Pliant et caractérisation d'un Robot Bio-sensible de l'ADN Origami

Résumé

L’origami d’ADN est une méthode puissante pour fabriquer des objets précis à l’échelle nanométrique en programmant l’auto-assemblage de molécules d’ADN. Nous décrivons ici un protocole pour le pliage d’un robot bio-réactif à partir d’origami d’ADN, sa purification et sa coloration négative pour l’imagerie au microscope électronique à transmission (MET).

Résumé

Le nanorobot d'ADN est un dispositif nanométrique hexagonale creuse, destinée à ouvrir en réponse à des stimuli spécifiques et des marchandises présente séquestrés à l'intérieur. Les deux stimuli et des marchandises peuvent être adaptés en fonction des besoins spécifiques. Ici, nous décrivons le protocole de fabrication ADN nanorobot, avec l'utilisation de la technique de l'ADN origami. La procédure lance en mélangeant courts agrafes d'ADN simple brin dans un mélange d'actions qui est ensuite ajouté à une longue, circulaire, simple brin d'ADN échafaudage en présence d'un tampon de pliage. Un cycleur thermique standard est programmé de manière à abaisser progressivement la température de réaction de mélange pour faciliter le recuit agrafes-à-échafaudage, qui est la force motrice derrière le pliage de la nanorobot. Une fois que la réaction de pliage 60 h est terminée, les agrafes en excès sont éliminées en utilisant un filtre centrifuge, suivie par la visualisation par l'intermédiaire d'une électrophorèse sur gel d'agarose (AGE). Enfin, la fabrication réussie de la nanorobot est vérifiée par microscopie électronique à transmission (TEM),avec l'utilisation d'uranyle-formate comme coloration négative.

Introduction

Les utilisations pour les acides nucléiques nanotechnologies sont étonnants. La traçabilité de l'appariement de bases de Watson-Crick ainsi que la facilité et à faible coût relatif de la synthèse à grande échelle d'oligos-mesure ² a généré une explosion des applications ³ et la recherche dans le domaine de la nanotechnologie de l'ADN. Nanotechnologie d'ADN structurale, sur la base de la jonction ^4,5 Seeman immobile comme un bloc de construction fondamental se sert de l'ADN en tant qu'unité primaire auto-assemblage pour la construction de formes arbitraires ^6-8.

Le développement récent de l'ADN origami échafaudage ⁹ technique permet la construction de 2D / 3D nano-architectures complexes ^10-12 avec une précision sub-nanométrique et est une voie efficace pour la construction de nouveaux objets fonctionnels avec l'augmentation de la complexité et de la diversité étonnante. Le processus de construction est basée sur un ADN simple brin long échafaudage, généralement dérivé d'un génome virale, qui peut être pliée par l'hybridation de centaines de courts oligonucleotides d'ADN simple brin appelé agrafes. La résolution structurel élevé obtenu par cette technique est le résultat direct des dimensions naturelles de la double hélice d'ADN, tandis que la reproductibilité de la fabrication est le résultat d'adapter les courtes séquences de base simple brin pour faciliter la liaison hydrogène complémentarité maximale réalisable. Avec l'utilisation d'un recuit lent de la température de rampe la plus faible d'énergie conçu, thermodynamiquement préféré nanostructure est atteinte avec des rendements élevés et de fidélité. La mise en œuvre facile des règles de conception de jonction dans un code informatique a permis le développement d'outils de CAO, tels que caDNAno ^13, qui simplifie extrêmement la tâche de concevoir de grandes structures complexes contenant des centaines de jonctions connectés.

Auparavant, nous avons décrit la conception d'un nanorobot d'ADN à l'aide de l'outil ^14,15 caDNAno. Ici, nous décrivons la fabrication etvisualisation, par microscopie électronique à transmission (MET), de l'nanorobot, un nanodispositif hexagonale creuse 3D, avec des dimensions de 35 x 35 x 50 nm ^3, conçu pour subir un changement conformationnel majeur en réponse à un stimuli prédéterminés et marchandises spécifiques présents, tels comme des protéines ou des oligonucléotides d'acide nucléique, piégé à l'intérieur. Bien que 12 stations de chargement sont disponibles à l'intérieur du châssis creux, le nombre réel de cargaison lié est différente de la taille de la cargaison. Molécules cargo vont de petites molécules d'ADN à des enzymes, des anticorps et des nanoparticules d'or 5-10 nm. Cargocan être soit uniforme ou hétérogène, de telle sorte que chaque nanorobot contient un mélange de molécules différentes. Détection est réalisée par deux double hélice conception de portes de verrouillage pour détecter protéines, acides nucléiques ou d'autres produits chimiques, basée soit sur ​​aptasensor ^16,17 ou ¹⁸ brin d'ADN déplacement technologies. Les développements récents dans les protocoles de sélection des aptamères ^19-21 permettent la conception de nanorobots répondreà une gamme de plus en plus des molécules et des types de cellules.

