Analyse des réactions de transformation de l&#39;ARN utilisant des cellules des systèmes gratuits: 3 &#39;Fin de clivage de pré-ARNm substrats<em&gt; In vitro</em

Résumé

L'ARN polymérase II synthétise un ARN précurseur qui s'étend au-delà de l'extrémité 3 'de l'ARNm mature. L'extrémité de l'ARN mature est généré cotranscriptionally, sur un site dictée par des séquences d'ARN, par l'intermédiaire de l'activité d'endonucléase du complexe de clivage. Ici, nous détaillons la méthode d'étudier les réactions de clivage in vitro.

Résumé

L'extrémité 3 'des ARNm de mammifères n'est pas formé par un arrêt brutal de la transcription par l'ARN polymérase II (RNPII). Au lieu de cela, RNPII synthétise précurseur ARNm delà de la fin des ARN matures, et un processus actif de l'activité de l'endonucléase est nécessaire à un site spécifique. Le clivage de l'ARN précurseur se produit normalement 10 à 30 nt en aval du site polyA de consensus (AAUAAA) après les dinucléotides CA. Les protéines provenant du complexe de clivage, d'un complexe protéique multifactorielle d'environ 800 kDa, d'accomplir cette activité de nucléase spécifique. Des séquences d'ARN spécifiques en amont et en aval du site polyA contrôlent le recrutement du complexe de clivage. Immédiatement après le clivage, les pré-ARNm sont polyadénylés par la polymerase polyA (PAP) pour produire des messages d'ARN matures stables.

Le traitement de l'extrémité 3 'd'un transcrit d'ARN peut être étudiée en utilisant des extraits nucléaires cellulaires avec des substrats spécifiques d'ARN radiomarqués. En somme, un long ^{32 <}/ Sup> ARN précurseur non clivé P-marqué est incubé avec des extraits nucléaires in vitro, et clivage est évaluée par électrophorèse sur gel et autoradiographie. Lorsque clivage bon produit, un court 5 'clivé produit est détecté et quantifié. Ici, nous décrivons le test de clivage en détail à l'aide, par exemple, le traitement du VIH-1 ARNm extrémité 3 '.

Introduction

La biosynthèse de la plupart des ARN messages eucaryotes matures (ARNm) nécessite plusieurs modifications post-transcriptionnel comme le recouvrement, l'épissage et de polyadénylation. Ces modifications sont généralement couplés pour assurer un traitement correct et ^une augmenter fortement la stabilité de l'ARNm.

Le 3 'de la fin de la formation de pré-ARNm de mammifère est produite par le clivage endonucléolytique de l'ARN naissant suivie par l'addition de résidus adenylate à l'extrémité 5' produit clivé par poly (A) polymérase (PAP) ^4.2. Chez les mammifères, le clivage est effectué par un....

Protocole

1. L'adaptation de cellules adhérentes en suspension

(Cette étape est facultative. Cellules en suspension font généralement de meilleurs extraits nucléaires, mais les cellules cultivées dans des plaques peuvent également être utilisées.)

1. S'adapter à la croissance des cellules adhérentes en suspension en utilisant modifié MEM de Joklik additionné de 5 à 10% de sérum de veau nouveau-né ou du sérum de veau fœtal et 1% de L-glutamine: pénicilline-streptomycine. Propager les cellules dans des flacons à centrifuger avec un couvercle de filtre à 37 ° C avec 8% de CO _2.
2. Lors de l'adaptation des cellules....

Résultats

Les résultats représentatifs d'un dosage de clivage de l'ARN poly (A) des sites de VIH-1 (Figure 2). Nous pouvons observer le substrat d'ARN non clivé, qui est le plus lent bande de migration à la surface du gel. Le produit clivé spécifique est la plus intense plus courte bande le fragment qui tourne plus vite dans le gel à la taille attendue, et est spécifiquement absente du test de clivage de la mutpoly (A) contrôle qui contient une mutation ponctuelle dans la séquence polyA (mutPolyA) d&#.......

