Nanopodia sont des canaux membranaires minces mais fragiles qui s'étendent jusqu'à 100 um de leader avant ou arrière de l'arrière de la cellule et le sens de l'environnement cellulaire. Fixation directe à 37 ° C, un lavage doux, et d'éviter les solvants organiques tels que l'éthanol, le méthanol, ou l'acétone et de l'augmentation de Triton X-100 concentrations sont tenus de respecter ces structures cellulaires.
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Article de méthode
Nanopodia - minces, les projections fragile membrane avec des rôles dans le mouvement cellulaire et intercellulaires Interactions
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules adhérentes en culture maintenir un état de polarisation pour soutenir le mouvement et les interactions intercellulaires. Nanopodia sont minces, de forme allongée, en grande partie F-actine négatif projections membranaires dans les cellules endothéliales et les cancers qui peuvent être visualisées par TM4SF1 (transmembranaire-4-L-six-famille-1) immunofluorescence. Grappes TM4SF1 à 100-300 diamètre um TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) contenant de 3 à moins de 14 individuels TM4SF1 molécules. TMED sont agencées de manière intermittente le long de nanopodia à un espacement régulier de 1 à 3 TMED par μ m et à ancrer fermement nanopodia matrice. Cela permet de prolonger nanopodia plus de 100 μ m du front avant ou arrière à l'arrière des cellules endothéliales tumorales ou polarisées, et provoque des résidus de membranes d'être laissé sur matrix lorsque la cellule s'éloigne. TMED et nanopodia ont été négligés en raison de leur extrême fragilité et sensibilité à la température. Lavage régulier et la fixation perturbent la structure. Nanopodia sont conservés par fixation directe dans paraformaldéhyde (PFA) à 37 ° C, suivie d'une brève exposition à 0,01% de Triton X-100 avant la coloration. Nanopodia ouvrir de nouvelles perspectives en biologie cellulaire: ils promettent de remodeler notre compréhension de la façon dont les cellules détectent leur environnement, de détecter et d'identifier d'autres cellules à distance, initier des interactions intercellulaires au contact étroit, et des mécanismes de signalisation impliquées dans le mouvement, la prolifération et la cellule -cellulaires communications. Les méthodes développées pour étudier nanopodia TM4SF1 dérivés peuvent être utiles pour les études de nanopodia qui se forment dans d'autres types cellulaires par l'intermédiaire de tétraspanines classiques, notamment le CD9 exprimée de manière ubiquitaire, CD81, CD151 et.
Introduction
Au cours de la polarisation pour le mouvement, des cellules animales s'étendent une série de saillies membranes dynamiques, à partir de leurs surfaces, y compris des filopodes, lamellipodes, les fibres de rétraction, et une volants. Récemment ajoutés à cette liste étaient nanopodia, un nouveau type reconnu de fin (100-300 m de diamètre), de forme allongée (jusqu'à 50-100 m de long) projection de la membrane qui fournissent des canaux membranaires pour l'extension des structures F-actine tels que filopodia et les fibres de rétraction, et que la tache positive avec TM4SF1 (transmembranaire-4-L-six-famille-1) en endothéliales et tumorales des cellules cultivées 2,3.
TM4SF1 est une protéine ayant une topologie de tétraspanines analogue qui a été initialement connu comme un antigène de cellule tumorale 4 avant la découverte du fait que la molécule est un marqueur biologique des cellules endothéliales qui joue un rôle essentiel dans la prolifération des cellules endotheliales et de la migration 2,3. Immunofluorescence a révélé que TM4SF1 est localisée à perinucLear et des vésicules à la membrane plasmique, et est enrichie en TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED ancre nanopodia à la matrice et présente dans un motif à bandes régulièrement espacées de 1-3 longueur TMED / um de nanopodia. Nanopodia s'étendent généralement de leader avant d'une cellule et arrière arrière pendant la polarisation de la cellule pour se déplacer. En raison de la nature solide adhérente de TMED, nanopodia sont incapables de se rétracter de nouveau dans la cellule comme il se déplace à une distance; résidus de nanopodia abandonnés oligo donc sur la trajectoire du mouvement cellulaire. Nanopodia fournir des canaux membranaires pour l'extension F-actine et de rétraction, et sont des sites d'interactions et de communications intercellulaires 2,3. Ces caractéristiques font que nanopodia offrent une occasion unique d'étudier les mécanismes sous-jacents ensemble F-actine pendant la polarisation cellulaire, détection cellulaire de l'environnement, de la détermination de la trajectoire et la direction du mouvement de la cellule, et les interactions intercellulaires unend communications.
