Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

Résumé

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Utilisant chromatographie liquide normale progressive couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution avec changement de polarité et un cycle de service rapide, nous décrivons un protocole pour analyser la composition métabolique polaire de matériel biologique avec une grande sensibilité, la précision et la résolution.

Résumé

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Toutefois, les plates-formes actuelles ont des facteurs limitants, comme la main-d'œuvre intensive préparation des échantillons, les limites de détection basses, la vitesse de balayage lent, méthode intensive optimisation pour chaque métabolite, et l'incapacité de mesurer à la fois positivement et des ions chargés négativement dans des expériences simples. Par conséquent, un nouveau protocole de métabolomique pourrait faire progresser les études de métabolomique. Chromatographie hydrophile à base d'amide permet l'analyse des métabolites polaire sans dérivation chimique. SM à haute résolution à l'aide du Q-Exactive (QE-MS) a amélioré optique ionique, l'augmentation de la vitesse de balayage (256 ms avec une résolution de 70 000), et a la capacité d'effectuer la commutation positive / négative. En utilisant une stratégie d'extraction de méthanol froid, et le couplage d'une colonne d'amide avec QE-MS permet une détection robuste de 168 metabolites polaires ciblées et beaucoup d'autres fonctions simultanément. Datun traitement est effectué avec le logiciel disponible dans le commerce d'une manière très efficace, et des caractéristiques inconnues extraites à partir des spectres de masse peut être interrogé dans les bases de données.

Introduction

Métabolomique, définis comme une expérience qui mesure plusieurs métabolites simultanément, a été une zone d'intérêt intense. Métabolomique fournit une lecture directe de la physiologie moléculaire et a donné un aperçu dans le développement et la maladie comme le cancer ^1-4. Résonance magnétique nucléaire (RMN) et la chromatographie-spectrométrie de masse gazeuse (GC-MS) sont parmi les instruments les plus couramment utilisés ^5-9. RMN, en particulier a été utilisé pour des expériences de flux depuis composés marqués d'isotopes lourds, tels que ¹³ métabolites C marqués, sont actif en RMN ^10,11. Cependant, cette strat....

Protocole

1. Préparation de LC-MS réactifs, mise en place d'une méthode de chromatographie, et mise en place de procédures opérationnelles instruments

1. Préparation de solvants LC
   1. Préparer 500 ml phases mobiles. A est l'acétate d'ammonium 20 mM et 15 mM d'hydroxyde d'ammonium à 3% d'acétonitrile / eau, pH final de 9,0; et B est à 100% d'acétonitrile.
   2. Plafonner de manière lâche la bouteille, placez-le dans un bain sonique de l'eau, et soniquer pendant 10 minutes sans chauffage d'appoint. (Cette étape est de s'assurer que tous les sels d'ammonium se dissolvent complètement et qu'il n'y a pas de bulle....

Résultats

L'exactitude des données de métabolomique dépend fortement de la performance de l'instrument LC-QE-MS. Afin de déterminer si l'instrument fonctionne dans de bonnes conditions, et si la méthode appliquée est correcte, plusieurs pics LC de métabolites connus sont extraites à partir de la chromatographie ionique total (CIT), comme représenté sur la figure 1. Metabolites polaires, y compris des acides aminés, des produits intermédiaires de la glycolyse , intermédiaires de TCA, les nucléotides, l.......

Discussion

Les étapes les plus importantes pour la réussite de profilage des métabolites dans les cellules à l'aide de ce protocole sont: 1) le contrôle du milieu de croissance et l'extraction minutieuse des cellules; 2) l'ajustement de la méthode de LC basée sur MS méthode configuration pour s'assurer qu'il ya suffisamment (habituellement au moins 10) points de données à travers un pic pour la quantification; 3) faire un étalonnage de faible masse avant d'exécuter les échantillons; 4) l'injection d'.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mélange d’étalonnage positif	Thermo Scientific	#88323	Il est sensible à la lumière. Conserver à 4 ° ; C
Mélange d’étalonnage négatif	Thermo Scientific	#88324	Stocker à 4 ° ; C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnologie	#C0413	Il provoque une irritation des yeux, alors travaillez en capuche. Conserver à 4 ° ; C
H-ESI insert d’aiguille	Fisher Scientific	#1303200	Il peut être remplacé ou nettoyé avec de l’acide formique/de l’eau à 5 % (retirer l’anneau en caoutchouc) s’il est obstrué.
La colonne de	Waters	#186004860	est recommandée pour augmenter la durée de vie de la colonne.

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