Déclaration d'éthique
Toutes les expériences ont été menées en conformité avec les directives allemandes pour le soin et l'utilisation des animaux en science. Procédures ont été approuvées par un comité national d'éthique de l'Etat de Rhénanie du Nord-Westphalie, Allemagne.
Présentation du système
Opérant Chambre Test
La chambre opérant (Figure 1) mesure 34 cm x 34 cm x 50 cm. Trois touches translucides de réponse (4 cm x 4 cm, situé à environ 20 cm au-dessus du niveau du sol) sont encastrés dans le mur du fond de la chambre. Stimuli sont présentés à travers un écran plat LCD monté derrière les touches de réponse. Deux ampoules de 2 Watt situés dans les parois latérales assurent un éclairage faible. La chambre se trouve dans une cabine insonorisant pour masquer des sons parasites. Les haut-parleurs offrent un bruit blanc à tout moment. Alimentation (grain) est fournie par une trémie d'aliments situé en dessous de la centclé er. Matériel expérimental est contrôlé par code MATLAB écrite sur mesure 21. Les animaux sont surveillés en permanence au moyen d'un appareil photo numérique fixé à la paroi avant de la chambre.
Microdrive personnalisés construits
Microdrive abritant 16 fils électrodes sont fabriquées sur mesure dans notre laboratoire; la conception est basée sur le travail de Bilkey et collègues 22,23, et le lecteur est renvoyé à ces articles pour une description détaillée. Nous avons modifié leur conception afin de permettre à un plus grand nombre d'électrodes (16 au lieu de 8; 25 um fils de nichrome), et nous nous connectons les fils d'électrode par de la colle conductrice d'argent à la prise de headstage. En outre, nous utilisons la dorure des pointes d'électrodes pour réduire l'impédance et d'obtenir de meilleurs rapports signal sur bruit (appliquer -3 V pour ~ 3 sec; impédances devraient tomber à <100 kQ).
Une fois le microdrive est assemblé, les électrodes sont coupées à la longueur désirée, des conseils sont Laveried dans un bain à ultrasons (Tergazyme dans l'eau distillée) pendant 20 minutes et rincés autre 20 min dans de l'eau distillée. Plaqué or de pointes d'électrodes doit avoir lieu immédiatement avant l'implantation. Pour la terre, nous utilisons une électrode à boule d'argent placé au-dessus du cervelet latéral. Spécification des matériaux est fourni dans le tableau des matériaux qui accompagne cet article.
Une question importante lorsque vous travaillez avec des animaux se déplaçant librement est des artefacts de mouvement. Nous avons constaté que des artefacts de mouvement dans nos configurations sont largement dues à une impédance élevée) d'électrodes (> 500 kQ) et b) la fixation imparfaite des contacts entre le bouchon (implant) et la prise (headstage) alors que l'animal est en mouvement. Une variété de micro-connecteurs disponibles sur le marché ne fonctionne pas de manière satisfaisante pour l'enregistrement de se déplacer librement les oiseaux, parce que le contact mécanique entre mâle et femelle se détériore rapidement par des mouvements vigoureux des pigeons (tête-pompage, touche-à picorer). La meilleure liaison mécanique entre l'implant et headstage a été réalisée avec des ensembles de headplug de Ginder scientifique. Ces ensembles fiche-prise disposent de 18 contacts et sont solidement fixés les uns aux autres par une bague.
Configuration d'enregistrement électrophysiologique
La configuration de l'électrophysiologie comprend les éléments suivants: 1) un headstage sur mesure avec un gain unitaire (amplificateur opérationnel) 2) modules amplificateurs 15 différentiel logés dans deux unités montées sur baie (DPA-2FS et EPM-07, respectivement; NPI electronic GmbH, Allemagne ), 3) un 16-canal analogique-numérique (puissance 1401 marque I). Les signaux bruts sont amplifiés 1000 x et passe-bande filtrés (500-5000 Hz, 1 er filtre d'ordre), numérisé avec un taux de 16-20 kHz d'échantillonnage et stockés avec Spike2 version 7.06a pour le traitement hors ligne. L'heure des événements (tels que l'apparition de relance ou picore clés individuelles de l'animal) sont capturées via parallèle une boîte port IO laboratoire intégré (voir Rose; Et al 21) et transmis au convertisseur AD pour le stockage avec les données neurophysiologiques (voir la figure 1).. Le traitement hors ligne est décrite plus en détail ci-dessous.

Figure 1. Présentation du système. Des flux d'information est symbolisée par des flèches colorées. Ordinateur 1 commande de matériel se rapportant à la sortie comportementale (affichage de relance par le moniteur à écran plat, maison de la lumière, de la trémie de nourriture, la lumière d'alimentation, touches de réponse) et envoie horodatage de l'événement pour le convertisseur AD. Informatique 2 magasins signaux neurophysiologiques obtenues à partir du convertisseur A / D et horodatage des événements reçus de l'ordinateur 1. La photo de gauche montre la chambre de conditionnement à l'intérieur de la cabine de son atténuation. Ses éléments sont les suivants: 1) la coquille d'atténuation sonore, 2-4) clé de réponses, 5) trémie d'alimentation, 6) la lumière d'alimentation 7) maison de lumière, 8) caméra d'observation.
Unique Intervalle choix forcé (SIFC) Discrimination Groupe
Pour plus de clarté, nous allons décrire la tâche finale SIFC ici et ensuite expliquer les étapes nécessaires pour dresser des animaux sur cette tâche ci-dessous.
La tâche SIFC est décrit dans la figure 2. Après l'intervalle intertrial (ITI) est écoulé, la touche centrale est radiographié vert pour 5 sec («phase d'initialisation»). Immédiatement après la troisième réponse de l'animal dans les 5 secondes, une personne sur plusieurs stimuli de l'échantillon est présenté sur la touche centrale pendant 2 secondes ("phase de l'échantillon"; exemple stimuli sont présentés dans l'encart de la figure 2). Après 2 secondes, sur la touche centrale est de nouveau transilluminé vert, et l'animal doit répondre une fois de plus avant que les deux touches latérales sont transilluminé ("phase de confirmation»). En fonction de l'identité du stimulus montrédans la phase de l'échantillon, l'animal est nécessaire pour diriger une réponse unique soit à la la touche de droite («phase choix») gauche ou. Si elle choisit la bonne destination, accéder à récompenser (grain) est accordée pendant 2 secondes. Ainsi, le noyau de la tâche consiste à répondre à la touche de choix à gauche après présentation d'un stimulus particulier sur la touche centrale, et répondant à la touche de choix juste après la présentation d'un autre stimulus. La raison pour laquelle la phase d'échantillonnage est crocheté par une initialisation et une phase de confirmation consiste à maintenir la tête de l'animal en face de la touche centrale tandis que l'échantillon stimulus est présentée.
Une fois les maîtres d'animaux de cette tâche pour une seule paire de stimuli (ci-après, les stimuli «familier», FS), il est présenté avec un nouveau stimulus (NS) paire dans chaque nouvelle session, et doit apprendre lequel des deux nouveaux stimuli est être suivie d'une réponse à la la clé de choix gauche ou de droite. La paire de FS continue d'être présenté au cours èmeose expériences au service de l'état de commande approprié. Une performance adéquate sur la tâche finale dépend essentiellement de la volonté des animaux pour effectuer les essais> 1000 à probabilités globales de renforcement <0,5. Les paragraphes suivants décrivent un procédé de formation dans lequel la complexité de la tâche est graduellement augmentée jusqu'à ce que l'animal atteigne le niveau de la SIFC; dans le même temps, le renforcement probabilité et le nombre d'essais par session doivent être augmentés pour assurer des performances élevées sur la tâche finale.
1. Formation des animaux
- Restriction alimentaire
- Peser les animaux après au moins deux semaines d'accès libre à la nourriture. Prenez ce poids que le poids alimentation libre. Restreindre l'accès alimentaire au cours des 1-2 prochaines semaines jusqu'à ce que les animaux atteignent 85% de leur poids alimentation libre.
