Séquentiel In vivo Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

Résumé

La mesure quantitative de la fonction progénitrices de l'os dans la guérison des fractures nécessite haute résolution technologie d'imagerie de série. Ici, les protocoles sont fournies à l'aide de la microscopie intravitale suivi et l'ostéo-lignée pour quantifier séquentiellement l'image et la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes dans le processus de réparation de fracture osseuse.

Résumé

Os tourne en permanence et est fortement régénération suite à une blessure. Cellules souches / progénitrices ostéogéniques ont longtemps été émis l'hypothèse d'exister, mais sur une démonstration in vivo de ces cellules a récemment été atteints. Ici, les techniques d'imagerie in vivo dans d'enquêter sur le rôle des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes (OSPCs) et leur progéniture dans la réparation osseuse sont fournis. Utilisation de cellules ostéo-lignée traçage modèles et imagerie intravitale de microfractures induites dans les os de la voûte crânienne, OSPCs peut être directement observée au cours des premiers jours après l'accident, dans lequel les événements critiques dans le processus de réparation se produisent tôt. sites de blessures peuvent être visualisés en séquence révélant que OSPCs déplacer à la blessure, d'augmenter en nombre et se différencier en ostéoblastes formation osseuse. Ces méthodes offrent un moyen d'étudier le rôle des régulateurs moléculaires des cellules souches intrinsèques et extrinsèques pour la régénération et la réparation osseuse.

Introduction

Maladies dégénératives des os et la perte osseuse liée à l'âge, entraînant un risque élevé de fracture ostéoporotique est devenue un enjeu majeur de santé publique ^1. maintien de l'os est contrôlée par les ostéoblastes formant l'os et les ostéoclastes de résorption osseuse. Défauts de cellules osseuses formant sont une cause principale de la perte osseuse liée à l'âge et les maladies dégénératives osseuses ^2,3. Alors que de nombreuses recherches ont porté sur l'amélioration de la guérison de la fracture, la découverte de médicaments fiables pour guérir les maladies dégénératives osseuses et d'inverser la faiblesse des fractures ostéoporotiques reste un problème important. Ainsi, l'étude de la source de formation de cellules osseuses et de leurs mécanismes de contrôle de la régénération osseuse et la réparation concerne une nouvelle idée pour améliorer la régénération du squelette et inverser les maladies de perte osseuse.

L'existence de cellules mésenchymateuses multipotentes dans la moelle osseuse a été proposée sur la base de l'identification des populations clonogéniques différente qui pourraitLiée en ostéogénique, lignées adipogéniques et chondrogènes ex vivo ^4. Récemment, plusieurs études ont montré que les cellules souches du squelette / mésenchymateuses (SSC / MSC) sont une source naturelle d'ostéoblastes et sont essentiels pour le renouvellement osseux, le remodelage et la réparation de fracture ^5,6 . En outre, notre étude de la lignée de traçage révélé que les ostéoblastes matures ont une demi-vie de façon inattendue à court (~ 60 jours) et sont continuellement renouvelées par leurs cellules souches / progénitrices dans les conditions homéostatiques et la réparation des fractures normales ^6. Cependant, l'identité in vivo de cellules souches et de la manière dont ces cellules réagissent pour fracturer des blessures et de fournir des cellules formant l'os ne sont pas claires. Par conséquent, il est important de développer un procédé qui est capable d'analyser la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses / SSC endogènes dans des circonstances physiologiques.

réparation de fracture est un processus multi-cellulaire et dynamique régie par un ensemble de complexecytokines et des facteurs de croissance ^7. L'approche la plus populaire pour les études de fracture est d'utiliser un modèle animal avec fracture des os longs et d'analyser les os par sectionnement de la moelle et des techniques d'immunofluorescence ^8-10. Ce processus de réparation peut être surveillée par plusieurs techniques d'imagerie, y compris les micro-CT ^11, la fluorescence dans le proche infrarouge ^12, et la chimioluminescence imagerie ^13. Cependant, chaque technique a certaines limites et il n'y a pas moyen efficace de surveiller la fonction SSC / MSC au niveau cellulaire in vivo. Récemment, confocale / deux photons microscopie intravitale a été développé et utilisé pour détecter des cellules cancéreuses transplantées et les cellules souches hématopoïétiques dans le cadre de leur microenvironnement de la moelle osseuse, même à une seule cellule de résolution dans les animaux vivants ^14. En combinant cette technologie avec une série de modèles lignée de recherches, nous avons pu définir que les cellules souches ostéogéniques / progénitrices peuvent être génétiquement marqués par ac transitoirevation de la résistance de myxovirus -1 (MX1), le promoteur et les progéniteurs induite MX1 peut maintenir la majorité des ostéoblastes matures au cours du temps, mais ne participent pas à la production de chondrocytes chez la souris adulte ^6. En outre, nous avons démontré que OSPCs Mx1 marqués fournissent la majorité des nouveaux ostéoblastes dans la guérison des fractures ^6.