Des travaux antérieurs ont montré un nanorobot portant un anticorps spécifique, qui lors de la liaison à son antigène peut relayer soit un inhibiteur ou un signal prolifique à l'intérieur de types de cellules spécifiques dans une population de cellules mixtes ^15. Une caractéristique intéressante de ces nano est leur capacité à effectuer des tâches encore plus complexe et logique de commande avec l'introduction de différents sous-types de nanorobots dans une seule population. Récemment, nous avons démontré sous-types spécifiques de nanorobots spectacle soit comme des régulateurs positifs ou négatifs, de contrôler une population effecteur contenant une molécule cargo actif ^22.

Le protocole présenté ici décrit la fabrication, la purification et l'imagerie d'un nanorobot fermée, avec des séquences de sonde de aptamère qui se lient sélectivement au PDGF pour faciliter l'ouverture de la nanorobot ^15,22. Le procédé de fabrication décrit est similaire au nprocessus de fabrication de anorobot initialement représenté par Douglas et al. ¹⁵ avec des changements visant à réduire la durée globale du processus, tout en augmentant les taux de rendement et de purification.

Protocole

1. Préparation de Staples Piscine Mélange

1. Ordre lyophilisé ADN nanorobots agrafes sur des plaques à 96 puits énumérés dans le tableau 1 (voir Matériaux) et de normaliser à 10 nmol. Pour une description détaillée de la conception et l'architecture du nanorobot d'ADN voir Ben-Ishay et al., ^{14 et} Douglas et al. ^15).
2. Reconstituer chaque agrafe bien avec DNase / ultrapure exempte de RNases à une concentration de 100 um. Pour agrafes normalisées à 10 nmol, reconstituer avec 100 pi d'eau ultra-pure.
3. Piscine ensemble 20 pi de chaque agrafe à l'aide d'une pipette multicanaux et 55 ml de solution stérile bassin.
   Remarque: Comme la forme de nanorobot se compose de 254 brins de base (y compris de base, arêtes, poignées et des séquences guides, tableau 1), la concentration de chacun des agrafes dans la piscine des agrafes est 394 nM. Retrait des agrafes de la piscine de base, ou l'ajout de certains au vol différenteUMES, peut réduire considérablement le rendement, ou entraîner autrement dans les agrégats dépliées.

2. Préparation de Fabrication Réaction Mélange

1. Pour un mélange de réaction standard utiliser 40 pl de l'ADN simple brin M13mp18 du génome viral circulaire, correspondant à 4 pmol de l'ADN de l'échafaudage (solution 100 nM boursier, voir Matériaux). La concentration finale de échafaudage dans le mélange de fabrication est de 20 nM, volume final de 200 ul.
   1. Ajuster la quantité d'ADN de l'échafaudage en fonction des besoins spécifiques; cependant, maintenir la concentration finale de l'ADN de l'échafaudage dans le mélange de réaction à une 20 nM constante.
2. Ajouter agrafes à atteindre un échafaudage à ratio des agrafes de 1 à 10, respectivement. Pour une concentration de 20 nM d'ADN d'échafaudage, chacun de concentration finale de 254 agrafes est de 200 nM. Pour un volume de réaction de 200 ul finale, on ajoutera 102 pi du mélange de la piscine des agrafes (section 1.2).
   1. Ajouter séquences Porte spécifiques séparément THe mélange réactionnel pliage pour le moment. Ces oligos sont commandés séparément et nécessitent une purification par HPLC. Assurez-vous que oligos Porte sont présents dans un rapport de 1:10 à échafaud Porte de séquence, soit 200 nM de chaque oligo pour une concentration de 20 nM de l'échafaudage. Pour un pliage volume de réaction de 200 pi, 0,4 pi ajouter pour chacun des oligo quatre porte à une concentration stock 100 um.
3. Ajouter 10x TAE de stock tampon pour atteindre une concentration finale de TAE 1X (40 mM Tris-acétate, EDTA 1 mM). Pour un pliage volume de réaction de 200 pi, ajouter 20 pi de 10x TAE.
4. Ajouter 1 M MgCl ₂ à une concentration finale de 10 mM. Pour un pliage volume de réaction de 200 pi, ajouter 2 pi de 1 M _MgCl2.
5. Ajouter 36 ul de DNase / RNase eau ultra-pure à une connexion atteindre un volume final de 200 ul.
6. Vortex et 100 ul aliquote des échantillons dans des fioles de PCR.
   Remarque: Consultez la spécification de cycleur thermique en ce qui concerne les volumes de réaction maximale à utiliser.Réduire le volume pour répondre à ces limites ne va pas réduire les rendements obtenus. Les volumes de réaction au-dessus du maximum spécifié mettra en péril les rendements.

