Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

Résumé

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Utilisant chromatographie liquide normale progressive couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution avec changement de polarité et un cycle de service rapide, nous décrivons un protocole pour analyser la composition métabolique polaire de matériel biologique avec une grande sensibilité, la précision et la résolution.

Résumé

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Toutefois, les plates-formes actuelles ont des facteurs limitants, comme la main-d'œuvre intensive préparation des échantillons, les limites de détection basses, la vitesse de balayage lent, méthode intensive optimisation pour chaque métabolite, et l'incapacité de mesurer à la fois positivement et des ions chargés négativement dans des expériences simples. Par conséquent, un nouveau protocole de métabolomique pourrait faire progresser les études de métabolomique. Chromatographie hydrophile à base d'amide permet l'analyse des métabolites polaire sans dérivation chimique. SM à haute résolution à l'aide du Q-Exactive (QE-MS) a amélioré optique ionique, l'augmentation de la vitesse de balayage (256 ms avec une résolution de 70 000), et a la capacité d'effectuer la commutation positive / négative. En utilisant une stratégie d'extraction de méthanol froid, et le couplage d'une colonne d'amide avec QE-MS permet une détection robuste de 168 metabolites polaires ciblées et beaucoup d'autres fonctions simultanément. Datun traitement est effectué avec le logiciel disponible dans le commerce d'une manière très efficace, et des caractéristiques inconnues extraites à partir des spectres de masse peut être interrogé dans les bases de données.

Introduction

Métabolomique, définis comme une expérience qui mesure plusieurs métabolites simultanément, a été une zone d'intérêt intense. Métabolomique fournit une lecture directe de la physiologie moléculaire et a donné un aperçu dans le développement et la maladie comme le cancer ^1-4. Résonance magnétique nucléaire (RMN) et la chromatographie-spectrométrie de masse gazeuse (GC-MS) sont parmi les instruments les plus couramment utilisés ^5-9. RMN, en particulier a été utilisé pour des expériences de flux depuis composés marqués d'isotopes lourds, tels que ¹³ métabolites C marqués, sont actif en RMN ^10,11. Cependant, cette stratégie nécessite la pureté de l'échantillon relativement élevée et grande quantité de l'échantillon, ce qui limite ses applications en métabolomique. Pendant ce temps, les données recueillies à partir de l'analyse des besoins RMN intensive et l'attribution composé de spectres RMN complexe est difficile. GC-MS a été largement utilisé pour les métabolites polaires et des études de lipides, mais il faut compoun volatileds et donc souvent une dérivatisation de métabolites, ce qui implique parfois chimie complexe qui peut prendre beaucoup de temps et introduit du bruit expérimental.

Chromatographie en phase liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse quadripolaire triple utilise le premier quadrupôle pour la sélection des ions parents intacts, qui sont ensuite fragmentés dans le second quadripôle, tandis que le troisième quadripole est utilisé pour sélectionner des fragments caractéristiques ou des ions fils. Cette méthode, qui enregistre le passage de la ions parents à ions fils spécifiques, est appelé surveillance de réaction multiple (MRM). MRM est une méthode très sensible, spécifique et robuste à la fois petite molécule et la quantification des protéines ^12-15,21. Cependant, MRM a ses limites. Pour obtenir une grande spécificité d'une méthode MRM doit être construit pour chaque métabolite. Cette méthode consiste à identifier un fragment spécifique et l'énergie de collision optimisées, ce qui nécessite une connaissance préalable de la prope correspondantles parties prenantes des métabolites d'intérêt, tels que les informations de structure chimique. Par conséquent, à quelques exceptions impliquant la perte de neutre de fragments communs, il n'est pas possible d'identifier des metabolites inconnus avec cette méthode.