Ici, en utilisant des modèles de suivi ostéo-lignage et la microscopie intravitale, un protocole est prévue pour définir la cinétique in vivo de Mx1 ⁺ cellules souches / progénitrices ostéogéniques dans la réparation des fractures. Ce protocole offre imagerie séquentielle pour suivre le déplacement de ostéogéniques souches / progéniteurs dans les sites de fracture et la mesure quantitative de l'expansion de ostéoprogénitrices dans le processus de réparation rapide. Cette approche peut être utile dans de multiples contextes, y compris l'évaluation des candidats thérapeutiques pour améliorer la réparation osseuse.

Protocole

1. Souris et préconditionnement

Remarque: Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes et tous les protocoles ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) à l'Hôpital général du Massachusetts. Toute chirurgie doit être réalisée dans des conditions stériles en utilisant du matériel stérile à l'autoclave. Mx1-Cre ^15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), et Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-tomate), étaient achetées auprès de Jackson Laboratories. souris ostéocalcine-GFP ont été fournies par le Dr Henry Kronenberg. Pour l'analyse quantitative de la migration et de la prolifération OSPC in vivo, ⁺ (couleur unique journaliste) souris Mx1-Cre ⁺ Rosa-YFP ont été utilisés. Pour un suivi plus détaillé de leur différenciation en ostéoblastes ostéocalcine ⁺ matures, nous avons utilisé trigenic Mx1-Cre ⁺ Rosa-tomate ⁺ OCN-GFP ⁺les souris.

1. Pour marquer Mx1 cellules ⁺ in vivo, préparer l'acide polyinosinique-polycytidylique (PIPC, 2,5 mg / ml) dans une solution de PBS stérile et injecter 200 pi pour 20 g de Mx1-Cre ⁺ souris par voie intrapéritonéale reporter une fois tous les deux jours pendant 10 jours.
2. Pour éliminer les cellules hématopoïétiques MX1 ⁺ résidentes, irradier les souris avec une seule dose de 9,5 Gy. Après 24 heures d'irradiation, les cellules de greffe de type sauvage de la moelle osseuse (1x10 ⁶ cellules / souris) par voie intraveineuse ^16. Remarque: Comme les cellules Mx1 inductibles comprennent les cellules hématopoïétiques et les ostéoclastes hématopoïétiques dérivés, l'élimination de Mx1 ⁺ cellules hématopoïétiques améliore la qualité d'image et la quantification de Mx1 ⁺ cellules ostéogéniques.
3. Après la transplantation de moelle osseuse, de surveiller les animaux pendant quatre à six semaines pour atteindre une repopulation réussie de cellules donneur de moelle osseuse.

2. MoPréparation utiliser

1. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de 50 ul de la kétamine / xylazine (100 mg / kg, xylazine 12 mg / kg de poids corporel) en utilisant une procédure IACUC approuvé. Remarque: La durée de l'effet peut être prolongée par une dose supplémentaire de kétamine / xylazine.
2. Déterminer si la souris est totalement anesthésié par l'absence de réponse aux pieds et / ou de la queue pincées. (Facultatif) Lorsque la souris est anesthésiée, obtenir un masque à gaz isoflurane sur le nez en collant. Réglez le niveau de l'isoflurane à s'assurer que l'animal est entièrement sous sédation.
3. Couper les poils du cuir chevelu à l'aide d'une tondeuse électrique ou de petits ciseaux. Retirer les fragments de cheveux et stériliser la peau exposée avec 70% tampon imbibé d'alcool. Appliquer le gel lacrymogène pour empêcher la déshydratation de la cornée.