Discussion

La réaction de clivage de pré-ARNm en 3 'in vitro, réalisée dans des extraits nucléaires de cellules HeLa ou avec des facteurs de clivage fractionnés à partir de ces extraits, a permis d'identifier les principaux facteurs de clivage et de leurs principaux complexes ^16-21. Beaucoup plus de protéines associées à ces facteurs ont été récemment identifié ^22, et la réaction in vitro peuvent continuer à faire la lumière sur la façon dont ces protéines contribuent à la réaction. .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fiole Celstir 1 L	Wheaton	356884	Différentes tailles disponibles Agitateur
à vitesse lente 4 positions	VWR	12621-076
Centrifugeuse à godets oscillants	Beckman Coulter		Allegra x-15R avec rotor SX4500
Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter		Optima L-100 XP Ultra avec rotor SW41
Centrifugeuse de table 5417R	Eppendorf		Incubateur réfrigéré
Thermomixeur	Eppendorf
250 ml Tubes coniques	Corning	430776
50 ml Tubes coniques	BD Falcon	352098
Tubes à centrifuger ultraclairs	Beckman Coulter	344059
JOKLIK modifié MEM	Lonza	04-719Q
Sérum fœtal bovin	Atlas	F-0500-A	Inactivé par la chaleur
L-glut :pen :streptocoque	Gemini Bio-Products	400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
Chlorure de magnésium	Fisher	BP214-500
Chlorure de potassium	MP Biomedicals	194844
HEPES	Fisher	BP310-500
DTT	Alexis Biomedicals	280-001-G-010
Glycérol	Fisher	BP229-4
5 M solution de chlorure de sodium	Mediatech	46-032-CV
EDTA 0,5 M solution	Sigma-Aldrich	E7889-100ml
EDTA	Fisher	BP120-500
PMSF	Thermo Scientific	36978
Sulfate d’ammonium	Fisher	A702-500
Comprimés cocktail complets d’inhibiteurs de protéase sans EDTA	Roche	04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Cassettes de dialyse Kit	Thermo Scientific	66372	MWCO 7 000 0,5 ml-3 ml
15 ml Dounce Ensemble de broyeur de tissus	Sigma-Aldrich	D9938-1SET	Différentes tailles disponibles
Expand kit PCR haute fidélité	Roche	11 732 650 001
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	Y02256	10 mM chaque nucléotide
MaxiScript SP6/T7 kit	Ambion	AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap	New England Biolabs	S1404S
Century Marker Template Plus	Ambion	AM7782
Easytides UTP [&alpha ;-32P] 250 &mu ; Ci	Perkin Elmer	BLU507H250UC
Gel tampon de chargement II	Ambion	8546G
Eau traitée DEPC	Ambion	AM9906
10x TAE	Fisher	BP13354
10x	TBE Ameresco Life Sciences	0658-4L
10x PBS	Fisher	BP399-20
Urea	Fisher	BP169-212
Persulfate d’ammonium	Bio-Rad	161-0700
TEMED	Fisher	BP150-20
Acétate d’ammonium	Fisher	A637-500
40 % 19:1 acrylamide :bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0144
Glycogène	Roche	10 901 393 001
100 % éthanol absolu 200 proof	Acros	61509-0040
Phénol acide :chloroforme	Ambion	9720	Pour ARN
Fluide de scintilation	Fisher	SX18-4
Inhibiteur de la rnase	Promega	N261B
Alcool polyvinylique- PVA	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Créatine phosphate	Calbiochem	2380
100 mM dATP	Fisher	BP2560-4
SDS	Acros	23042-5000
Proteinase K	Fisher	BP1700-100
Unité de séquençage réglable	Sigma-Aldrich	Z351881-1EA
Pinces de reliure	Office Depot	838-056
Plaques de verre 20 cm x 42 cm	Sigma-Aldrich	Z352543	1 SET
Plaques de verre de 20 cm x 22 cm	Sigma-Aldrich	Z35252-7	1 SET
de plaques de refroidissement en aluminium de 20 cm x 42 cm	Sigma-Aldrich	Z352667	1 EA
Entretoises de 0,4 mm x 22 cm	Sigma-Aldrich	Z35230-6	1 SET
d’entretoises de 0,4 mm x 42 cm	Sigma-Aldrich	Z352314-1	1 SET
de peigne à 8 puits	Sigma-Aldrich	Z35195-4	1 EA
Peigne 16 puits	Sigma-Aldrich	Z351962	1 EA
Peigne 32 puits	Sigma-Aldrich	Z351970	1 EA
Revêtement gel repoussant	C.B.S. Scientific	SGR-0401	ou SGR-0101 pour bouteille individuelle
Embouts de chargement de gel	Rainin	GT-10-4	0.1-10 &mu ; l
Séquençage PowerPac HV	Bio-Rad	PowerPac HV	5 000 V/500 mA/400 W
Séchoir à gel modèle 583	Bio-Rad	modèle 583
Pompe à vide Hydrotech pour séchoir à gel	Bio-Rad
Glogos II Marqueurs phosphorescents	Agilent	420201
Film 8 x 10	Midsci	BX810
Film 14 x 17	Phenix	F-BX1417
Cassette d’autoradiographie	Fisher	FBCA 1417	8 x 10 taille disponible