalysie de la membrane due à une désafférentation des motoneurones phréniques des centres respiratoires situés dans le tronc cérébral. Le côté opposé de la blessure reste intacte et permet la récupération des animaux. Contrairement à d'autres SIC qui affectent la fonction locomotrice (au niveau thoracique et lombaire), la fonction respiratoire ne nécessite pas la motivation de l'animal et la quantification du déficit / récupération peut être facilement réalisée (diaphragme et l'enregistrement du nerf phréniques, la ventilation du corps entier). Ce modèle C2 SCI pré-clinique est un modèle pré-clinique puissant, utile et fiable pour étudier divers événements de neuroplasticité respiratoires et non respiratoires à différents niveaux (moléculaires à la physiologie) et de tester différentes stratégies thérapeutiques putatifs qui pourrait améliorer la respiration en patients blessés médullaires.

Introduction

Traumatisme de la moelle épinière est une blessure courante observée dans la population humaine avec des incidences dramatiques, comme une paralysie permanente. Cependant, la gravité de la blessure est fonction du niveau et de l'étendue du traumatisme initial. L'insuffisance respiratoire est la principale cause de mortalité à la suite du col des blessures de la moelle épinière supérieure (SCI) 1. Actuellement, le seul traitement thérapeutique consiste à placer le patient sous assistance ventilatoire. Depuis quelques patients peuvent être sevrés de l'assistance ventilatoire 2, en raison de la récupération spontanée qui se produit avec un retard post-lésionnelle, la nécessité de développer de nouvelles thérapies non invasives novatrices est urgent 3. Avoir un bon modèle pré-clinique normalisée pour étudier l'effet d'une SCI col de l'utérus sur l'insuffisance respiratoire et donc d'étudier l'application de stratégies thérapeutiques putatifs, est essentiel.

Dans cet article technique, nous décrivons un modèle pré-clinique de murin spécifique of insuffisance respiratoire induite par une SCI partielle du col au niveau de C2. Ce modèle est actuellement utilisé par plusieurs laboratoires dans le monde (pour avis: 4-13). Cependant, de légères différences dans la procédure chirurgicale peuvent être observées entre les différents enquêteurs pour générer ce modèle murin de lésion cervicale particulier. L'effet d'une SCI C2 sur le débit respiratoire a été décrite pour la première en 1895 par Porter 14. Une hémi col de l'utérus induit une désafférentation des motoneurones phréniques de leur entraînement central (situé dans le rVRG dans le tronc cérébral, la figure 1A) sur le côté ipsilatéral de blessures, conduisant à une activité du nerf phrénique silence et la paralysie du diaphragme ultérieure. Le côté opposé reste intact et permet à l'animal de survivre. Contrairement différent SCI situé dans un segment vertébral inférieur (par exemple une blessure contusive au niveau de C4 15), l'intégrité du noyau du motoneurone phrénique sur les deux côtés est préservée. Après une cervblessures C2 ical, une activité spontanée peut être observée sur le côté ipsilatéral (phrénique et le diaphragme) en raison d'une activation de contralatérales voies synaptiques silencieuses qui ont traversé la ligne médiane de la moelle au niveau segmentaire C3-C6 (Les voies phrénique croisés, RPC, figure 1B) . L'activation de la RPC, qui est, par définition, un hemisection C2 combiné avec un phrenicotomy controlatéral qui induisent une reprise ipsilatérale du nerf phrénique partielle, peut se produire de plusieurs heures à plusieurs semaines après la lésion 16-18. L'effet bénéfique réel de cette voie RPC sur la reprise respiratoire est limitée 19 et une enquête plus approfondie et le traitement doit être développé pour améliorer l'ampleur de la restauration spontanée 3.

Ce protocole fournit un type puissant modèle murin pré-clinique pour étudier respiratoire plasticité post-lésionnelle à différents niveaux (physiologie respiratoire de motoneurones pré et phrénique, interneurones, moléculaire et cellular, la locomotion de l'aile avant, par exemple) ainsi que d'un modèle pour tester des stratégies thérapeutiques invasives et non-invasives visant à améliorer les voies respiratoires et la récupération locomotrice après une lésion cervicale C2 partielle de la moelle épinière.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le comité d'éthique de la chaise RBUCE-UP d'excellence (Université de Paris Sud, accord de subvention n ° 246556) et l'Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines.