3. Température recuit Rampe de Fabrication Réaction

1. Programme cycleur thermique comme suit:
   1. Rampe 85 ° C à 60 ° C à une vitesse de 5 min / ° C.
   2. Rampe de 60 ° C à 4 ° C à une vitesse de 75 min / ° C.
   3. Tenir à 4 ° C indéfiniment.
2. Après la fabrication est terminée, stocker les échantillons à -20 ° C.

4. Suppression de Staples excédentaires

1. Ajouter 100 ul de mélange réactionnel de pliage à un filtre centrifuge 0,5 ml avec un MWCO de 100 kDa. Enregistrer un échantillon de 10 pi de nanorobots pré-purification pour une analyse ultérieure.
2. Centrifugeuse pendant 10 min à 9600 x g.
3. Ajouter 400 ul de tampon de pliage (1x TAE, 10 _mM de MgCl2).
4. Répétez les étapes 4.2 et 4.3 fois plus.
5. Centrifugeuse pendant 5 min à 9600 x g.
6. Récupérer le concentré en plaçant le filtre à l'envers dans un tube à centrifuger propre et essorage pendant 1 min à 9600 x g. Volumes finals peuvent varier en fonction du volume initial de mélange réactionnel de fabrication qui a été mis dans le filtre. Typiquement, un volume final 25-60 pi de l'échantillon de nanorobot concentré est obtenu.
7. Mesurer la concentration de l'ADN dans les échantillons par l'intermédiaire d'un spectrophotomètre à 260 nm. Utilisez poids moléculaire de 5,3 pg / pmol lors du calcul des concentrations molaires des échantillons de nanorobots.
   Remarque: Le coefficient d'extinction molaire pour ADNdb, 50 pg / OD _260, est suffisant pour la plupart des applications. 48 pg / OD ₂₆₀ prend en compte la thymine poly ssADN étend sur les bords des agrafes.

5. Agarose Gel d'électrophorèse Analyse des Plié Nanorobots

1. Préparation du 0,5 x TBE (45 mM de Tris-borate, 1 mM EDTA), gel d'agarose à 2% additionné de 10 _mM de MgCl2 (adapté de Ernesto Castro et al ^21.):
   1. Préparer tampon de TBE 0,5x en diluant 6,25 ml de 10x TBE tampon de stock en 118.75 ml de ddH ₂ O.
   2. Dissoudre 2,5 g d'agarose dans 125 ml de tampon TBE 0,5x de.
   3. Faire bouillir au micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous.
   4. Ajouter 1,25 ml de 1 M _de MgCl2 à une concentration finale de 10 mM.
   5. Ajouter 7 pi de 10 mg / ml de bromure d'éthidium.
   6. Attendez solution à refroidir légèrement et remplir le plateau de gel avant la solidification du gel d'agarose. Installez peigne désiré immédiatement.
   7. Préparer 1 L 0,5x TBE tampon fonctionnant par addition de 50 ml de 10x TBE du stock régulateur et 10 ml de 1 M MgCl _{2 à 940} ml de ddH ₂ O.
   8. Une fois que le gel est add solide exécutant tampon à l'appareil d'électrophorèse et le dispositif mis dans un bain de glace.
2. Charge 1 pg d'ADN total de la nanorobots pré-purification (étape 3.2), et après purification (étape 4.7), aux côtés d'un échafaudageÉchantillon d'ADN et un ADN marqueur, sur le gel de 1 kb. Un exemple est donné sur la figure 2. Volumes d'échantillons réels dépendent des concentrations obtenues après purification. Chacun des échantillons est chargé avec du tampon de chargement à un rapport de 1: 6 de volume final.
3. Réglez la source d'alimentation à 80 V et exécuter gel pendant 3 heures. Exécutez le gel dans un bain rempli de glace et d'eau. Nanorobots vont se dérouler et apparaissent comme un frottis si le gel d'agarose réchauffe pendant l'électrophorèse. Pendant électrophorèse ajouter de la glace supplémentaire pour garder appareil de chauffage.
4. Voir le gel sur une table UV (Figure 2).