En raison de la nature hautement hydrophobe de TMED et la nature membraneuse mince et fragile de nanopodia, un soin particulier doit être pris afin de préserver TMED et nanopodia. La destruction de nanopodia et l'élimination des TMED par des méthodes courantes de laboratoire est une raison possible pour laquelle seulement soixante-trois publications ont paru sur TM4SF1 depuis sa première découverte en 1986 et 1 pour l'absence totale de connaissance de l'enrichissement TM4SF1 à 100-300 um microdomaines sur la surface de la cellule jusqu'à ce que le rapport de TM4SF1 dans les cellules endothéliales en 2009 2.
Méthodes d'immunomarquage classiques utilisent souvent des solvants organiques tels que l'éthanol, le méthanol, l'acétone ou de fixer les cellules et utiliser une concentration plus élevée de Triton X-100 0,1% ou à perméabiliser les cellules 5. Études décrites ici mis en œuvre trois changements majeurs à la méthode conventionnelle de révéler TMED et nanopodia: (i) utilisent 37 ° C 4% PFA et fixer les cellules dans un 3776; incubateur, (ii) appliquer la température ambiante douce PBS lavage, et (iii) utiliser moins de 0,03% de Triton X-100 que brièvement pour perméabiliser les cellules avant l'addition de l'anticorps primaire, comme le Triton X-100 supérieure à 0,03% extraira TM4SF1.
Tous les tétraspanines forment des microdomaines de la membrane de la cellule 6 et à une certaine colocalisent TMED endothéliales dans les cellules tumorales et 2,3. Comme tétraspanines comme CD9, CD81, CD151 et sont exprimés de façon ubiquitaire, le protocole de coloration décrit ici peut être étendue à de nombreux types différents de cellules qui manquent TM4SF1 pour les études de la fonction nanopodia.
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Protocole
Une. Culture cellulaire sur collagène verre enduit de disque
- Lieu disques de verre (12 mm de diamètre) dans un bocal de verre (4 onces) et autoclave pour stériliser les disques.
- Placer 25 ml de 70% d'éthanol dans un tube Falcon de 50 ml et le placer dans une hotte de culture cellulaire. Cette solution peut être réutilisé de multiples fois jusqu'à ce que le niveau de la solution tombe à 20 ml.
- Placez tranchants pince avec un point extra fine dans de l'éthanol à 70% pendant 5 minutes avant de l'utiliser pour traiter le disque de verre.
- Retirez délicatement la pince sur le tube et refermer le bouchon, puis placez délicatement la pince d'éthanol traité sur le dessus du tube de sécher à l'air pendant 2 min. Ne laissez pas la pointe de la pince de toucher quoi que ce soit dans la hotte.
- Utilisez les pinces stériles d'attraper un disque de verre stérile sur le pot de verre et le placer dans un puits de la plaque de culture cellulaire de 24 puits. Répétez jusqu'à ce que le nombre souhaité de puits a été rempli avec des disques.
- Mettre 500 ul de solution de collagène bovin (50 ng / ml) dans chaque puits qui contient un disque de verre et le placer dans un 37 ° C, 5% CO 2 incubateur de culture cellulaire pendant au moins 30 min. Il n'y a pas de mal à une incubation plus longue.
