Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

Résumé

microrhéologie de traces de particules peut être utilisé pour quantifier de manière non destructive et spatialement cartographier les changements dans les propriétés mécaniques matrice extracellulaire dans des modèles de tumeurs 3D.

Résumé

Le micro-mécanique a été montré pour agir comme un régulateur essentiel du comportement de la croissance tumorale et de signalisation, qui est elle-même transformée et modifiée dans le cadre d'un ensemble d'interactions, dans les deux sens mécanosensibles complexes. Alors que le développement de modèles de tumeurs 3D biologiquement pertinentes ont facilité études mécanistiques sur l'impact de la matrice rhéologie sur la croissance de la tumeur, le problème inverse de l'évolution de la cartographie de l'environnement mécanique induite par des tumeurs reste difficile. Ici, nous décrivons la mise en œuvre de microrhéologie de traces de particules (PTM) en conjonction avec des modèles 3D de cancer du pancréas dans le cadre d'une approche robuste et viable pour le suivi longitudinal des changements physiques dans le microenvironnement de la tumeur, in situ. La méthodologie décrite ici intègre un système de préparation de modèles in vitro 3D incorporés dans un modèle de matrice extracellulaire (ECM) de l'échafaudage de collagène de type I avec des sondes marquées par fluorescence répartis uniformément pour po-sition et des mesures de temps-dépendante Microrhéologie à travers l'échantillon. tumeurs in vitro sont étalées et sondés dans des conditions parallèles en utilisant des plaques d'imagerie multi-puits. S'appuyant sur ​​des méthodes établies, les vidéos des traceurs mouvements de la sonde sont transformés par la Relation généralisé Stokes Einstein (TBS) pour signaler le complexe viscoélastique module de cisaillement dépendant de la fréquence, G * (ω). Parce que cette approche est basée imagerie, caractérisation mécanique est également mappé sur de grands champs spatiaux transmis-lumière de signaler simultanément des changements qualitatifs dans la taille et le phénotype tumoral 3D. Les résultats représentatifs montrant contraste réponse mécanique dans les sous-régions associées à une dégradation locale de la matrice induite invasion ainsi que le calibrage du système, les données de validation sont présentés. Résultats indésirables de erreurs expérimentales communes et le dépannage de ces questions sont également présentés. Le format de la culture placage 3D 96 puits mis en œuvre dans ce protocole est conducive de corrélation des mesures de Microrhéologie avec des essais de criblage thérapeutiques ou d'imagerie moléculaire à acquérir de nouvelles connaissances dans l'impact des traitements ou à des stimuli biochimiques sur le microenvironnement mécanique.

Introduction

Il est clair à partir d'un nombre croissant de preuves dans la littérature que les cellules cancéreuses, comme les cellules épithéliales de mammifères non malignes, sont très sensibles aux propriétés mécaniques et biophysiques de la matrice extracellulaire environnante (ECM) et d'autres composants de microenvironnement ^1-9. Études mécanistiques élégantes ont donné un aperçu du rôle de la rigidité extracellulaire en tant que partenaire de signalisation mécano complexe qui régit le comportement de la tumeur maligne et la morphogenèse ^2,3,10,11. Ce travail a été facilité en particulier par le développement de la 3D dans des modèles....

Protocole

1. Sphéroïdes La culture de la tumeur

1. Mélanger 10 ml de l'eau de qualité culture cellulaire avec 0,1 g d'agarose pour obtenir une solution d'agarose à 1%.
2. solution d'agarose à la chaleur au-dessus de 70 ° C (plus ou moins 14 secondes dans un four micro-ondes standard ou à l'aide d'une plaque chauffante) avant aliquotage 40 ul de solution d'agarose dans un puits d'une plaque à 96 puits.
3. Incuber la plaque à 37 ° C pendant au moins 1 heure tandis que la récolte de cellules en utilisant des techniques standard.
4. Utiliser un hématimètre pour déterminer la concentration de cellules dans la suspension. ....

Résultats

Pour vérifier la validité de G * (ω) des mesures à des positions localisées dans un micro-environnement de la tumeur modèle complexe, deux expériences de validation initiales ont été menées. Tout d'abord, nous avons cherché à valider nos mesures contre le «gold standard» de masse oscillante cisaillement rhéométrie. Nous avons préparé des échantillons identiques de matrice de collagène (sans cellules) à une concentration de 1,0 mg / ml de collagène. Ces échantillons ont été sondés avec un rhéomètre vrac (TA .......

Discussion

Dans ce protocole, nous introduisons une stratégie robuste et largement applicable pour le suivi longitudinal des changements locaux dans ECM rigidité dans des modèles de tumeurs 3D. Nous prévoyons que cette méthode pourrait être adoptée par les biologistes du cancer et biophysiciens intéressés par le comportement mécanosensible impliquée dans le remodelage matriciel pendant la croissance de la tumeur et les processus d'invasion. Quantification précise de la matrice cinétique de dégradation pourrait être particulièr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagène bovin de type 1	BD Biosciences, San Jose, CA	354231
PANC-1	Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	ou autre type de cellule approprié
Microsphères fluorescentes	Life Technologies, Carlsbad, CA	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford, MA	354230
Agarose	Fisher Bioréactifs, Waltham, MA	C12H18O9
	NaOH Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
Plaques d’imagerie à 96 puits	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	ou milieu de culture cellulaire approprié
Microscope Zeiss AxioObsever Zeiss	, Oberkochen, Allemagne		comprend une caméra à grande vitesse et logiciel d’imagerie
Logiciel MATLAB	The Mathworks, Natick, MA

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