Une microplaque de dosage rapide et spécifique pour la détermination de l'ascorbate intra-et extracellulaire dans les cellules cultivées

Résumé

Ascorbate joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement mis en lumière au cours des dernières années. Nous décrivons ici un débit moyen, dosage de microplaques spécifique et peu coûteux pour la détermination de l'ascorbate à la fois intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

Résumé

La vitamine C (ascorbate) joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement venir à la lumière au cours des dernières années. Par exemple, dans le cerveau, l'ascorbate agit d'une manière neuroprotecteur et neuromodulateur qui implique vélo ascorbate entre les neurones et les astrocytes vicinaux - une relation qui semble être essentiel pour le cerveau ascorbate homéostasie. En outre, la preuve émergente suggère fortement que l'ascorbate a un rôle considérablement élargi dans la régulation du métabolisme du fer cellulaire et systémique que classiquement reconnu. La reconnaissance croissante du rôle intégrante de l'ascorbate dans la physiologie cellulaire et organismique normale et déréglementé exige une gamme de moyen-débit et haute sensibilité des techniques analytiques qui peuvent être exécutées sans avoir besoin d'équipement spécialisé très coûteux. Ici, nous fournissons des instructions explicites pour un débit moyen, essai de microplaques spécifique et relativement peu coûteux pour la détermination de boe ascorbate intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

Introduction

La découverte de la nature chimique de l'acide ascorbique (vitamine C), et son identification comme le «facteur anti-scorbutique" longtemps cherché, par Albert Szent-Györgyi et d'autres dans les documents publiés de 1928 à 1934 ¹ étaient événements marquants dans l'histoire de la biochimie. En effet, ces découvertes ont contribué à Szent-Györgyi est attribué le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1937. L'ensemble toujours croissant de rôles pour l'ascorbate en physiologie animale et végétale, ainsi que la santé humaine, continuent à être les sujets de scientifique active enquête et de controverse.

L-ascorbate est un réducteur physiologique abondante et cofacteur enzymatique dans des systèmes de mammifères, et contribue à de nombreuses réactions enzymatiques impliquant bien définies hydroxylation du collagène, de la carnitine et de la norépinéphrine la biosynthèse, le métabolisme de la tyrosine et de l'hormone de peptide amidation ^2. Curieusement, evide de montagence suggère que l'ascorbate joue un rôle dans la stimulation d'autres dioxygénases de fer-dépendants, tels que les hydroxylases prolyl et asparaginyle impliquées dans le ciblage et l'hydroxylation des facteurs inductibles par l'hypoxie (HIF) et 1α 2α ^3. Un rapport récent suggère que l'ascorbate joue un rôle dans la maturation des lymphocytes T en affectant la chromatine déméthylation via son activité en stimulant les hydroxylases nucléaires, Jumonji C (JmjC) protéines de domaine; ce dernier qui semble exiger ascorbate de pleine activité ^4. En effet, la stimulation de ces enzymes par ascorbate semble se produire par un mécanisme similaire à la stimulation par l'ascorbate de collagène et les HIF hydroxylases. Parmi d'autres effets classiques, ascorbate contribue de manière significative à l'anti-oxydation cellulaire en tant que chaîne de tomber en piégeur de radicaux soluble dans l'eau ⁵ et au recyclage de la membrane plasmique α-tocophérol (vitamine E) par l'intermédiaire de la réduction du radical α-tocophéroxyles ^6, which est important dans la protection contre peroxydation des lipides membranaires ^7. Il est important, bien que la plupart des mammifères sont capables de novo la synthèse hépatique de l'ascorbate de D-glucose, les primates supérieurs, des cobayes et des chauves-souris dépendent de sources alimentaires de vitamine ^8. Cela est dû à l'inactivation du gène GULO, les orthologues de non affectées chez les mammifères qui codent pour l'enzyme, γ-gulono-lactone oxydase ^9-13. Cette enzyme est requise pour la réaction finale dans la biosynthèse de l'ascorbate de ¹³ glucose.

Après absorption de transporteur à médiation par de la lumière intestinale chez l'homme, l'ascorbate est distribué dans tout le corps par le système circulatoire. La vitamine se trouve généralement dans sa forme réduite à des concentrations millimolaires intracellulaire (à l'exception notable des érythrocytes dans laquelle les concentrations sont généralement similaires à la concentration plasmatique en vigueur), et au concentré micromolesentrations (par exemple 50-200 pM) dans la plupart des liquides extracellulaires ^14,15.

Dans des conditions physiologiques, l'ascorbate subit typiquement une oxydation à un électron réversible au radical ascorbyle libre (AFR, également connu sous le nom monodehydroascorbate ou semidehydroascorbate). Alors que l'AFR est un radical relativement stable ^16, en l'absence de son rapide à un électron réduction enzymatique de retour à l'ascorbate, deux RAS peut encore dismuter à un ascorbate et un déshydroascorbate (DHA) ^9,13,17. A l'intérieur de la cellule, le produit d'oxydation à deux électrons de l'ascorbate, le DHA, peut être rapidement ramené en arrière à l'ascorbate et de la glutathion-NAD (P) H-enzymatique de charge et des réactions non enzymatiques ^13.

S'il est classiquement admis que seulement le rôle important de l'ascorbate dans le métabolisme du fer est de stimuler l'absorption alimentaire de fer non hémique ^18, nous et d'autres avons fourni des preuves dece qui suggère que l'ascorbate trongly joue un rôle considérablement élargi dans le métabolisme de ce métal. Tout d'abord, l'ascorbate qui est libérée par les cellules de l'ascorbate-remplie semble jouer un rôle important dans la modulation de l'absorption du fer non lié à la transferrine par les cellules ^19,20, et la preuve très récente indique que l'ascorbate module également l'absorption du fer lié à la transferrine par des cellules ^21, cette dernière, qui correspond à une importante absorption physiologique de fer-voie ^22.

Ascorbate est essentiel pour la fonction normale du système nerveux central chez les mammifères ^23,24. En collaboration avec le cortex, de l'hypophyse, du thymus, de la rétine et du corps jaune surrénale, le cerveau contient des concentrations élevées de l'ascorbate par rapport à d'autres tissus de l'organisme ^23,25-27. De plus, l'exposition à la fois les astrocytes et les cellules ^28,29 analogues à des neurones ³⁰ de glutamate est connu pour déclencher la libération de l'ascorbate dans l'espace extracellulaire, où l'ascorbatee est pensé pour aider à protéger les neurones contre la dysfonction neuronale induite par le glutamate ^31. Bien que le mécanisme exact de induite par le glutamate-ascorbate de presse des astrocytes est inconnue, nous avons récemment apporté des preuves indiquant l'implication de la cellule gonflement causé par une capture de glutamate par le glutamate des astrocytes et de l'aspartate transporteur (GLAST, également appelée acide aminé excitateur transporteur isoforme 1 [EAAT1 ] chez l'homme) et l'activation consécutive de osmolyte et d'anions canaux de volume sensible (VSOACs) qui sont perméables à de petits anions organiques tels que l'ascorbate ^32. Les identités moléculaires des conduits de membranes plasmatiques impliquées dans la formation VSOAC restent à identifier ^33,34.

Bien que de nombreux essais ont été développées pour la détermination de l'ascorbate dans des échantillons biologiques, qui comprennent les dosages spectrophotométriques, fluorimétriques et ^35,36 chromatographiques, il existe une grande variabilité dans la spécificité, la sensibilité, interference par les contaminants chimiques, la gamme linéaire efficace et la stabilité de l'analyte du point de terminaison. En outre, d'autres facteurs importants qui influent sur le choix de test sont la rapidité, la facilité d'utilisation et l'accès à un équipement relativement spécialisé, comme une chromatographie liquide à haute performance (CLHP) appareil.

Ici, nous présentons un dosage simple et hautement spécifique microplaque colorimétrique pour la détermination de l'ascorbate intracellulaire dans des cellules cultivées, ainsi que d'un essai séparé pour la détermination de l'ascorbate-efflux de cellules en culture. Le dernier test a pour but de contourner le problème de la sous-estimation de l'ascorbate de presse à partir de cellules en raison de ré-absorption rapide de l'ascorbate libéré par les transporteurs d'ascorbate de sodium-dépendant (SVCTs). Bien que ces deux méthodes ont fait leur apparition dans certaines de nos publications précédentes ^{19,20,32,37,38,} ce manuscrit fournit un ensemble explicite des instructions et des lignes directrices pour leur exécution effective.