1. Préparation des instruments chirurgicaux stérilisés

  1. Nettoyer les instruments chirurgicaux avec détergent de laboratoire.
  2. Autoclave les instruments avant la chirurgie.
  3. Dans une session chirurgicale, stériliser les outils en plaçant les pointes dans un stérilisateur à billes à chaud pendant 10 minutes à 180 ° C entre deux interventions chirurgicales.

2. Préparation des médicaments

  1. Préparer 2 x 1 ml seringues pour les médicaments pré-anesthésique cocktail et post-opératoires médicaments.
  2. Selon le poids du rat, préparer une seringue à médicaments pré-anesthésique: Carprofen (5 mg / kg), la buprénorphine (50 ug / kg), Baytril (5 mg / kg) et de dexmédétomidine (0,5 mg / kg). Compléter le volume à 1 ml avec Ringer lactate.
  3. Préparez à l'une autre seringue pour l'inversion des médicaments pré-anesthésique: atipamézole (500 ug / kg).

3. Anesthésie du Rat

  1. Administrer par voie sous cutanée à l'animal la solution de médicaments pré-anesthésiques décrites à l'étape 2.2. Ensuite, mettez le dos de l'animal en cage et attendre jusqu'à ce que l'effet sédatif apparaît.
  2. Placez le rat dans une chambre fermée remplie de 5% d'isoflurane dans 100% O 2, et attendre jusqu'à ce que le rythme respiratoire ralentit (environ 30 secondes). Ensuite, retirez le rat de la chambre et le placer sur la table de l'intubation.

4. Orotrachéale intubation

  1. Allongez l'animal sur son dos, puis fixer la tête en plaçant une sangle attachée à ses dents de devant à la table.
  2. Avec une lumière de fibre optique, la lumière l'espace thoracique. Ensuite, placez un laryngoscope (ou une coutume fait un, Jou et al. 20 pour plus de détails) dans la bouche de l'animal. Visualiser les cordes vocales.
  3. Glissée et placer un guide orotrachéal dans la trachée (entre les cordes vocales). Faites glisser le tube orotrachéal (16 G de taille de cathéter) sur le guide.
  4. Retirer le guide et vérifier avec un miroir laryngé placé à l'extrémité du tube oro-trachéale pour la présence d'humidité, ce qui confirme la position appropriée du tube dans la trachée et non dans l'œsophage.
  5. Connectez le tuyau à un ventilateur de rongeur (683 rongeur ventilateur, Harvard Apparatus) et ajuster la concentration d'isoflurane à 2% (100% O 2).
  6. Fixer le tube orotrachéal avec du ruban adhésif chirurgical.

5. Chirurgie rachidienne

  1. Placer l'animal en décubitus ventral sur une plaque chauffée chirurgical, avec le nez pointant à un angle de 90 ° pour le chirurgien. Maintenir la température du corps d'environ 37,5 ° C pendant toute la chirurgie.
  2. Raser les cheveux avec une tondeuse entre les omoplates et enlever les poils avec de la gaze.
  3. Nettoyer la peau avec de la bétadine, puis avec 70% d'alcool. Répétez cette étape 3x.
  4. Une pincée de pointe est effectuée avant début de la chirurgie pour assurer une profondeur d'anesthésie adéquate.   Ensuite, effectuer une incision de la peau rostro-caudale latérale avec des ciseaux entre les omoplates.
  5. Couper le acromiotrapezius muscle rostro-caudale en suivant le tendon d'éviter tout saignement. Puis dissocier le muscle rhomboïde pour accéder aux muscles de SpinaliS (autour de la vertèbre).
  6. Rétracter le muscle épineux de C1 à C3 vertèbre. La vertèbre C2 est l'une d'une apophyse proéminent.
  7. Nettoyez le muscle autour de la partie dorsale de la vertèbre en utilisant des cotons-tiges stériles.
  8. Commencer à retirer soigneusement l'apophyse de C2 avec un rongeur. Ensuite, continuer méticuleusement jusqu'à la moelle épinière dorsale est exposé. Assurez-vous que la laminectomie est une laminectomie dorsale hémi. Prêtez une attention particulière à la dure qui entoure la moelle épinière, et les artères à proximité de cette zone.
  9. Avec # 55 pince, disséquer rostro-caudale la dure long C2, à côté de continuer latéralement de chaque côté rostral et caudal.
  10. Éponger le liquide céphalo-rachidien.
  11. Faire une coupe latérale sous la dorsale cervicale nombre de racines 2 avec les microciseaux. Vérifier avec un micro scalpel que l'étendue de la lésion est suffisamment proche pour atteindre la ligne médiane de la moelle épinière (voir la figure 2A pour une vue dorsale de la blessure). Si non, alors une autre coupe pourrait être faite pour compléter la blessure. En cas de saignement, utiliser des cotons-tiges stériles. Attention de ne pas aller du côté opposé, sinon, l'animal ne sera pas récupérer de la blessure et aura une insuffisance respiratoire.
  12. Suturer les muscles comme une couche protectrice et suturer la peau. Nettoyer la plaie avec de la gaze stérile Betadine saturé.
  13. Tournez-off le vaporisateur isoflurane et injecter les médicaments d'inversion (Atipamézole [500 ug / kg, im]), vérifier la température du corps.
  14. Quand l'animal commence à respirer contre le ventilateur,débrancher le tube trachéal du ventilateur, puis retirez le tube orotrachéal. Placez l'animal dans une cage chauffée pour la récupération.

6. Soins post-opératoire

Après la chirurgie, les animaux sont surveillés en permanence pour assurer le meilleur environnement possible pour la récupération. Antibiotiques (Baytril, 5 mg / kg), anti-inflammatoire (Carprofen, 5 mg / kg) et la buprénorphine (50 ug / kg) médicaments sont donnés toutes les 12 h pour les 2 premiers jours post-opératoires pour prévenir les infections et réduire l'apparition de la douleur post-opératoire. Les rats ont accès ad libitum à la nourriture et de l'eau douce (ou de l'eau gélifiée pour le 1er jour post-opératoire). Fluides sous-cutanés peuvent être utilisés pour prévenir la déshydratation sur les premiers jours post-opératoires. Le poids corporel et la consommation de nourriture sont contrôlés tous les jours. Leur environnement est enrichi tout au long de l'expérience et du temps post-traumatique (double logement, des tubes dans leurs cages).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Ampleur de la blessure

Le succès et la reproductibilité de ce modèle expérimental particulier dépendent de l'expérience de chaque manipulateur / chirurgien. La quantité suivante de récupération respiratoire (activité du nerf phrénique et le diaphragme d'activité) à la suite d'une blessure de C2 est en corrélation avec le restant ventrolatérale épargné substance blanche 21. Depuis la blessure est "fait main" et nécessite une certaine pratique ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les difficultés techniques de Faire la blessure modèle C2

Le modèle murin de blessures C2 est un outil intéressant pour étudier la plasticité synaptique respiratoire post-lésionnelle. Cependant, les étapes nécessaires pour produire un modèle reproductible et fiable sont nombreux et chacun pourraient avoir une incidence sur les résultats de l'étude. Par exemple, au cours du processus d'intubation, un soin extrême doit être pris puisque le tube orotrachéal peut produir...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Ce travail est soutenu par un financement du programme de l'Union européenne septième cadre (FP7/2007-2013) sous convention de subvention n ° 246556 (projet RBUCE-UP européenne), HandiMedEx attribué par l'Office d'investissement public français. Marcel Bonay a été soutenue par la Chancellerie des Universités de Paris (Legs Poix), le Fonds de Dotation Recherche en Santé Respiratoire, et le Centre d'Assistance Respiratoire à Domicile d'Île de France (CARDIF)