- Récolte des cellules HUVEC (cellules endothéliales de veine ombilicale humaine) ou PC3 (cellules tumorales de la prostate), qui ont déjà été cultivées dans 150 mm de plaque de culture cellulaire à travers trypsinisation et bloquent l'activité de la trypsine en utilisant le milieu de culture complet. Prélever des cellules dans un tube Falcon de 15 ml.
- Compter le nombre de cellules et de s'assurer de la viabilité est supérieure à 90%.
- Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant.
- Utilisation du milieu de culture pour diluer les cellules à 10 5 cellules / ml. Placez les cellules sur la glace.
- Aspirer le collagène dans la hotte de culture cellulaire et placez doucement 500 pl de suspension cellulaire dans chaque puits, dans lequel les disques de verre ont été pré-revêtues avec du collagène. 5 x 10 4 cellules / puits dans la plaque à 24 puits donnera 60% confluency pour les cellules HUVEC et 30% de confluence de cellules PC3. Remarque: ajouter plus de suspension cellulaire de la densité cellulaire plus élevée.
- Culture des cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, ou 24 h pour suivre les activités de nanopodia et passage de cellule. Habituellement, les cellules se fixeront sur le disque de verre dans les 30 premières minutes, puis commencent à polariser et migrer dans la première heure, et effectuer des interactions intercellulaires et la division cellulaire dans les heures suivantes.
2. Fixation cellule
- Chaque puits devra 500 pi 4% PFA (paraformaldéhyde) pour fixer les cellules. Soit fabriqué commercialement ou fraîchement préparé PFA 4% peut être utilisée. Calculez le montant de PFA nécessaire sur la base du nombre de puits préparés, et placer PFA dans un tube Falcon de 15 ml. ATTENTION: paraformaldéhyde est soupçonné d'être cancérigène.
- Mettez le tube Falcon dans un stand de styromousse qui était déjà en place dans un incubateur à 37 °. Laisser le tube dans l'incubateur pendant 30 min à la guerresuis la PFA à 37 ° C.
- Placez un coussin chauffant dans la hotte de culture et allumez-le.
- Sortez la plaque de culture cellulaire de 24 puits et la préchauffé PFA de l'incubateur et placez-le sur le dessus du coussin chauffant.
- Utilisez une main pour aspirer le moyen d'un puits, et immédiatement après utiliser l'autre main pour glisser doucement 500 pi PFA dans le puits à travers le bord bien. Pour faciliter l'aspiration, incliner la plaque de culture à environ 45 °, appuyé contre le support en polystyrène de sorte qu'il est stable à cet angle. Cela facilitera l'aspiration et l'ajout de solution PFA au bien sans déranger les cellules en culture. Cette étape est la plus cruciale pour préserver la structure cellulaire initiale des activités cellulaires.
- Répétez le processus jusqu'à ce que tous les puits avec un disque de verre ont reçu PFA. Note: toutes les mesures qui doivent changer solution pré-existante du puits s'appliqueront mêmes procédures d'aspiration.
- Placer la plaque dans 37 ° C pendant 5 min.
- Prenez la plaque arrière de la hotte de culture et incliner contre styromousse comme décrit dans l'étape 2.5. Utilisez une main pour transférer doucement la PFA du puits dans un tube de collecte; utiliser l'autre main pour placer immédiatement après au moins 500 pi salle de PBS température dans le puits. Après tous les puits ont été lavés, retourner et répéter le lavage PBS une fois de plus dans chaque puits. Vider la PFA recueillies dans un conteneur de déchets dangereux.
- Préparer tampon de blocage de la CPI en ajoutant 2% de sérum bovin fœtal à PBS. Azoture de sodium 0,04% (dilution de 20% solution mère) est ajouté comme agent de conservation. ATTENTION: L'azoture de sodium est un composé toxique. Le tampon peut être stocké dans 4 ° C pendant une longue période de temps sans risque de contamination bactérienne.
- Avec la plaque de culture encore inclinée contre un support, une fois de plus parcourir chaque aspiration bien pour enlever PBS et immédiatement après addition de 500 pi de tampon de blocage de la CPI. Les cellules sont maintenant prêts pour immunofluorescence. Si nécessaire, l'cellules fixées peuvent être stockés dans un réfrigérateur à 4 C ° pendant une semaine sans perte significative de la protéine TM4SF1.
3. TM4SF1 immunofluorescence de Nanopodia
- Dans chaque puits, remplacer le tampon de blocage de 500 pi de la CPI avec un nouveau tampon de blocage contenant 0,01% de Triton X-100 et laisser reposer à température ambiante pendant 1 heure. Ne pas utiliser plus élevée que 0,03% de Triton X-100 comme il va supprimer TM4SF1 à partir des membranes cellulaires. PBS lavé les cellules de l'étape 2.10 peuvent être directement déplacés vers le tampon de blocage contenant du Triton si la coloration est prêt à démarrer tout de suite.
- Diluer l'anticorps primaire anti-TM4SF1 (ou anti-CD9) à 0,5 pg / ml dans du tampon de blocage CPI.
- Dans chaque puits, enlever le tampon Triton ICC/0.01%, et le remplacer par 300 pi de la solution anti-TM4SF1-anticorps. Incuber 2 h à la température ambiante ou à laisser une nuit à 4 ° C.
- Laver chaque puits avec pas moins de 500 pi de PBS. Répétez 3x; chaque fois donner à least 5 min de temps d'incubation.
- Préparer une solution d'anticorps et phalloïdine secondaire dans CPI du tampon de blocage, à l'aide d'un mille fois la dilution de l'Alexa 488 d'anticorps secondaire d'âne anti-souris marquée (2 ug / ml de concentration finale) et 1000 x dilution de la phalloïdine (50 ng / ml de concentration finale).
- Retirer du PBS et ajouter 300 ul de l'anticorps secondaire et solution de phalloidin à chaque puits et incuber pendant 2 heures ou laisser toute la nuit à 4 ° C.
- Répétez PBS étapes de lavage avec au moins une incubation de 5 min par lavage. Dans le dernier lavage, laisser chaque puits dans du PBS pendant 1 h.
- Tomber une seule goutte (~ 10 pi) de montage anti-fade médias sur une lame de verre.
- Pliez la pointe d'un 19 G 1 ½ à aiguille de la seringue de 90 ° en appuyant doucement sur une surface dure. Utilisez une main pour tenir l'aiguille pliée et soulevez délicatement un disque de verre du bien, et utiliser l'autre main pour saisir le disque à l'aide des pinces acérées.
- Tournez le disque de verre &# 160; face vers le bas en laissant le contact côté de la cellule du milieu de montage sur la lame de verre. Placez délicatement le disque de verre et laissez-le sécher pendant la nuit dans un endroit sombre à température ambiante.
- Passez à l'image de la immunofluorescence teinté nanopodia, ou de stocker les lames dans une boîte à lames à -20 ° C. Les diapositives seront rester visibles pendant quelques mois en -20 ° C.
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Résultats
Pour l'étape 1:
Si les cellules (comme les cellules HUVEC et PC3 utilisée dans cette étude) sont capables de se développer normalement, les cellules se fixent sur le disque revêtu de collagène dans les 30 minutes après ils sont ensemencées, polarisent et deviennent mobiles peu après, et s'étendent nanopodia avance sur leur chemin de mouvement. figures 1A et 1B montrent respectivement un polarisée et la prolifération des cellules HUVEC. figure 2A...