- Il est essentiel que les pigeons de maintenir une apparence physique saine et une activité normale pendant toute la durée de l'ensemble de l'expérience. ÀA cette fin, suivre attentivement l'apparence et le poids des animaux à travers toute la durée de la formation et les tests de comportement. Peser les animaux avant et après chaque session expérimentale pour évaluer l'apport alimentaire quotidien. Fournir de la nourriture supplémentaire si nécessaire pour éviter la perte de poids. Fournir un accès illimité à la nourriture le week-end.
- Autoshaping
Autoshaping sert à habituer l'animal à la chambre expérimentale et établir réponse conditionnée. - Présenter un stimulus visuel 5 sec (ci-après, l'initialisation de relance, IS) sur la touche centrale. Immédiatement après la fin de l'IS ou d'un seul coup de bec à la clé de réponse (ce qui vient en premier), éteindre l'éclairage des touches et présente récompense alimentaire (2 d'activation sec de la trémie de la nourriture).
- Gardez l'ITI considérablement plus long que le temps de présentation d'échantillons pour faciliter l'apprentissage 24. Utilisez des valeurs de 120 sec pour ITI et courir 40 essais par jour. Plus tard réutiliser l'ISque le stimulus clé initialisation, la confirmation, et le choix de la tâche finale (voir la figure 2). Cette phase de formation prendra les animaux environ une semaine.
- Une fois que l'animal répond de manière fiable (dans> 85% des essais), de diminuer le pas à pas vers le bas de l'ITI à 10 secondes et le temps de présentation de l'échantillon vers le bas à 2 sec. Dans le même temps, d'augmenter le nombre de réponses requises de renfort à 3 (de 3 à rapport fixe, FR 3). En outre, d'augmenter le nombre total d'essais par jour. Choisir des paramètres tels que l'animal est formé chaque jour pendant environ 1 heure. Cette phase de formation durera environ deux semaines.
- Répétez les étapes 1.2.1 - 1.2.3 pour les touches de réponse gauche et droite jusqu'à ce que les sujets répondent de façon fiable à l'IS sur les 3 touches. Autres essais avec activation de la touche centrale hasard gauche, à droite, et.
- Maintenant présenter l'est d'abord au centre puis, subordonnée à une réponse, à chaque touche latérale (omettre le renforcement de laResponse Center clé). Autres touches latérales activés aléatoirement d'un essai à. Fin des essais où le sujet ne répond pas à la touche centrale après 5 sec. Répétez jusqu'à ce que l'animal exécute de manière fiable (~ 3 jours).
- Introduire 2 nouveaux stimuli qui sera plus tard servir de FS dans la dernière tâche (voir Figure 2, encadré, pour des exemples). Répétez les étapes 1.2.1 - 1.2.3 à ces stimuli. Répondant seront établis plus rapidement que le premier stimulus, habituellement dans les 4 jours.

Figure 2. Illustration du paradigme comportemental. Après une ITI de 5 secondes, la touche centrale est radiographié vert pour 5 sec (initialisation). Si l'animal répond 3x dans les 5 secondes, 1 sur 4; Stimuli de l'échantillon est présenté à la même position. Après un temps de présentation de l'échantillon fixe de 2 secondes pendant lequel l'animal doit répondre au moins une fois, la clé hiérarchie centrale est radiographié à nouveau vert (confirmation). Après un coup de bec, les touches latérales 2 sont transilluminé vert. Le sujet indique son choix en répondant à la fois l'une des touches latérales. Lors de l'acquisition et réacquisition, les réponses correctes sont suivies par 2 accès à la nourriture sec accompagné d'activation de la lumière d'alimentation, ou l'activation de la lumière d'alimentation seule. Si incorrect, lumières de la maison sont éteintes pendant 3 sec. Au cours de l'extinction, les réponses correctes et incorrectes à la relance de l'extinction restent sans conséquence. En médaillon, par exemple de nouvelles et de relance familier paires.
- Formation d'un unique intervalle choix forcé (SIFC) Groupe pour Familiar stimuli
- Établir la séquence complète de l'initialisation, l'échantillon, la confirmation, et le choix: à chaque essai, présente fiTVD l'IS (FR 3), puis l'un des deux FS (2 sec de durée déterminée), puis de nouveau l'IS (FR 1). Utilisez un design choix invité: à chaque essai, transillumination uniquement la clé de choix qui est correct pour la FS donné. Cette phase de formation devrait prendre environ 1 semaine.