Dans les dernières années, à haute résolution (spectrométrie de masse) HRMS instruments ont été libérés, tels que la série LTQ-Orbitrap et Exactive, la QuanTof, et TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS peuvent fournir un rapport masse sur charge (m / z) des ions intacts à l'intérieur d'une erreur de quelques ppm. Par conséquent, un instrument de gestion des ressources humaines exploité par la détection de tous les ions précurseurs (c'est à dire en mode balayage complet) peut obtenir des informations structurales directe de la masse exacte et la composition élémentaire résultant de l'analyte, et cette information peut être utilisée pour identifier des métabolites potentiels. En effet, toutes les informations sur un composé peut être obtenu avec une masse exacte, au niveau des isomères structuraux. En outre, un pleinméthode d'analyse ne nécessite pas de connaissance préalable de métabolites et ne nécessite pas l'optimisation des méthodes. En outre, étant donné que tous les ions avec m / z tomber dans la plage de balayage peuvent être analysés, HRMS a une capacité presque illimitée en termes de nombre de métabolites qui peuvent être quantifiés en un seul passage par rapport à la méthode de MRM. HRMS est également comparable à un MRM quadripolaire triple de la capacité quantitative due au cycle de service de courte entraîne un certain nombre comparable de points de données qui peuvent être obtenus dans une analyse complète du MS. Par conséquent, HRMS fournit une approche alternative pour la métabolomique quantitative. Récemment, une version améliorée de gestion des ressources humaines appelé Q-Exactive spectrométrie de masse (QE-MS) peut être utilisé sous la commutation entre les modes positifs et négatifs avec des temps de cycle suffisamment rapide en une seule méthode, qui élargit la gamme de détection ^19. Ici, nous décrivons notre stratégie de métabolomique utilisant le QE-MS.

Protocole

1. Préparation de LC-MS réactifs, mise en place d'une méthode de chromatographie, et mise en place de procédures opérationnelles instruments