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Discussion
Nanopodia sont des canaux membranaires cellulaires minces qui se fixent solidement à la matrice par TMED et peuvent s'étendre à plus de 100 um d'une cellule polarisée mobile pour détecter l'environnement et la médiation des interactions intercellulaires 2,3. Nanopodia adhérer à la matrice si bien que les résidus sont laissés comme les cellules s'éloigne (figures 1 et 2). Nanopodia permet donc d'étudier comment les cellules sentent leur environnement et de ...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous reconnaissons le Dr Harold Dvorak pour des discussions utiles, y compris la suggestion d'essayer fixation à 37 ° C PFA. Ce travail a été soutenu par NIH P01 CA92644 et par un contrat de la Fondation nationale pour la recherche sur le cancer.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Disques en verre | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm de diamètre |
| Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Pots à bords droits, 4 oz | |
| Lame en verre | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Tube Falcon | BD Falcon | 352070 | Tube à centrifuger conique en polypropylène haute clarté de 50 ml, indice RCF de 16 000. Stérile. |
| Tube Falcon de 15 ml avec support en polystyrène | Corning | 430790 | Corning Tubes à centrifuger en PP de 15 ml |
| Pince tranchante | Fisher Scientific | 13-812-42 | Pince à échardes pointues extra-fines Pince à échardes |
| 24 puits Plaque de culture cellulaire | BD Bioscience | 353047 | 24 puits Plaque de culture cellulaire |
| 150 mm Plaque de culture cellulaire | BD Bioscience | 353025 | 150 mm |
| 19 G 1 et frac12 ; Aiguille à seringue | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ ; |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon’s Pure Ethanol 200 Proof |
| Solution de collagène | BD Bioscience | 354249 | Collagène I, haute concentration, queue de rat, 100 mg |
| Trypsine/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0,25 % Trypsine-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM haute teneur en glucose (1x), liquide, avec L-glutamine, sans pyruvate de sodium |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, solution 10x, pH 7,4 |
| PFA (paraformaldéhyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4 % dans PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Sérum de veau fœtal |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml et EGM-2 SingleQuot Kit Supplément & Facteurs de croissance |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilisé dans l’eau. 4 % solution mère et la concentration de travail est de 0,4 %. |
| Anticorps anti-humain TM4SF1 de souris ; | Millipore | MAB3127 | L’épitope est situé dans le domaine extracellulaire |
| Anticorps anti-CD9 humain de souris ; | BD Bioscience | 555370 | L’épitope est situé dans le domaine extracellulaire |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-souris 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugué Phalloidin |
| Anti-fade support de montage ; | Life Technologies | P-36931 | Réactif anti-décoloration ProLong Gold avec DAPI |
| 70 % d’éthanol. | 17,5 ml d’éthanol (200 proof) 7,5 ml d’eau doublement désionisée | ||
| 10x PBS (environ 200 ml) | 20 ml de 10x PBS 180 ml d’eau doublement désionisée | ||
| 20 % Triton X-100 (soit 20 ml) ; | 4 ml Triton X-100 16 ml d’eau doublement désionisée | ||
| 4 % NaN3 (soit 25 ml) | 1 g de NaN3 25 ml d’eau doublement désionisée | ||
| 50 ng/ml Solution de collagène bovin dans du PBS (soit 5 ml) | Solution mère de 50 &mu ; g/ml (50 ml) 830 &mu ; l de collagène I (3 mg) 50 ml | ||
| de tampon de blocage PBS ICC (50 ml) | 49 ml de PBS 2 % FBS (ajouter 1 ml) 0,04 % NaN3 (ajouter 100 &mu ; l de 4 % NaN3) | ||
| Tampon de blocage ICC/0,01 % Triton X-100 (environ 50 ml) | 50 ml de tampon de blocage ICC 25 &mu ; l de 20 % Triton X-100 | ||
| HUVEC ; | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Hotte de culture cellulaire | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Série 60) Armoire de sécurité biologique ; |
| 37 ° ; C, 5 % CO2 Incubateur de culture cellulaire ; | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Coussin chauffant pour incubateur à enveloppe d’eau |
| ; | K& H Manufacturing | 1020 | K& H Lectro Coussin chauffant pour chenil avec couverture en non-tissé libre (www.amazon.com) |
| Centrifugeuse | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Centrifugeuse de paillasse |
| Hémocytomètre | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
Références
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Réimpressions et autorisations