- Une fois que le sujet effectue de manière fiable (> 85% de réponses à la touche latérale respective), introduire essais libre choix (les deux touches latérales transilluminé pendant la phase de choix). Si l'animal répond du bon côté, donner accès à la nourriture pendant 2 secondes. Réponses incorrectes sont suivies par la peine de time-out (hors houselights pendant 2 secondes). Si aucune réponse n'est donnée à moins de 3 secondes, mettre fin à procès et redémarrez l'IIT. Animaux apprennent généralement ces sous-composantes de la tâche dans les 2 semaines.
- Peu à peu augmenter la fraction d'essais libre-choix au cours des sessions suivantes de 20% à 100%.
- Si le sujet effectue> 90% de réponses correctes dans les essais libre-choix, diminuer récompense probabilité de réponses correctes à 0,5tandis qu'en parallèle l'augmentation du nombre d'essais par session de 1000. Ne pas modifier les paramètres chaque jour / session, mais les choisir en fonction de souplesse au niveau du sujet concernant les omissions d'initialisation et le pourcentage de réponses correctes performances. Cette phase de formation durera environ 4 semaines.
- Pigeons ont tendance à refuser de répondre à des stimuli inconnus. Par conséquent, une fois que l'animal exécute de manière fiable> 1000 essais, les réponses de la forme au grand ensemble de stimuli visuels (voir section 1.2). Cependant, ne pas preexpose les stimuli visuels destinés à être utilisés plus tard en tant que nouveaux stimuli dans le paradigme final, mais les écrans couleur uniformes.
- Finale simple Intervalle choix forcé des tâches avec des stimuli nouveaux sous différentes conditions de renfort
- Échauffement
Que l'objet effectuer 50 essais avec seulement les FS. Réglez récompense probabilité pour ces stimuli à <1 (par exemple, de 0,5 à 0,8) pendant toutes les phases de prévention satiété précoce et,par conséquent, le manque de motivation pour répondre. - Acquisition étape
Essais au hasard alternent avec présentation de FS et NS. Affecter des touches d'intervention différents que correct pour les deux NS et renforcer chaque réponse correcte. Calculer le pourcentage de réponses correctes en moyenne mobile sur les 120 derniers essais. Acquisition est considérée comme terminée lorsque la performance pour chacun des NS dépasse 85%, mais pas avant un minimum de 150 essais ont été exécutés. - Stade d'extinction
Arrêtez de renforcement des réponses correctes et incorrectes punir pour un NS aléatoire (extinction de relance). Commencez la phase réacquisition quand correcte répondant à la stimulation de l'extinction descend en dessous de 60% et l'animal a vécu au moins 150 essais dans cette phase au total. - stade de réacquisition
Encore une fois renforcer correcte et punir les mauvaises réponses à la stimulation de l'extinction, comme lors de la phase d'acquisition. Fin à la session lorsque les performances de ce stimulus dépasse 85% et l'animals effectué au moins 150 essais dans cette phase au total.
2. Électrophysiologie
- Electrode Implantation
la chirurgie d'implantation a lieu après les animaux à plusieurs reprises (3-4x) complété la séquence d'acquisition extinction-réacquisition entier et est décrit plus en détail dans d'autres 25. - Placez 5-6 microsrews en acier inoxydable sur le crâne pour l'ancrage de montage d'une tête de ciment dentaire, y compris le microdrive.
- Effectuer une craniotomie juste au-dessus de la région du cerveau d'intérêt; alors disséquer soigneusement la durée et réduire les électrodes à la position désirée.
- Avant l'ancrage du microdrive à la tête de montage, appliquer de la vaseline autour de la canule de guidage; ceci empêchera ciment dentaire à partir enveloppant le tube de guidage.
- Utilisez une électrode à boule d'argent isolé placé sous le crâne recouvrant le cervelet sol.
- Fournir des animaux avec des analgésiques (Carprofen, 10 mg / kg, injecté deux fois par jour) pendant trois jours après la chirurgie. Permettent aux animaux de récupérer pendant au moins 2 semaines.
- Alors que les enregistrements Animaux effectuer la tâche
- Utilisez une nouvelle paire de nouveaux stimuli pour chaque session et l'avance des électrodes au moins 125 um (un demi-tour de la vis d'entraînement) avant de commencer. Si aucun des potentiels d'action de rapport suffisant signal-sur-bruit sont observées, interrompre la session, placer l'animal dans la cage de la maison et essayer de nouveau le lendemain.
- Disposer le câble headstage de telle sorte qu'il n'interfère pas avec le picage normale de l'animal et le comportement alimentaire. Ceci peut être réalisé en connectant le câble avec plusieurs sangles élastiques à la partie supérieure de la chambre de conditionnement et habituer les oiseaux pour le câble attaché pour quelques heures.
- Si possible, faire usage d'un collecteur pour assurer la liberté de mouvement supplémentaire pour les oiseaux.
- Analyses de signaux en mode hors connexion
- Band-pcul-filtre tous les canaux de 500 à 5000 Hz avec raide déconnecté roll-offs en utilisant Spike2. Extrait pointes avec des seuils d'amplitude et de les trier manuellement en utilisant l'analyse en composantes.
- Examinez le tri des résultats avec le code MATLAB écrite sur mesure (disponibles dans les fichiers MATLAB Central change, ID du fichier # 37339). Une seule unité bien isolé (figure 3) doit répondre à tous les critères suivants: a) un groupe clairement séparés en principal espace de composant, b) aucun signe de multiples unités quand tous les signaux enregistrés sont superposées et tracés en carte de chaleur (figure 3A ), c) répartis symétriquement amplitudes pic de forme d'onde (figure 3B), d) un enregistrement stable tout au long de la session, comme en témoigne l'amplitude immuable de pointe (figure 3C), e) aucun ou très peu d'événements de pointe qui se produisent au cours de la période réfractaire de la pointe précédente (Figure 3D), et un rapport signal-sur-bruit (SNR) d'au moins deux (SNR est ici defined comme la différence entre le minimum et le maximum de la forme d'onde de pic en moyenne, divisée par la largeur de la bande rognée de bruit (2,5 e et 97,5 e centile de la distribution des valeurs du premier casier de toutes formes d'ondes)). SNR de l'appareil représenté sur la Figure 3 est de 3,9.
- Inspectez déconnecté canaux première pour des objets proches du mouvement. Jeter les canaux lorsqu'il est indiqué.
- Artefacts électriques qui se produisent pendant hiérarchie clé peuvent dans de rares cas être confondus avec les formes d'onde de pic appropriées. Test de la contamination des enregistrements en examinant le temps histogramme de pointe compte par rapport à chaque passe (péri-picorer histogramme de temps, PPTH, figure 3E) enregistré clé. Artefacts induits picorer-apparaissent comme un pic dans la proximité de l'histogramme (± 50 ms) à l'instant 0. Comme un contrôle supplémentaire, tracer les formes d'onde de tous les événements de pointes putatifs enregistrés à ± 20 ms d'un coup de bec clé séparément et de le comparer à pic formes d'onde détectées outside cette fenêtre (figure 3F).

Mesures figure 3. Qualité pour l'isolement de l'unité. A) la carte de chaleur des valeurs de temps de tension de toutes les formes d'onde. B) Distributions maximale (rouge), minimum (vert), et le bruit (bleu) de tension de toutes les formes d'onde. Les distributions sont bien séparés, indiquant une excellente isolation de l'unité. C) taux spontané de tir (rouge, calculé à partir des segments de 2 secondes dans tous les intervalles intertrial) et des amplitudes de pic (crête-à-crête) en fonction du temps en session. Les deux courbes ont été lissées avec une fonction de wagon (largeur: 50 points de données) D) la distribution Interspike intervalle pour cet appareil.. Largeur Bin, 10 ms (encart: 1 ms). Des intervalles très courts sont presque absents (<0,1% des intervalles inférieurs à 4 ms). E) PSTH déclenché à coups de bec clés. chiffres de l'événement à proximité de la clé picorer (± 20 ms) sont mis en évidence en rouge. F) Tous les 157 formes d'ondes enregistrées à ± 20 msec des événements clés picotin. Les formes d'onde se comparent favorablement à la forme d'onde globale montré dans le panneau A.