Protocole

1. Déterminer ascorbate intracellulaire dans les cellules cultivées

1. culture cellulaire et la récolte
   1. Cultivez suspension (par exemple érythroleucémique humaine, K562) ou des cellules adhérentes (par exemple, les astrocytes primaires) en utilisant des procédures standard de culture ^19-21,32,38. Remarque: pour assurer cellules contiennent ascorbate, charger les cellules en culture avec de l'ascorbate soit comme l'ascorbate ou DHA ^33,39.
2. Créez un extrait cellulaire contenant de l'ascorbate-
   1. Incuber un nombre approprié de tampon phosphate salin de suspension (PBS) à la chaux ou de cellules adhérentes avec 450 pi de glacée cellulaire perméabilisation tampon [CPB; 0,1% (p / v) de saponine dans du PBS; 4 ° C]. Remarque: Déterminer le nombre de cellules nécessaires pour obtenir une valeur d'absorbance dans la plage linéaire du dosage (voir ci-dessous) de façon empirique par l'utilisateur final. Remarque: les extraits de tissus peuvent également être utilisés (voir discussion pour plus de détails).
   2. Agitacellules te sur la glace pendant 10 minutes pour assurer la lyse cellulaire complète.
   3. Créer un extrait intracellulaire contenant de l'ascorbate-clarifiée par élimination des débris cellulaires par centrifugation du lysat brut à 16 000 xg pendant 5 min dans une microcentrifugeuse réfrigérée (4 ° C).
   4. Retirez délicatement 4 x 100 aliquotes de chaque échantillon et ajouter à une séquence horizontale de puits dans une plaque 96 puits à fond plat qui contient soit 25 pl / puits de PBS ("-AO") uniquement ou 25 pl / puits de 45,5 U / ml solution mère de L-ascorbate-oxydase (AO) dans du PBS ("+ AO"). Remarque: cela devrait être fait en parallèle avec la préparation des normes (voir ci-dessous).
3. Ascorbate standard courbe construction (doit être construit à nouveau pour chaque essai)
   1. Préparer une solution stock de 10 mM d'acide ascorbique dans PBS glacé. Remarque: Vérifier la concentration d'ascorbate par spectrophotométrie en utilisant une cuvette de quartz avec un 1cm de longueur de chemin à 265 nm (coefficient d'extinction = 14,5 mM ^-1 cm ^{-1) 40.}
   2. Préparer avec soin une série de normes d'ascorbate entre 0 et 20 uM.
   3. En parallèle à l'étape 1.2.4, retirez soigneusement 4 × aliquotes 100 ul de chaque norme et ajouter à une séquence horizontale de puits dans une plaque 96 puits à fond plat qui contient 25 pl / puits de PBS ("-AO») ou une 45,5 U / ml de solution de AO dans du PBS ("+ AO"). Note: 100 pi des normes d'ascorbate ci-dessus contiennent 0-2 nmol d'ascorbate. S'il vous plaît noter que le but de l'AO est de contrôler la contribution de réducteurs non-ascorbate de ferricyanure réduction.
4. Déterminer ascorbate intracellulaire - Étape 1: éliminer sélectivement l'ascorbate et quantitativement oxyder ascorbate de ferricyanure
   1. Orbitale mélanger la plaque de 96 puits à 550 rpm à température ambiante pendant 5 min dans l'obscurité en recouvrant la plaque en aluminium. Remarque: Tson étape devrait oxyder tout ascorbate dans les puits "+ AO" à DHA. Les puits "-AO" devraient être affectés.
   2. Ajouter 50 ul de 3,5 mM de ferricyanure de potassium (ci-après dénommé "le ferricyanure») dans du PBS à chaque puits. La finale [ferricyanure] = 1 mM. Remarque: Utilisez un multipipettor.
   3. Orbitale mélanger la plaque à 550 rpm à température ambiante pendant 5 min dans l'obscurité. Remarque: Cette étape doit conduire à la réduction de ferricyanure en ferrocyanure par l'ascorbate dans un rapport stoechiométrique de deux molécules de ferricyanure réduits par une molécule d'ascorbate oxydé.
   4. Ajouter immédiatement 25 pi d'une solution fraîchement construit contenant 50% (v / v) d'acide acétique et 30% (p / v) d'acide trichloroacétique (TCA). Remarque: Utilisez un multipipettor.
5. Déterminer ascorbate intracellulaire - Etape 2: quantifier la quantité de ferrocyanure formé ³⁷
   1. Ajouter 100 ul de solution de ferrocyanure ³⁷ détermination de each bien. Note: Une solution de travail doit être faite immédiatement avant utilisation: 2 ml de 3 M d'acétate de sodium (pH 6,0); 0,5 ml d'acide acétique glacial (~ 17,4 M d'acide acétique); 2 ml de 0,2 M d'acide citrique; 2 ml de 3,3 mM FeCl ₃ à 0,1 M d'acide acétique; 1 ml de 30 mM Ferene-S. Le volume final de cette solution de travail doit être de 7,5 ml.
   2. Orbitale mélanger la plaque dans l'obscurité à 550 tours par minute pendant 30 min à température ambiante.
   3. Lire les valeurs d'absorbance des puits à 593 nm (c'est à dire le maximum d'absorbance du Fe (II) (Ferene-S) ₃ complexe).
   4. Calculez le montant de l'ascorbate intracellulaire nmoles ascorbate par million de cellules en soustrayant d'abord les A ₅₉₃ valeurs _nm pour les puits de la '+ AO' des correspondants - puits "AO" pour chaque échantillon, puis l'interpolation de la courbe standard de l'ascorbate (voir l'étape 1.3 ). Lors de la construction de la courbe standard, tracer cette «valeur de la différence» pour chaque norme sur le montant des ascorbmangé par puits.