1. Préparation de solvants LC
   1. Préparer 500 ml phases mobiles. A est l'acétate d'ammonium 20 mM et 15 mM d'hydroxyde d'ammonium à 3% d'acétonitrile / eau, pH final de 9,0; et B est à 100% d'acétonitrile.
   2. Plafonner de manière lâche la bouteille, placez-le dans un bain sonique de l'eau, et soniquer pendant 10 minutes sans chauffage d'appoint. (Cette étape est de s'assurer que tous les sels d'ammonium se dissolvent complètement et qu'il n'y a pas de bulles d'air résiduelles.)
   3. Transférer 250 ml de solvant dans un flacon de 250 ml en verre pour un usage LC-MS, et de garder le reste à 4 ° C.
2. Préparer la solution d'étalonnage bas de gamme de masse. Il est important d'utiliser un mélange d'étalonnage de la gamme basse de masse sur mesure pour les applications métabolomique pour s'assurer que les masses précises sont détectés à de faibles poids moléculaires.
   1. Peser 5 mg de deux Sodium fluoracétate et de l'acide homovanillique et les dissoudre dans 5 ml d'eau pour obtenir une concentration finale de 1 mg / ml. Dissoudre le diazinon dans du methanol pour obtenir une concentration finale de 10 mg / ml.
   2. Pour préparer 1 ml de solution négative faible d'étalonnage de masse, mélange 960 ml d'une solution thermo négatif d'étalonnage avec 20 ml d'fluoroaceate de sodium et une solution d'acide homovanillique. Pour faire 1 ml de solution positive d'étalonnage de faible masse, mélanger 990 ml de solution d'étalonnage thermique positif et 10 ml de solution de diazinon. (La solution d'étalonnage de faible masse doit être conservé à 4 ° C et être préparée tous les 2 mois.)
3. Calibration de QE-MS à une gamme basse de masse
   1. Avant d'effectuer l'étalonnage de gamme basse de masse, effectuer un étalonnage de masse standard (m / z, 150-2,000) dans les modes à la fois positifs et négatifs en fonction des instructions du fabricant.
   2. Une fois qu'un calibrage de masse régulier passe, réglez la plage de balayage de 60 à 900 m / z dans le panneau de contrôle de l'instrumentet un CID de la source de 25 eV pour le mode positif et 35 eV pour le mode négatif est appliqué. (Cela donnera signaux robustes de la caféine et de l'ion fragment de l'ion sulfate. L'intervalle de balayage est fixé ici, parce que la dernière m / z ne doit pas être plus grand que 15 fois de la m début / z)
   3. Une fois que la source d'ions est stable, alors effectuer l'étalonnage sur mesure. Remarque: une source stable est définie comme étant inférieure à 10% de la variation de courant ionique totale en mode positif, et moins de 15% en mode négatif. Les ions d'étalonnage et de mesure correspondant à m / z sont indiquées au tableau 1.
4. Établir l'instrumentation LC-MS pour l'analyse des métabolites polaires. LC est couplé à un QE-MS pour la séparation et la détection de métabolites.
   1. Équiper le QE-MS avec une sonde d'ionisation électrospray chauffée (H-ESI). Définissez les paramètres de réglage correspondant à la sonde comme indiqué: la température de chauffage, 120 ° C; gaz de gaine, 30; gaz auxiliaire, 10; balayer gaz, 3; pulvériser tension, 3,6 kV pourmode positif et 2,5 kV en mode négatif. Régler la température du capillaire à 320 ° C, et S-lentille à 55.
   2. Construire une méthode analyse complète comme suit: Gamme complète de balayage: 60 à 900 (m / z); résolution: 70 000; temps d'injection maximale: 200 ms avec un temps typique d'injection autour de 50 ms; commande automatique de gain (AGC): 3000000 ions. Ces paramètres conduisent à un cycle de travail de l'ordre de 550 ms pour effectuer des analyses en mode à la fois positif et négatif.
   3. Établir la méthode de chromatographie. Employer une colonne amide (100 x 2.1 mm de diamètre, 3,5 mm) pour la séparation de composé à la température ambiante ^13,15. La phase mobile A est tel que décrit ci-dessus, et la phase mobile B est de l'acétonitrile. Utilisez un dégradé linéaire comme suit: 0 min, 85% de B; 1,5 min, 85% B, 5,5 min, 35% de B; 10 min, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 min, 85% de B, et de 20 min, 85% de B. Le débit est de 0,15 ml / min de 0 à 10 min et 15 à 20 min, et 0,3 ml / min 10,5 à 14,5 min.

2. Pra séparation des échantillons de métabolites

1. Préparer un solvant d'extraction. Mélanger 40 ml de méthanol (LC-MS grade) et 10 ml d'eau (LC-MS grade) dans un tube de 50 ml, et le garder en -80 ° C congélateur pendant au moins 1 heure avant de l'utiliser. Remarque: Cette procédure et les étapes ci-dessous peuvent être modifiés pour l'extraction des tissus biologiques et des échantillons de fluide.
   1. Culture côlon HCT cancer de huit cellules dans trois boîtes de 10 cm ou des plaques à 6 puits avec du milieu de croissance complet, RPMI 1640 additionné de 10% inactivé par la chaleur de sérum bovin fœtal et 100 000 unités / L de pénicilline et 100 mg / L de streptomycine.
   2. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, enlever rapidement le milieu, et placez le plat ou la plaque sur le dessus de ^13,15 de la glace sèche. Ajouter 1 ml extraction par solvant immédiatement (80% de méthanol / eau), et transférer la plaque au congélateur à -80 ° C. Pour une boîte de 10 cm de côté, ajouter 3 ml de solvant d'extraction dans chaque puits. (Essayez de retirer le milieu autant que possible pour éviter l'effet de la suppression d'ions due aux sels résiduels du milieu.)
   3. Laisser la plaque pendant 15 min. Retirer du congélateur et gratter les cellules dans le solvant sur glace sèche. Transférer la solution dans 1,7 ml des tubes Eppendorf et centrifuger à la vitesse de 20 000 xg à 4 ° C pendant 10 min. (Préparer métabolites cellulaires de trois plats séparés pour faire trois échantillons répétés. L'objectif de maintenir deux tubes est d'avoir un comme une sauvegarde.)
   4. Transférer le surnageant dans deux nouveaux tubes Eppendorf, et les sécher dans un vide de vitesse. Cela prend environ 3-6 heures selon le vide de vitesse utilisée. (Les échantillons peuvent également être séchés pendant une nuit sous azote gazeux.)
   5. Après séchage tubes, magasins de chaque échantillon dans le congélateur à -80 ° C. Lorsque vous êtes prêt, reconstituer un échantillon dans 20 ml d'eau (LC-MS grade), et injecter 5 ml de LC-QE-MS pour l'analyse.

3. Configuration de la séquence de l'échantillon

1. Une fois le calibrage a été correctement effectuée sur le QE-MS, équilibrer la colonne LC pendant 5 min avec 85% Un à un débittaux de 0,15 ml / min, ce qui est la condition de départ du gradient de LC.
2. Mettre en place la séquence d'échantillons dans un ordre aléatoire. Remarque: De cette manière, on répartit les variations introduites par la LC-MS pour chaque échantillon et assure une comparaison plus précise entre les différents échantillons. Tous les six échantillons, ajouter un cycle de lavage, qui partage la même méthode MS, à l'exception du gradient de LC est de 95% de A pendant 10 min, suivie d'une colonne d'équilibrage de 5 min à 85% de A avec un débit de 0,15 ml / min. Ajouter échantillons blancs (100% d'eau) après chaque cycle de lavage pour évaluer le fond du système et reporter les quantités.
3. Enregistrer la séquence et une fois la colonne LC indique la pression stable, autour de 400 psi, lancer le cycle de la séquence. S'il n'y a pas d'autre échantillon est à courir après cette séquence, puis ajouter une course d'arrêt à la fin de la séquence, qui a un débit de 0 ml / min à la fin de la pente et choisissez "veille" après avoir terminé la séquence.
4. Ré-exécuter le même échantillon mis 12 heures après l'étalonnage. (I Cettes d'évaluer la fluctuation d'erreur de masse après le calibrage.)

4. Poster analyse Instrument de nettoyage et d'entretien

1. A la fin de la séquence, laver la colonne avec 95% A à un débit de 0,2 ml / min pendant 2 h de débit, et, si nécessaire, d'inverser la colonne avant le lavage.
2. Supprimez la colonne LC et connecter directement la LC à la source d'ions par un syndicat. Préparer un solvant de nettoyage, / méthanol eau / acide formique (v: v: v, 90:10:0.2), mis en MS en mode veille, et le système de lavage LC-MS à un taux de 0,1 flux ml / min pendant 1 heure pour éliminer le précipité résiduel sels ou d'autres impuretés. Abaissez le débit si la pression du système trop.
3. Réglez la température capillaire à 50 ° C, et retirer la cage d'ions. Prendre avec précaution le cône de balayage ionique et du tube de transfert d'ions après que la température du capillaire chute à 50 ° C. Utiliser un maillage grossier, tel que du papier de verre, pour éliminer les impuretés laissées sur la surface du cône de balayage ionique.
4. Placer le transfert d'ionstube dans un tube Falcon de 15 ml contenant 10 ml d'eau à 90% / méthanol avec de l'acide formique à 0,1%. Après sonication dans le tube un sonicateur à bain-marie pendant 20 min, décanter le solvant à l'intérieur, le remplacer par 10 ml de méthanol pur et sonication pendant 20 minutes. (Le cas échéant, la sonication peut être effectuée à 40 ° C ou à une température encore plus élevée pour obtenir de meilleurs résultats de nettoyage.)

5. Analyse des données LC-MS

1. Pour assurer la séquence d'échantillons fonctionne bien, après avoir terminé les deux premiers échantillons de la séquence, consultez pics de métabolites inconnus. Utilisez un fichier csv Liste des noms de métabolites, formule chimique neutre et le mode de détection (positif ou négatif), que le fichier d'entrée, et le fichier de sortie contient des pics extraits et erreur de masse en ppm. Si la forme du pic est anormal ou l'erreur de masse est désactivée par plus de 5 ppm, puis le reste de la séquence doit être arrêté et le dépannage doit être fait.
2. Choisissez la méthode de "l'alignement de pointeet l'extraction de cadre "sur les logiciels disponibles dans le commerce. Sélectionnez les données brutes de LC-MS et les regrouper. Choisir des échantillons dans le milieu de la séquence d'exécution comme échantillon de référence pour l'alignement de la Chromatographie de crête. Envoyez une graine de cadre y compris les métabolites connus pour l'analyse des métabolites ciblés avec des données collectées et la graine de trame correspondant.
3. Effectuer l'analyse des données en mode positif et négatif séparément. Utilisez le paramètre par défaut pour les autres paramètres. Désactiver la fonction de recherche de base de données et exécuter le flux de travail. Exporter les données traitées comme une feuille Excel contenant l'aire du pic de chaque image. Les premières séries de cadres correspondent aux métabolites dans la liste ciblée. Remarque: Pour une analyse de métabolite ciblée, on obtient les informations de métabolites sur la base des études antérieures ^13,15.
4. Pour une analyse de métabolite non ciblée, choisir la méthode de "l'extraction de composants". Charger des échantillons vierges pour soustraction de fond. Réglez l'intensité du pic seuil, unet 10 ^5, m / z largeur de 10 ppm et le rapport signal sur bruit de 3.
5. Utilisez la base de données métabolome humain pour l'identification des composés inconnus. Utilisez un filtre de CV pour supprimer les composants avec de grandes CV dans des échantillons répétés. Aller manuellement dans chaque composant et choisir ceux avec un pic bien défini ou relativement grande différence dans différents types de la recherche de base de données des échantillons. Exporter des données avec succès dans la base de données. (Alignement de pointe pourrait être contournée si le score d'alignement de pointe est trop faible.)

Résultats

L'exactitude des données de métabolomique dépend fortement de la performance de l'instrument LC-QE-MS. Afin de déterminer si l'instrument fonctionne dans de bonnes conditions, et si la méthode appliquée est correcte, plusieurs pics LC de métabolites connus sont extraites à partir de la chromatographie ionique total (CIT), comme représenté sur la figure 1. Metabolites polaires, y compris des acides aminés, des produits intermédiaires de la glycolyse , intermédiaires de TCA, les nucléotides, les vitamines...

Discussion

Les étapes les plus importantes pour la réussite de profilage des métabolites dans les cellules à l'aide de ce protocole sont: 1) le contrôle du milieu de croissance et l'extraction minutieuse des cellules; 2) l'ajustement de la méthode de LC basée sur MS méthode configuration pour s'assurer qu'il ya suffisamment (habituellement au moins 10) points de données à travers un pic pour la quantification; 3) faire un étalonnage de faible masse avant d'exécuter les échantillons; 4) l'injection d'...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mélange d’étalonnage positif	Thermo Scientific	#88323	Il est sensible à la lumière. Conserver à 4 ° ; C
Mélange d’étalonnage négatif	Thermo Scientific	#88324	Stocker à 4 ° ; C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnologie	#C0413	Il provoque une irritation des yeux, alors travaillez en capuche. Conserver à 4 ° ; C
H-ESI insert d’aiguille	Fisher Scientific	#1303200	Il peut être remplacé ou nettoyé avec de l’acide formique/de l’eau à 5 % (retirer l’anneau en caoutchouc) s’il est obstrué.
La colonne de	Waters	#186004860	est recommandée pour augmenter la durée de vie de la colonne.