6. coloration négative du nanorobot avec Uranyle-formate

1. Préparation de la solution mère d'uranyle-formate 2% (adapté de Castro et al ^23.):
   1. Peser 100 mg de poudre d'uranyle-formate dans un tube de 15 ml.
   2. Faire bouillir DNase / RNase eau ultra-pure gratuite pendant 3 min à De-oxygéner.
   3. Ajouter 5 ml d'eau chaude désoxygéné (~ 60 ° C)dans le tube de 15 ml contenant de la poudre d'uranyle-formate (de l'étape précédente). Bien fermer le couvercle, envelopper dans du papier d'aluminium et le vortex rigoureusement pendant 10 min (tube, fixez un vortex). Solution devrait apparaître trouble avec une couleur jaune.
   4. Solution à travers un filtre de 0,2 um seringue fi filtre. Solution doit devenir clair.
   5. Aliquoter 200 ul de la solution dans des tubes de microcentrifugation.
   6. Centrifugeuse à vitesse max pendant 5 min dans une centrifugeuse de paillasse à des échantillons de la piscine au fond du tube.
2. Chargement de l'échantillon à grille et coloration négative:
   1. Décongeler une aliquote de 200 pi de solution uranyle-formate 2% (préparé dans la section 6.1). Ajouter 10 pi de solution et le vortex NaOH 0,5 M rigoureusement pendant 3 min. Centrifugeuse à vitesse max pendant 5 minutes à l'aide d'une centrifugeuse de dessus de table.
   2. Pendant ce temps, la grille décharge luminescente en utilisant l'air ambiant à 0,2 mbar et 25 mA pendant 30 sec.
   3. Ajouter 15 pi de 2 nM échantillon de nanorobot après purification (sectisur 4,7) sur face supérieure de la grille (tenue avec une pince) et laisser absorber pendant 1 min. Utilisez du papier fi ltre pour drainer l'excès de liquide en plaçant la grille sur le dessus du papier filtre. Ne touchez pas la surface de la grille.
   4. Ajouter 10 ul de la formiate-uranyle à 2% (de l'étape 6.2.1) sur la face supérieure de la grille (tenue avec des pinces).
   5. Utiliser rapidement papier fi ltre pour drainer l'excès de liquide en plaçant la grille sur le dessus du papier filtre. Ne touchez pas la surface de la grille.
   6. Répétez les étapes 6.2.4 et 6.2.5.
   7. Ajouter 10 ul de la formiate-uranyle à 2% (de l'étape 6.2.1) sur la face supérieure de la grille (tenue avec des pinces). Laissez solution de coloration absorber pendant 30 sec.
   8. Utilisez du papier fi ltre pour drainer l'excès de liquide en plaçant la grille sur le dessus du papier filtre. Ne touchez pas la surface de la grille.
   9. Laissez sécher complètement la grille pendant au moins 30 min, face vers le haut sur un papier filtre, avant de l'injecter dans le TEM.

Résultats

Les résultats représentatifs sont présentés sur la figure 2A. Toutes les voies contiennent 1 pg d'ADN total, mesuré par spectrophotomètre _(DO260). Par rapport à la circulaire échafaudage d'ADN simple brin (Lane 2), nanorobots sont entravés dans le gel en raison de leur poids moléculaire élevé, le résultat d'agrafes hybridation à l'ADN de l'échafaudage (Lane 3. flèche rouge). La bande basse de poids moléculaire Lane 3 représente agrafes excédentaires qui ne se lient à l'ADN de...

Discussion

Nous avons décrit la fabrication, la purification, et la visualisation de la nanorobot d'ADN. À la suite de la fabrication du châssis hexagonal du dispositif, la fonction de la nanorobot est programmé avec la simple introduction de marchandises spécifique et brins de détection pour le robot qui trouvent facilement leur position désignée en raison de la liaison hydrogène complémentarité avec des sites d'accueil disponible simple brin ^{14 , 15,22.}

Le protocole de fabrication ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Eau distillée sans DNase/RNase	Gibco	10977
M13mp18 échafaudage ssDNA	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0,5 ml filtre centrifuge 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
Tampon TBE	Promega	V4251
Bromure d’éthidium 10  ; mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb Marqueur d’ADN	NEB	N3232S
Colorant de charge	NEB	B7021S
formiate d’uranyle	polysciences	24762
grilles TEM recouvertes de carbone  ;	Services scientifiques	EFCF400-Cu-50
Thermocycleur c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
Table UV Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai