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Article de méthode

Enregistrement électrophysiologique De

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⸱

DOI :

10.3791/51355

⸱

26 février 2014

 ,  , 
1MCDB, Yale University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l'enregistrement extracellulaire des réponses potentielles d'action tirés par les neurones gustatifs labellar chez la drosophile.

Résumé

La réponse du périphérique goût des insectes peut être puissamment étudié avec des techniques électrophysiologiques. La méthode décrite ici permet au chercheur de mesurer les réponses gustatives directe et quantitative, reflétant l'entrée sensorielle que le système nerveux des insectes reçoit de stimuli du goût de son environnement. Ce protocole décrit les principales étapes de l'exécution de cette technique. Les étapes essentielles de l'assemblage d'un appareil de l'électrophysiologie, tels que la sélection de l'équipement nécessaire et un environnement approprié pour l'enregistrement, sont délimitées. Nous décrivons également comment se préparer à l'enregistrement en faisant électrodes de référence et d'enregistrement appropriés et des solutions exhausteur de goût. Nous décrivons en détail la méthode utilisée pour la préparation de l'insecte par insertion d'une électrode de référence de verre dans la volée pour immobiliser la trompe. On montre les traces des impulsions électriques alimentées par les neurones gustatifs en réponse à un sucre et d'un composé amer. Aspects du protocole sont techniquement difficile et nous incluons une description détaillée de certaines difficultés techniques communes que l'on peut rencontrer, comme l'absence de signal ou de bruit excessif dans le système, et les solutions possibles. La technique a ses limites, comme l'impossibilité de livrer stimuli temporellement complexes, observer fond de tir juste avant stimulus livraison, ou utiliser des composés de goût insolubles dans l'eau facilement. Malgré ces limites, cette technique (y compris les variations mineures mentionnées dans le protocole) est une procédure standard largement accepté pour l'enregistrement des réponses neuronales Drosophila goûter composés.

Introduction

Le sens du goût permet un insecte de détecter une vaste gamme de produits chimiques solubles et joue un rôle important dans l'acceptation d'une substance nutritive, ou le rejet d'un être nocif ou toxique. Le goût est aussi pensé pour jouer un rôle dans le choix du conjoint, grâce à la détection des phéromones 1-5. Ces fonctions importantes et diversifiées ont rendu le système de goût insecte une cible irrésistible de l'enquête sur la façon dont les systèmes sensoriels traduisent les signaux environnementaux en sorties comportementales pertinentes.

L'unité principale du système de goût de Drosophila melanogaster est le poil de goût, ou sensille. Molécules entrent dans le sensille via un pore à son extrémité 2,6. Sensilles se trouvent sur ​​le labelle, les jambes, le bord de l'aile, et le pharynx 6. Sur le labelle, le nombre et l'emplacement des sensilles est stéréotypés. Il existe trois classes morphologiques de sensilles fonction de la longueur: long (L), intermédiaire (I), et court (S ) Sensilles 7,8. Chaque sensille contient soit deux (de type I) ou quatre (L-et S-type) neurones récepteurs gustatifs (GRNS 9). Différents GRNS répondre aux différentes catégories de stimuli du goût: amer, le sucre, le sel et l'osmolarité 7,10 et expriment différents sous-ensembles de récepteurs gustatifs 8,11-13. Seulement I et de type S sensilles contiennent GRNS amères sensible 8,10. Le projet GRNS au ganglion subesophageal (SOG) et leur activation par des molécules de goût est relayé vers le système nerveux central supérieur pour le décodage, ce qui entraîne une réponse comportementale 6. Le nombre relativement faible de neurones et la susceptibilité à l'analyse moléculaire et comportementale rendre le système de goût Drosophila un excellent modèle pour l'étude des systèmes gustatives en général. La relative facilité avec laquelle le système peut être manipulé par une mutation génétique ou le système d'expression GAL4 UAS est aussi un outil précieux 14,15.

ontenu "> Parce que ces sensilla dépassent de la surface de la labellum, ils sont d'excellentes cibles pour l'électrophysiologie. L'allumage des GRNS peut être contrôlée en utilisant l'enregistrement extracellulaire. Historiquement, le procédé d'enregistrement de paroi latérale, qui utilise une électrode de verre inséré dans le sensille pour enregistrer l'activité neuronale, 26 a été la méthode d'enregistrement d'extrémité, qui mesure la réponse des neurones avec une électrode utilisée. Cependant, cette méthode est techniquement difficile à réaliser, et il est difficile d'enregistrer pendant longtemps à partir de chaque préparation. que délivre simultanément un exhausteur de goût, devenu depuis la méthode de choix 9,16. Il a été utilisé pour étudier le système de goût de Drosophila melanogaster 8,10,17,18 ainsi que d'un certain nombre d'autres espèces d'insectes 19-23. Elle a été grandement facilité par le développement de l'amplificateur tastePROBE, qui a surmonté l'un des principaux inconvénients de la méthode d'enregistrement de pointe en compensantla grande différence de potentiel entre l'électrode de référence et la sensille d'insecte, ce qui permet les potentiels d'action de GRN à être enregistrées sans amplification excessive ou de filtrage 24. Un autre développement important a été l'utilisation de tricholine citrate comme électrolyte enregistrement 25. STC supprime les réponses du GRN de l'osmolarité sensible et ne stimule pas la GRN sensible au sel, faire les réponses générées par tastants amères et le sucre beaucoup plus facile à analyser 25.

Nous décrivons ici l'enregistrement de la drosophile labellar sensilles de pointe est actuellement effectué dans le laboratoire Carlson. Ce protocole explique comment établir une plate-forme appropriée de l'électrophysiologie, la façon de préparer la volée, et la façon d'effectuer des enregistrements de goût. Nous présentons également des données représentatives obtenues par l'enregistrement de sous-ensembles de la drosophile sensilles, ainsi que certains problèmes courants et les solutions possibles qui peuvent survenir lors de l'utilisation de cettetechnique.

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Protocole

Le protocole suivant est conforme à toutes les directives de protection des animaux de l'Université de Yale.

Une. Réactifs et Préparation du matériel

  1. Installation de matériel d'enregistrement (figure 1A).
    1. Choisissez une chambre pour la configuration de plate-forme qui est exempte de grosses variations de température ou d'humidité et aussi isolé des sources de bruit électrique et mécanique, tels que les réfrigérateurs et les centrifugeuses.
      figure-protocol-1
      Figure 1. (A) Vue d'ensemble de la configuration d'enregistrement de forage. Stéréomicroscope (a) est monté sur la plate-forme anti-vibration (b). Electrode de référence titulaire (c) est monté sur la plate-forme en face de la headstage (d), par l'intermédiaire de micromanipulateurs. Un tube en matière plastique de sortie (e) délivrer des trains d'air humidifié dirigé vers la préparation de la mouche est également monté sur til plateforme. Le headstage est connecté à l'amplificateur (f), qui est relié au système d'acquisition numérique (DAS) (g), qui est relié à un ordinateur (h). (B) Configuration d'électrodes et le tube de sortie:. Électrode de référence sur la gauche, l'électrode d'enregistrement sur ​​la droite, et le tube de sortie de flux d'air dirigé à la préparation à la mouche Cliquez ici pour agrandir l'image.
    2. Mont stéréomicroscope au centre de la table anti-vibration ou plate-forme.
    3. Fixez micromanipulateurs pour la préparation électrode de référence / contre les insectes et headstage / électrode d'enregistrement à gauche et à droite du microscope, respectivement, en utilisant des stands magnétiques.
    4. Mont tube en matière plastique de sortie dans une troisième micromanipulateur à l'arrière du microscope, orienté de telle sorte que l'ouverture du tube est dirigé vers l'emplacement de préparation mouche (voir figure 1B).
    5. Utilisant un tube en plastique souple, àTube en matière plastique de sortie du tachymètre à une fiole à vide partiellement remplie d'eau. Raccorder une petite pompe à air pour aquarium à bulles à travers l'eau dans le ballon, en engendrant un courant d'air humidifié à travers le tube en matière plastique de sortie vers la volée.
    6. Mont fibre optique source de lumière sur la table de vibration, orientant les sorties pour éclairer la préparation en réfléchissant la lumière par un morceau de papier blanc de carte directement en dessous de la préparation. Assurez-vous que la source de lumière ne repose pas sur la table. Remarque: l'avantage de refléter la source de lumière sur un disque de papier est double: il améliore le contraste, ce qui sensilles plus facile à visualiser, et il empêche le chauffage de la préparation qui résulterait de la lumière directe.
    7. Branchez amplificateur tastePROBE dans le système d'acquisition numérique (DAS), et le DAS dans un ordinateur personnel, conformément au manuel de fournisseur. Branchez la pédale de déclenchement à organiser et sous l'espace de travail. Remarque: les prises murales électriques isolés pour l'amplificateur et DAS sont hautement souhaitablemesure.
    8. Électriquement terre microscope, micro-manipulateurs, et source de lumière par la connexion des composants métalliques de table à l'aide des pinces crocodiles et des longueurs de fil électrique isolé et ruban électrique. Électriquement terre plate-forme de métal en se connectant à la construction de sol ou DAS, qui est relié à la terre par prise d'alimentation.
    9. Installez le logiciel d'acquisition approprié pour la DAS de choix sur l'ordinateur personnel. Remarque: Assurez-vous que les pilotes d'acquisition numériques sont compatibles avec le système d'exploitation sur le PC.
    10. Configuration d'amplification de logiciel (10-100X), le filtrage du signal (typiquement un filtre de Bessel passe-bande réglable de 100 Hz à 3 000 Hz) et la fréquence d'échantillonnage (d'au moins 10 KHz). Remarque: les amplitudes de signaux de neurones gustatifs sont typiquement dans la gamme mV 0,5-2, si l'échelle d'affichage est réglé pour faciliter leur visualisation. Remarque: Le filtre de 100 Hz permet d'exclure le bruit électrique parasite, mais il modifie la forme de pointes et peut faire de pointe pic tri more contester. En variante, un filtre de 1 Hz peut être utilisé.
    11. Eventuellement, une cage de Faraday peut être mis en place tout autour de la table de vibration. Cependant, de petites feuilles de papier d'aluminium sont généralement suffisantes pour réduire le bruit généré par le milieu extérieur ou de l'investigateur.
  2. Préparation de l'électrode de verre
    figure-protocol-2
    Figure 2. Référence et d'enregistrement des électrodes. Photographie sous un grossissement de capillaires en verre tiré dans l'électrode de référence, avec (A) et sans (B) pointe cassé, et des électrodes d'enregistrement (C). Barre blanche représente 2 mm. Cliquez ici pour agrandir l'image.
    1. Tirez la référencel'électrode à partir d'un capillaire en verre à l'aide d'un instrument de traction pipette. Remarque: Les paramètres exacts du programme pipette de traction varient d'un instrument à l'. Essayez d'atteindre un très long cône progressif. La taille des pores à la pointe n'est pas cruciale, car la pointe sera brisé avant la préparation de la mouche (Figures 2A et 2B), mais assurez-vous que le diamètre de la longueur conique de l'électrode n'est ni trop mince, ce qui ne permettra pas suffisante immobilisation de la labellum, ni trop grand, ce qui pourrait endommager les neurones gustatifs ou une rupture des glandes salivaires.
    2. Tirer électrode d'enregistrement à partir d'un capillaire en verre de borosilicate avec filament en utilisant une pipette instrument de traction. Essayer d'atteindre une conicité qui est moins profonde que celle de l'électrode de référence, et un diamètre de pores d'environ 10 à 15 um (figure 2C) 28.
  3. Solutions exhausteur de goût préparation
    1. Utilisez solution Ringer Beadle-Ephrussition (B & E) comme électrolyte de l'électrode de référence. Pour faire un litre de B & E, dissoudre 7,5 g de NaCl, 0,35 g de KCl, et 0,279 g de CaCl2 ∙ 2H 2 O dans un litre d'eau ultra-pure. Rangez les petites aliquotes à -20 ° C.
    2. Utiliser 30 mM de citrate de tricholine solution (TCC) comme électrolyte de l'électrode d'enregistrement et d'un solvant pour les solutions 25 exhausteur de goût, si les réponses amères ou sucre GRN doivent être mesurés. En variante, mM de solution de chlorure de potassium de 1 à 3 peut être utilisé si les réponses de la cellule de l'eau sont à mesurer.
    3. Pour rendre les solutions exhausteur de goût, peser quantité appropriée d'exhausteur de goût sous forme de poudre et ajouter à la CCI de faire une concentration de stock initial. Utilisez cette fonction pour faire des dilutions en série de ce stock initial pour obtenir la concentration souhaitée pour le test. Remarque: Si tastants ne se dissolvent pas facilement dans l'eau, un autre solvant tel que l'éthanol, peut être utilisé pour faire de concentration stock initial. Une solution de contrôle approprié de la CCT et de solvant sans exhausteur de goûtdoit être utilisé dans ce cas.
    4. aliquotes de magasins à long terme à -20 ° C. Stocker une partie aliquote d'une solution de travail d'exhausteur de goût à 4 ° C pour une utilisation pour l'enregistrement de plus d'une semaine, en fonction de propriétés chimiques du exhausteur de goût.

2. Préparation Drosophila

figure-protocol-3
Figure 3. Préparation de la mouche pour l'enregistrement. (A) la position d'insertion de l'électrode de référence dans thorax dorsal de la mouche. La flèche blanche indique l'électrode de référence. (B) La position intermédiaire de l'électrode de référence: avancé à travers le cou et la tête, trompe pas encore sortis. (C, D) Volez avec électrode de référence en position finale avec la pointe d'électrode à l'intérieur labelle, et trompeentièrement déployée. Cliquez ici pour agrandir l'image.

  1. Recueillir les mouches nouvellement éclos pour l'enregistrement à partir de cultures de mouche bien entretenues, cultivées sous-et des conditions de température à humidité contrôlée, et les vieillir 5-10 jours dans des flacons de culture frais avant l'enregistrement.
  2. Réfrigérer plaque de microscope sur la glace pendant 15-30 min avant de préparer mouche.
  3. Remblai électrode de référence en verre avec B & E solution à l'aide d'une aiguille longue et fine en plastique de 0,5 mm de diamètre, comme une aiguille spinale et seringue de 1 ml et tapotez doucement les bulles. Cassez petite quantité de pointe hors aide d'une pince et d'utiliser l'action capillaire à tirer toutes les bulles restantes avec un tissu, en observant sous un microscope à dissection.
  4. Glisser B & E-rempli électrode de référence sur le fil de support d'électrode de référence, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air.
  5. Aspirer voler dans une pointe de pipette P200, en utilisant la mouche aspirateur intégréà partir de tubes, maille, et la pointe de la pipette, 29 place dans un seau à glace et réfrigérer pendant 30-60 sec.
  6. Retirer la plaque de microscope de la glace, essuyez l'humidité, et la position sous microscope. Tapoter doucement décoller de pointe de la pipette sur la plaque de microscope.
    Remarque: la mouche doit être immobilisé suffisamment pour manipuler facilement.
  7. À faible grossissement, retirez délicatement les pattes de devant avec une paire de pinces, tout en maintenant la stabilité du thorax avec l'autre paire de pinces. Placez la mouche sur sa face ventrale, la face dorsale vers le haut. Remarque: Toujours faire attention à ne pas toucher le labelle avec la pince à tout moment pendant le processus de préparation afin de minimiser les dommages mécaniques.
  8. Tout en maintenant la volée en place avec une paire de pinces, insérer l'électrode de référence sur la ligne médiane de la partie postérieure dorsale du thorax. Un angle suggéré d'entrée est d'environ quarante cinq degrés, dans la direction de la tête (figure 3A).
  9. Fixez le electrod de référenceporte-e avec la pâte à modeler de telle sorte que la mouche est visible sous le microscope à fort grossissement. Manoeuvrer et de l'angle de l'électrode de verre à travers le col et la tête, en faisant coulisser la volée vers le porte-électrode de référence au moyen de deux paires de pinces. Remarque: Travaillez rapidement mais en douceur, il est plus facile de réaliser cette étape alors que la mouche est toujours immobilisé contre le froid (figure 3B).
  10. Étendre délicatement la trompe avec une paire de pinces, tout en faisant glisser la volée plus bas de l'électrode de référence de verre, jusqu'à ce que la pointe de l'électrode est à l'intérieur du labelle et la trompe est entièrement déployée (figures 3C et 3D). Note: Prenez soin de ne pas percer une partie du tissu trompe ou distendre le bord du labelle avec l'électrode de référence, car cela pourrait endommager la volée et / ou un goût neurones et affecter la qualité d'enregistrement.

3. Enregistrement à partir Labellar Sensilles

figure-protocol-4
Figure 4. Enregistrement à partir volée. (A) labelle de préparation à la mouche sur la gauche avec l'électrode d'enregistrement aligné pour le contact sur ​​la droite, à fort grossissement. (B) électrode d'enregistrement et sensille unique sur labelle en contact, à fort grossissement. Cliquez ici pour agrandir l'image.

  1. Toujours à la terre en touchant une surface métallique de la table anti-vibration ou plate-forme avant de toucher l'équipement pendant le processus d'enregistrement! Remarque: Il est extrêmement important de ne pas livrer une charge statique à l'headstage car cela peut endommager les circuits.
  2. Sécurisé électrode de référence détenteur de micromanipulateur monté sur la table de l'air de recording plate-forme. Position un lobe de labelle dans le champ de vision du microscope, à fort grossissement (typiquement au moins 140X), et en ligne avec le courant d'air humidifié.
  3. Mettez flux d'air humidifié, ordinateur, DAS, et l'amplificateur. Logiciel d'acquisition ouvert.
  4. Rincer et remplir le verre électrode d'enregistrement avec exhausteur de goût désiré.
    1. Rincer verre électrode d'enregistrement avec de l'eau ultrapure à l'aide d'une seringue et un tube en plastique 28 pour tirer de petites quantités d'eau à travers le tube au moins dix fois.
    2. Rincer électrode d'enregistrement avec exhausteur de goût, au moins cinq fois. Remplir l'électrode d'enregistrement d'environ un tiers à la moitié pleine avec exhausteur de goût et retirer du tube. S'il ya des bulles d'air, appuyez sur pour libérer ou simplement remplir l'électrode.
    3. Faites glisser électrode sur fil d'argent de la headstage rapidement et en douceur afin de ne pas introduire de bulles d'air.
  5. Stimuler unique sensille avec électrode d'enregistrement exhausteur de goût remplie.
    1. Utilisez le micromanipulateur pour amener l'électrode d'enregistrement aligné avec sensille d'intérêt.
    2. Appuyer sur une pédale pour déclencher le mode de l'amplificateur d'acquisition.
    3. Avancer l'électrode d'enregistrement avec le bouton de réglage fin de micromanipulateur soigneusement jusqu'à ce qu'il entre en contact avec la pointe de sensille et l'enregistrement commence.
    4. Retirer l'électrode après 1-2 sec.
    5. Répétez l'étape 3.5 avec d'autres sensilles, si désiré. Remarque: Attendez au moins 1 minute entre les présentations à la même sensille. Si l'enregistrement avec un exhausteur de goût unique pendant une période de temps prolongée, la solution d'exhausteur de goût peut sécher la solution et à la pointe peut devenir plus concentré. Cela peut être résolu en mettant en contact en douceur de la pointe de l'électrode de verre avec du papier lisse pour éliminer une petite quantité de liquide par capillarité.
  6. Pour enregistrer les réponses à un autre exhausteur de goût, rincer et l'électrode d'enregistrement de la charge avec une nouvelle exhausteur de goût et répétez l'étape 3.4. Remarque: Bien rincer l'électrode entre tastants est absolutely cruciale pour éviter la contamination croisée.
  7. Enregistrer les fichiers de données périodiquement des informations d'identification, telles que la date, le génotype, et sapides. Remarque: Il est important de garder une trace écrite de l'exhausteur de goût et de l'identité de chaque sensille présentation pendant la session d'enregistrement pour l'analyse des données.

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Résultats

La figure 5A montre la réponse d'un L sensille à un sucre, le saccharose. Le même sensille ne répond pas à un composé amer, la berbérine. Figure 5B montre que l'sensille de type I, qui contient un neurone sensible amer, affiche de plus grands pics d'amplitude en réponse à la berbérine, et de plus petites pointes d'amplitude en réponse au saccharose. L sensilles afficher une réponse de fond minimale pour le contrôle solvant, TCC, alors que je sensilles afficher pratiqueme...

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Discussion

Sensilla Labellar varient dans la facilité d'enregistrement en raison de différences de morphologie et de l'organisation anatomique. Parfois, un sensille ne répond pas à toutes les substances sapides, même celui qui est connu pour déclencher une réponse positive. La fréquence à laquelle cela se produit varie en fonction du type sensille. L sensilles sont les plus constamment réceptifs et sont relativement faciles d'accès en raison de leur longueur. En général, S sensilles sont toujours sensibles, mais leur c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de 1F31DC012985 prédoctorale NRSA (à RD) et par des subventions du NIH à JC

Nous tenons à remercier le Dr Weiss Linnea des commentaires utiles sur le manuscrit, le Dr Ryan Joseph pour aider les compiler les chiffres, et le Dr Frédéric Marion-Poll pour des conseils techniques utiles. Nous tenons également à remercier les précieux commentaires de quatre auteurs.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope stéréo zoomOlympusSZX12 DFPLFL1.6x PF oculaires : WHN10x-H/22capable d’un grossissement de ~150X avec longue distance de travail support de table
antivibratoireKinetic SystemsBenchMate2210
MicromanipulateursNarishigeNMN-21
Supports magnétiquesENCOModèle #625-0930
Référence Porte-électrodeHarvard AppareilESP/W-F10NPeut être monté sur une pipette sérologique de 5 ml pour une portée étendue
Silver WireWorld Precision InstrumentsAGW15100,3-0,5 mm de diamètre
d’autoclavegénérique
Sortie Tubegénérique, 1 cm
de diamètre Tube en plastique flexibleNalgene8000-0060VI grade 1/4 de diamètre intérieur  ;
conique de 500 mlgénérique, avec bras latéral
Pompe d’aquariumJardins aquatiquesPompe à air 2000
Source de lumière à fibre optiqueDolan-Jenner IndustriesFiber-Lite 2100
Carte blanche/PapierWhatman1001-110
Système d’acquisition numériqueSyntechIDAC-4Alternative : National Instruments NI-6251   ;
HeadstageSyntechDTP-1Tasteprobe
Tasteprobe AmplificateurSyntechDTP-1Tasteprobe
Alligator ClipsGrainger1XWN7N’importe quelle marque est fine
Isolé FilOr générique
Broches de connecteurWorld Precision Instruments5482
Ordinateur personnelDellVostroVérifiez la compatibilité avec le système d’acquisition numérique et les logiciels
Logiciel d’acquisitionSyntechAutospikeAutospike fonctionne avec IDAC-4 ; vous pouvez également utiliser LabView avec
feuille d’aluminium NI-6251 et/ou la cage deBlindage contre le bruit électromagnétique
Capillaires en verre borosilicatéWorld Precision Instruments1B100F-4
Extracteur de pipetteInstrument Sutter CompanyModèle P-87 Pluming/Brown Micropipette Puller
Beadle and Ephrussi Ringer SolutionVoir la recette dans la section protocole
Citrate de tricholine, 65 %  ;SigmaT0252-100G
StéréomicroscopeOlympusVMZ 1x-4xCapable d’un grossissement de 10-40X
SeauGénérique
p200 PointesAiguille spinale générique
TerumoSN*2590
1 ml SeringueBeckton-Dickenson301025
Mouche AspirateurAssemblé à partir de pointes de pipette P1000, d’un tube en plastique flexible et d’un treillis
à modelerPince générique
Outils de science fine Par Dumont11252-00#5SF (pointes super-fines)
Seringue de 10 mlBeckton-Dickinson301029
Tube en plastiqueTygonR-3603
Table Support en plastique Fiole électrique la Faraday à glace de pipette Pâte

Références

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