2. Détermination de l'ascorbate-efflux de cellules en culture

1. culture cellulaire et la récolte
   1. Cultivez suspension ou de cellules adhérentes comme ci-dessus (voir l'étape 1.1). Remarque: effectuer le dosage ci-dessous dans un format plat de 24 puits avec la suspension et les cellules adhérentes pour obtenir les meilleurs résultats.
   2. cellules en suspension Resuspendre, ou de superposer les cellules adhérentes, avec 400 ul de pré-chauffé une solution saline tamponnée par HEPES, avec ou sans calcium et magnésium, et contenant 5 mM de D-glucose (HBS / D; pH 7,3, 37 ° C) dans des puits d'une plaque de 24 puits. Ajouter le même volume de HBS / D pour puits sans cellules spécifiées sur chaque plaque de 24 puits à examiner. Remarque: ce dernier servira de contrôles exempts de cellules pour la réaction de base (voir ci-dessous).

3. Déterminer le montant de l'ascorbate Paru

1. Les solutions mères suivantes doivent être préparées à l'avance: 120U / ml AO dans HBS / D (préparer frais); 2,4 mM Ferene-S dans HBS / D; 120 uM FeCl ₃ et 600 um Na-citrate dans HBS / D (préparer immédiatement de solutions mères plus concentrées).
2. Pour démarrer la réaction de ferrireduction (volume final par puits devrait être 600 pi), ajouter les volumes de réactifs aux puits individuels contenant déjà 400 pi de HBS / D suivants:
   1. Ajouter 50 ul de AO (120 U / ml) ou HBS / D pour le jumelage des puits en triple exemplaire. La concentration finale doit être de 10 AO U / ml. Remarque: Étiquette jumelé puits comme "- AO» et «+ AO".
   2. Mélanger les plaques avec un mélange orbital douce pendant 5 min à 37 ° C.
   3. Ajouter 50 ul de 2,4 mM Ferene-S dans tous les puits. La concentration finale Ferene-S devrait être de 200 uM. Mélanger les plaques comme ci-dessus pendant 5 minutes à 37 ° C.
   4. Ajouter 50 ul de fraîchement préparé 120 uM citrate ferrique. La finale en fer et concentrations de citrate devraient être 10 uM fer et 50 uM citrate. Mélangez bien.
3. En trois puits de contrôle triple, aspirer le milieu de recouvrement et ajouter 600 ul HBS / D contenant 0,1% de saponine. Remarque: Ceux-ci serviront de «100% des cellules lyse" contrôles pour une lactate déshydrogénase (LDH) version d'essai qui se déroulera en parallèle (voir ci-dessous).
4. Incuber pendant 60 min à l'obscurité à 37 ° C.
5. A la fin de l'essai d'efflux-ascorbate, aspirer rapidement 500 ul de chaque puits et ajouter marquée de manière appropriée à des puits dans une plaque à 24 puits. Note: pour les cellules en suspension, éliminer initialement les cellules par centrifugation à 4 ° C.
6. Ajouter 300 aliquotes du surnageant à une plaque de 96 puits et ensuite lire à 593 nm.

4. Détermination de l'ascorbate extracellulaire

1. Lire les valeurs d'absorbance des puits à 593 nm.
2. Calculer la quantité d'ascorbate extracellulaire comme l'ascorbate nmoles par mg de protéine (ou par million de cellules), comme décrit pour la détermination de l'ascorbate intracellulaireà l'étape 1.5.4. Remarque: l'utilisateur final doit optimiser les conditions pour que l'ascorbate de presse n'est pas limitée par l'ascorbate intracellulaire.