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Animal
Male Sprague Dawley RatJanvier225-250 g
Surgical Instruments
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tool91150-20
Student Standard Pattern ForcepsFine Science Tool91100-12
Mayo-Stille CiseauxFine Science Tool14013-15
Curved Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tool91500-09Ciseaux à
ressort droits - Lames de 8 mmFine Science Tool15025-10Straight Blunt/Blunt
Friedman Pearson RongeurFine Science Tool16121-14
Couteau de dissection incurvé - Fine TipFine Science Tool10055-12
Porte-aiguille droit Olsen-HegarOutil de science fine12002-14
Écarteur Weitlaner-Locktitedentelé Outil de science fine17012-112x3
Blunt Suture résorbableCentravetBYO001Taille de suture 4-0
Équipement
Stérilisateur à billes chaudes FineScience Outil18000-45
Cathéter  ;CentravetCAT18816 G
Laryngoscope
Fil
Miroir laryngéCentravetMIR011
Sonneurs lactiquesCentravetRIN020
SeringueCentravet
AiguilleCentravet
O2Air LiquidI1001M20R2A001
683 Ventilateur Rongeurs 115/230VHarvard Apparatus55-0000
Vaporisateur autonomeWPIEZ-155
Lit chauffant à ligne minceWPIEZ-211
Cartouche d’airWPIEZ-258
Drugs
CarprofèneCentravet
RimadylCentravetRIM011
BuprénorphineCentravetBUP001
BaytrilCentravetBAY001
DexmédétomidineCentravetDEX010
AtipamezoleCentravetANT201
Bétadine solutionCentravetVET002
IsofluraneCentravetVET066
de guidage