3. Microfracture blessures

1. Après s'être assuré que l'animal est entièrement sous sédation, faire une incision unique en forme de L inversé pour ouvrir la peau du cuir chevelu. En bref, faire une première incision transversale (moins de 1 cm) starting d'une oreille à l'autre oreille. Tournez ~ 60 ° et continuer à inciser vers le nez jusqu'à ~ 2-3 mm de nez. Remarque: cette incision minimise la formation de tissus cicatriciels au-dessus de la zone à imager.
2. Séparez les lambeaux de peau en tirant vers les côtés avec une pince. Les deux os frontaux et l'intersection des sutures coronale et sagittale devront être clairement exposés.
3. Nettoyer la surface ouverte par rinçage avec du PBS stérile et essuyage doux avec gaze ou de coton-tige stérile jusqu'à ce que tous les poils résiduels sont éliminés.
4. Pour générer des microfractures sur la calotte crânienne, tenir la tête de la souris avec une main et une aiguille G 30 avec une autre main. Faire une micro-perforation (~ plaie de 0,2 mm de diamètre <1 mm de profondeur) sur l'os frontal gauche près de l'intersection des sutures sagittale et coronale en insérant la pointe d'une aiguille 30 G avec une légère pression et mouvement de torsion. Attention: Il est essentiel d'éviter l'aiguille de pénétrer dans le cerveau, réduisant ainsi bleeding et des lésions tissulaires.
5. Passez à une plus grosse aiguille (20 ou 25 G) et élargir le trou de perforation en tournant l'aiguille (~ de 0,5 mm de diamètre).
6. Répétez l'étape 3.3 à 3.5 pour générer deuxième ponction sur l'os frontal controlatéral.
7. Essuyez les taches blessés par la chute continue de PBS jusqu'à ce que le saignement s'arrête.
   Remarque: Bleeding sur les sites de fracture va interférer avec l'imagerie appropriée et induire la formation de cicatrices.
8. Appliquer une goutte de solution stérile de sérum physiologique ou de 2% Methocel sur le crâne pour éviter le séchage. Remarque: Ne laissez pas la surface du crâne à sécher, ce qui réduira la clarté d'image. Il est important d'utiliser une quantité suffisante de gel ou de solution saline pour couvrir la zone.

4. Imagerie intravitale

1. (Facultatif) Avant imagerie, certaines souris sont injectés avec un colorant vasculaire pour visualiser les vaisseaux sanguins. Injecter rétro-orbitale avec 20 pi de Qtracker non ciblé 705 (2 uM solution dans 50 mM de tampon borate) dilué dans 80 ml de PBS. Utiliser une seringue à insuline pour réduire les déchets de réactif. Si le signal n'est pas suffisamment clair, des montants supplémentaires pourraient être nécessaires.
2. Mettez le scanner. Remarque: Un scanner laser à base de polygones permet multi-canal d'acquisition d'image simultanée à la cadence vidéo (30 images par seconde). balayage de taux de la vidéo est très important pour l'imagerie des animaux vivants.
3. Allumez le laser multi-photons (femto-seconde titane: saphir laser). Régler la longueur d'onde de 880 nm et d'ajuster la puissance pour la deuxième imagerie par génération d'harmoniques (440 nm) de l'os. Pour la GFP et tdTomato excitation, tournez sur la 491 nm et 561 lasers à l'état solide nm.
4. Allumez le PMT (photomultiplicateurs) détecteurs pour chaque signal (a ± 20 nm de filtre 435 passe-bande pour la deuxième génération d'harmoniques, un ± 19 nm filtre 528 passe-bande pour la GFP, et 590 ± 20 pour tdTomato.) (Facultatif) Utilisez une 638 nm laser hélium-néon et un PMT avec un ± 27,5 nm filtre 695 passe-bande pour détecter Qtracker 705 signaux.
5. Place l'animal sur une platine de microscope motorisée axes XYZ. Gardez la souris dans la position la plus confortable avec un coussin chauffant électrique pour aider à maintenir la température du corps (ce qui réduit le risque de perte de l'animal). Utilisez du ruban adhésif pour maintenir la souris pour minimiser le mouvement lors de l'imagerie et de maintenir la zone imagée aussi horizontale que possible.
6. Appliquer une goutte de gel de méthylcellulose à chaud de 2% ou une solution saline physiologique sur le crâne pour éviter le séchage. Mettre une lamelle couvre-objet sur la zone de formation d'image. Utilisez un objectif de faible grossissement (30x objectif immersion dans l'eau à 0,9 NA) pour numériser la calotte crânienne.
7. Utiliser le contrôleur axes XYZ, trouver la surface de calotte crânienne par détection du signal SHG à partir d'os et d'identifier un emplacement de point de repère essentiel, comme l'intersection entre les sutures sagittale et coronale sutures. Acquérir une image et enregistrer les coordonnées XYZ.
8. Continuer à rechercher l'emplacement de la blessure en observant les signaux de SHG et de fluorescence.
9. Lorsque les sites de blessures ou la région of intérêt se trouvent, acquérir une image de la meilleure plan focal contenant les signaux de fluorescence à partir de SHG et les cellules d'intérêt. Sauvegarder coordonnées XYZ et la distance à l'intersection des sutures sagittale et coronale de définir leur emplacement précis pour les prochains cycles de l'imagerie.
10. Pour recueillir des structures 3D cellulaires et des os de blessure de fracture, d'enregistrer des images par Z-piles (2 - 5 Intervalle de um) avec ~ 100 um de profondeur de la surface de l'os endostéale. Après l'achèvement de l'imagerie d'un côté de la lésion, répéter le processus d'imagerie pour venir sites de blessures.