5. Détermination de la LDH de sortie

1. Avec les 200 ul restants de la solution extracellulaire à partir de chaque échantillon, effectuer un dosage de libération de LDH ^32,41 pour déterminer l'étendue de la lyse cellulaire. Remarque: le calcul en% de la LDH libérable totale. Déterminer LDH libéré à partir des échantillons qui ont été traités avec 0,1% de saponine.

Résultats

Détermination de l'ascorbate intracellulaire dans les cellules de suspension de culture

Dans le premier essai (figure 1), l'ascorbate intracellulaire est déterminée, à la suite de l'ascorbate-spécifique (c.-à-AO-sensible) la réduction du ferricyanure en ferrocyanure, à l'aide de la détermination hautement sensible de ferrocyanure par un mode opératoire déjà publié ^37. La détection de l'ascorbate est basée sur la colorimétrie chélation du fer ferreux qui est ...

Discussion

Dans ce document, nous présentons deux dosages colorimétriques des microplaques rapides, précis et relativement sensibles pour la détermination de l'ascorbate dérivé de compartiments intra-et extracellulaires dans les cellules cultivées. Les analyses peuvent être complétées par l'accès aux équipements et réactifs de laboratoire standard. Le réactif que modérément coûteux requis pour le dosage est AO, qui est essentielle, car elle donne un degré élevé de spécificité analyte vers L-ascorbat...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nunc Plaques à fond plat à 96 puits	Thermo	269620	N’importe quelle plaque à fond plat à 96 puits peut être utilisée
Microcentrifugeuse de paillasse réfrigérée	Eppendorf	5415D	Une microcentrifugeuse non réfrigérée qui a été équilibrée en fonction de la température dans une chambre froide peut également être utilisée
Centrifugeuse de paillasse réfrigérée	Eppendorf	5810R	Godet pivotant
Spectrophotomètre de microplaques Bio-Rad Benchmark Plus	Bio-Rad		Tout spectrophotomètre de microplaques capable de lire à 593 nm peut être utilisé et est recommandé. Si vous utilisez un lecteur de plaques à filtre, choisissez la longueur d’onde la plus proche possible et utilisez la méthode de la courbe standard.
Ependorf MixMate (mélangeur orbital à microplaques)	Eppendorf		Il s’agit d’un mélangeur de microplaques très polyvalent et fiable qui fonctionne très bien pour ces dosages
Tampons à usage général Solution
saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4
saline tamponnée au MOPS (MBS) ; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7,3
MBS + 5 mM de D-glucose (MBS/D)
Solution saline tamponnée à l’HEPES + 5 mM de D-glucose (HBS/D) ; 137 mM de NaCl, 5,2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2&bull ; 2 H2O, 0,8 mM MgSO4&bull ; 7 H2O, 5 mM de D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7,3)
Tampon de perméabilisation cellulaire (CPB ; 0,1 % de saponine dans le PBS)
Produits chimiques
Acide L-ascorbique ou L-ascorbate de sodium	Sigma-Aldrich		Les préparations de la plus haute pureté doivent être obtenues
Dimère de l’acide déhydro-L-ascorbique (DHA)	Sigma-Aldrich	30790	solutions aqueuses produisent théoriquement 2 moles de monomère de DHA par mole de dimère de DHA
Cytochalasine B	Sigma-Aldrich	C6762	Solutions mères préparées dans du DMSO ou de l’éthanol
Ascorbate oxydase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	solutions mères (120 U/ml) peuvent être préparées dans du PBS ou du MBS puis congelées dans des aliquotes
Ferricyanure de potassium (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&prime ;,5&prime ; Acide disulfonique sel disodique)	Sigma-Aldrich	92940
L-glutamate de sodium	Sigma-Aldrich
L-glutamine	Sigma-Aldrich
Saponine	Sigma-Aldrich	47036	Préparer une solution mère à 0,1 %
Solutions mères pour le dosage de l’ascorbate intracellulaire 3
M acétate de sodium (pH 6,0)
Acide
0,2 M Acide
3,3 mM FeCl3 dans 0,1 M Acide
30 mM ferene-S
50 % (v/v) d’acide acétique + 30 % (p/v) d’acide trichloracétique (TCA)
Solutions mères pour dosage
AO (120 U/ml)
2,4 mM férène-S
0,12 mM FeCl3 dans 0,6 mM de citrate