Références

  1. Frankel, H. L., et al. Long-term survival in spinal cord injury: a fifty year investigation. Spinal Cord. 36, 266-274 (1998).
  2. Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38, 449-472 (2000).
  3. Zimmer, M. B., Nantwi, K., Goshgarian, H. G. Effect of spinal cord injury on the respiratory system: basic research and current clinical treatment options. J Spinal Cord Med. 30, 319-330 (2007).
  4. Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Neuromuscular adaptations to respiratory muscle inactivity. Respir Physiol Neurobiol. 169, 133-140 (2009).
  5. Goshgarian, H. G. The crossed phrenic phenomenon and recovery of function following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 85-93 (2009).
  6. Nantwi, K. D. Recovery of respiratory activity after C2 hemisection (C2HS): involvement of adenosinergic mechanisms. Respir Physiol Neurobiol. 169, 102-114 (2009).
  7. Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
  8. Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D., Reier, P. J. Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 123-132 (2009).
  9. Seeds, N. W., Akison, L., Minor, K. Role of plasminogen activator in spinal cord remodeling after spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 141-149 (2009).
  10. Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
  11. Vinit, S. Cervical spinal cord injuries and respiratory insufficiency: a revolutionary treatment. Med Sci (Paris. 28, 33-36 (2012).
  12. Kastner, A., Gauthier, P. Are rodents an appropriate pre-clinical model for treating spinal cord injury? Examples from the respiratory system). Exp Neurol. 213, 249-256 (2008).
  13. Vinit, S., Lovett-Barr, M. R., Mitchell, G. S. Intermittent hypoxia induces functional recovery following cervical spinal injury. Physiol Neurobiol. 169, 210-217 (2009).
  14. Porter, W. T. The Path of the Respiratory Impulse from the Bulb to the Phrenic Nuclei. J Physiol. 17, 455-485 Forthcoming.
  15. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
  16. Goshgarian, H. G. The crossed phrenic phenomenon: a model for plasticity in the respiratory pathways following spinal cord injury. J Appl Physiol. 94, 795-810 (2003).
  17. Vinit, S., Gauthier, P., Stamegna, J. C., Kastner, A. High cervical lateral spinal cord injury results in long-term ipsilateral hemidiaphragm paralysis. J Neurotrauma. 23, 1137-1146 (2006).
  18. Fuller, D. D., Johnson, S. M., Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Chronic cervical spinal sensory denervation reveals ineffective spinal pathways to phrenic motoneurons in the rat. Neurosci Lett. 323, 25-28 (2002).
  19. Dougherty, B. J., Lee, K. Z., Lane, M. A., Reier, P. J., Fuller, D. D. Contribution of the spontaneous crossed-phrenic phenomenon to inspiratory tidal volume in spontaneously breathing rats. J Appl Physiol. 112, 96-105 (2012).
  20. Jou, I. M., et al. Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge. J Appl Physiol. 89, 1766-1770 (2000).
  21. Fuller, D. D., et al. Graded unilateral cervical spinal cord injury and respiratory motor recovery. Respir Physiol Neurobiol. 165, 245-253 (2009).
  22. Vinit, S., Windelborn, J. A., Mitchell, G. S. Lipopolysaccharide attenuates phrenic long-term facilitation following acute intermittent hypoxia. Respir Physiol Neurobiol. 176, 130-135 (2011).
  23. Ahmad, F., Wang, M. Y., Levi, A. D. Hypothermia for Acute Spinal Cord Injury-A Review. World Neurosurg. , (2013).
  24. Lovett-Barr, M. R., et al. Repetitive intermittent hypoxia induces respiratory and somatic motor recovery after chronic cervical spinal injury. J Neurosci. 32, 3591-3600 (2012).
  25. Minor, K. H., Akison, L. K., Goshgarian, H. G., Seeds, N. W. Spinal cord injury-induced plasticity in the mouse--the crossed phrenic phenomenon. Exp Neurol. 200, 486-495 (2006).
  26. Baussart, B., Stamegna, J. C., Polentes, J., Tadie, M., Gauthier, P. A new model of upper cervical spinal contusion inducing a persistent unilateral diaphragmatic deficit in the adult rat. Neurobiol Dis. 22, 562-574 (2006).
  27. Golder, F. J., et al. Breathing patterns after mid-cervical spinal contusion in rats. Exp Neurol. 231, 97-103 (2011).
  28. Lane, M. A., et al. Respiratory function following bilateral mid-cervical contusion injury in the adult rat. Exp Neurol. 235, 197-210 (2012).
  29. Vinit, S., et al. Axotomized bulbospinal neurons express c-Jun after cervical spinal cord injury. Neuroreport. 16, 1535-1539 (2005).
  30. Guenther, C. H., Windelborn, J. A., Tubon, T. C., Yin, J. C., Mitchell, G. S. Increased atypical PKC expression and activity in the phrenic motor nucleus following cervical spinal injury. Exp Neurol. 234, 513-520 (2012).
  31. Mantilla, C. B., Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Motoneuron BDNF/TrkB signaling enhances functional recovery after cervical spinal cord injury. Exp Neurol. 247, 101-109 (2013).
  32. Vinit, S., Darlot, F., Aoulaiche, H., Boulenguez, P., Kastner, A. Distinct expression of c-Jun and HSP27 in axotomized and spared bulbospinal neurons after cervical spinal cord injury. J Mol Neurosci. 45, 119-133 (2011).
  33. Windelborn, J. A., Mitchell, G. S. Glial activation in the spinal ventral horn caudal to cervical injury. Respir Physiol Neurobiol. 180, 61-68 (2012).
  34. Vinit, S., Stamegna, J. C., Boulenguez, P., Gauthier, P., Kastner, A. Restorative respiratory pathways after partial cervical spinal cord injury: role of ipsilateral phrenic afferents. Eur J Neurosci. 25, 3551-3560 (2007).
  35. Dougherty, B. J., et al. Recovery of inspiratory intercostal muscle activity following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 183, 186-192 (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Activit du nerf phr niqueh miparalysie du diaphragmel sion de la vert bre C2h milaminectomie chirurgicaleutilisation d un ventilateur pour rongeurstechniques histologiquesenregistrements neuromusculairesvoie phr nique crois e
Un modèle murin de la moelle épinière cervicale blessures à étude post-lésionnelle respiratoire neuroplasticité
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.