Procédures 5. Opération de post

1. Après l'imagerie, rincer site d'imagerie avec une solution saline stérile pour enlever le gel de méthylcellulose à partir de la boîte crânienne. L'utilisation d'un coton-tige stérile, appliquer une petite quantité d'onguent antibiotique triple sur la surface. Couvrir les lambeaux de peau et re-fermer le cuir chevelu par suture chirurgicale. Cela peut être fait avec un fil de suture hypoallergénique (de polyglactin absorbable suture) et 5-0 taille aiguille de suture. Attention: Bonne technique de suture minimise la formation de cicatrices.
2. Traiter tous les animaux avec injection IP de 0,05-0,1 mg / kg toutes les 12 heures de la buprénorphine pendant 48 heures après la chirurgie. Gardez les animaux dans une chambre de récupération à chaud jusqu'à ce qu'ils reprennent conscience suffisante. Après 3 à 5 jours, rouvrir la suture et répétez les étapes d'imagerie intravitale pour suivre le changement cellulaire pendant la guérison des fractures.

Résultats

Le long modèle de fracture osseuse stabilisé a été populaire dans les études de fracture. Cependant, l'os long ou grands modèles de fracture causer des dommages aux tissus multiples et, par conséquent, avoir une limitation dans la mesure quantitative de la fonction des cellules de l'os. Nous avons développé une blessure mini-invasive (moins de 1 mm de diamètre avec peu ou pas d'invasion dans la dure-mère) sur la voûte du crâne avec os frontaux forage d'aiguille (figures 1A-1C). Nous avons choisi une vue...

Discussion

La régulation des cellules souches du squelette peut être d'une grande importance pour définir de meilleures méthodes pour atteindre la régénération osseuse. Imagerie quantitative et séquentielle au niveau cellulaire a été un défi technique. Bien que le long os modèle de fracture de la souris a été largement utilisé et adapté pour les études biomécaniques ^17, son emplacement profond des tissus, la taille de fracture inégale, lésions des tissus mous, et l'application des fixateurs de stabilisation ont ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C57BL/6J (H-2B)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664
Injection de chlorhydrate de kétamine	Bionichepharma	67457-001-10	; Taille du flacon : 10 ml (50 mg/ml)
Solution stérile de xylazine	Lloyd Inc.	NADA# 139-236
Buprénorphine Hl	BEDFORD LAB	NDC 55390-100-10	Flacon : 0,3 mg/ml, Doses : 0,05-0,1 mg/kg
DPBS, 1X	CORNING cellgro	21-031-CV
Coussinets de préparation à l’alcool (alcool isopropylique à 70 %)	Kendall WEBCOL	5110
Ciseaux chirurgicaux fins	F.S.T	14568-09
Pince extra fine	F.S.T	11150-10
VICRYL*Plus Suture	Ethicon	VCP490G
Qtracker 705 point quantique non ciblé	Invitrogen	Q21061
Méthocel 2 %	OmmiVision
pIpC (acide polyinosinique-polycytidylique)  ;   ;	Sigma	P0913-50MG	100 &mu ; l (2,5 mg/ml dans le PBS) pour 10 g de souris
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers	Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser	Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser	Coherent