Juxtasomal Biocytin étiquetage pour étudier la structure-fonction de relation corticale individuelle neurones

Summary

Pour comprendre la structure des réseaux neuronaux, la caractérisation fonctionnelle et morphologique des neurones individuels est une nécessité. Ici, nous démontrons juxtasomal étiquetage biocytine, qui permet des enregistrements électrophysiologiques dans la configuration extracellulaire, tout en conservant la capacité d'étiqueter intracellulaire du neurone pour la reconstruction post-hoc de l'architecture dendritique et axonale.

Abstract

Le cortex cérébral est caractérisé par de multiples couches et de nombreux types cellulaires distincts qui, ensemble, en tant que réseau sont responsables de nombreuses fonctions cognitives supérieures, y compris la prise de décisions, le comportement sensori-guidée ou de la mémoire. Pour comprendre comment ces réseaux neuronaux complexes effectuer des tâches, une étape cruciale consiste à déterminer la fonction (ou l'activité électrique) de types de cellules individuelles au sein du réseau, de préférence lorsque l'animal exécute une tâche cognitive pertinente. En outre, il est également important de déterminer la structure anatomique du réseau et l'architecture morphologique des neurones individuels pour permettre l'ingénierie inverse du réseau cortical. Percées techniques disponibles aujourd'hui permettent d'enregistrer l'activité cellulaire en éveil, se comporter animaux avec l'option précieuse de post hoc identifier les neurones enregistrés. Ici, nous démontrons la technique de marquage juxtasomal de biocytine, qui implique l'action d'enregistrement potentiomètreal dopage dans le extracellulaire (ou loose-patch) configuration à l'aide de pipettes de patch classiques. La configuration de l'enregistrement de juxtasomal est relativement stable et applicables à l'ensemble des conditions de comportement, y compris anesthésiés, sédation, éveillé tête fixe, et même dans l'animal se déplacer librement. Ainsi, ce procédé permet d'associer un type de cellule spécifique dopage potentiel d'action au cours de comportement de l'animal à la reconstruction des neurones individuels et finalement, l'ensemble du microcircuit cortical. Dans cette vidéo, manuscrit, nous montrons comment les neurones individuels dans la configuration de juxtasomal peuvent être étiquetés avec biocytine chez le rat anesthésié uréthane pour l'identification et la reconstruction post-hoc morphologique.

Introduction

Les réseaux de neurones sont constitués de plusieurs types de cellules, caractérisé par les propriétés morphologiques et physiologiques très spécifiques ^7.1. En conséquence, les types de cellules individuelles des tâches spécialisées à l'intérieur du réseau (voir par exemple Gentet et al. ⁸ et Burgalossi et al. ^9). Nous commençons seulement à comprendre les fonctions spécifiques de type cellulaire à travers les réseaux neuronaux et beaucoup reste à découvrir. A cette fin, de nombreux laboratoires mettent en œuvre des approches expérimentales qui permettent l'analyse des propriétés morphologiques de la même population neuronale à partir de laquelle les paramètres physiologiques ont été obtenus ^1,10-15. Ici, nous démontrons la technique de marquage de juxtasomal ^16,17 qui implique des enregistrements électrophysiologiques en utilisant des pipettes de patch classiques dans la configuration extracellulaire (donc non invasif) en combinaison avec l'électroporation du neurone enregistré avec biocytine. Laavantage majeur de cette approche est que la nature non invasive permet de s'assurer que l'action de dopage potentiel de neurones individuels est enregistrée sans modifier (par exemple, la dialyse), la teneur intracellulaire de la cellule. Suivi par électroporation, l'approche de juxtasomal offre la possibilité d'identification et de reconstruction post-hoc cellule de lier la fonction (physiologie) à la structure (morphologie). Typiquement, la reconstruction comprend la reconstruction morphologique de morphologie dendritique et axonale qui peut être étendue à la quantification de la colonne vertébrale et / ou des densités Bouton ou encore la reconstruction de la morphologie neuronale à une résolution nanométrique en utilisant la microscopie électronique. La technique d'enregistrement de juxtasomal peut être utilisé pour des enregistrements in vivo de divers types de cellules à travers les couches corticales ou dans les zones sous-corticales dans une gamme d'espèces, bien que la plupart des études ont appliqué la technique dans les petits rongeurs tels que les souris ou les rats. Notre recherche se concentre sur l'enregistrement et l'étiquetage des neuronesde rat primaire cortex somatosensoriel (S1) et implique l'identification visuelle des neurones enregistrés ^18, reconstructions dendritiques en combinaison avec un enregistrement précis dans un cadre de référence normalisé de désosser réseaux corticaux ^4,19 et reconstruction détaillée de l'architecture axonale à caractériser locale spécifique du type de cellule et projection à long terme cible ^20.

Par rapport à vivo des techniques alternatives dans d'enregistrement (intracellulaires ou de cellules entières), les enregistrements juxtasomal sont relativement stables et peuvent donc être appliquées dans tous les États de comportement, y compris anesthésiés ^21,22, sédation ^14, éveillé animaux de la tête fixe ^23, ou même librement mobiles ⁹ . Ici, nous montrons l'étiquetage juxtasomal dans S1 d'un rat d'uréthane anesthésiés, mais nous insistons sur l'applicabilité générale de cette technique à de nombreuses préparations de choix.

Protocol

Une. Préparation de l'animal

Toutes les procédures expérimentales sont menées en conformité avec la loi néerlandaise et après évaluation par un comité d'éthique local à l'Université VU d'Amsterdam, aux Pays-Bas.

1. Anesthésier un rat Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) avec de l'isoflurane (2-3% dans de l'oxygène) et ensuite avec de l'uréthane (20% dans 0,9% de NaCl, 1.6 à 1.7 g / kg) par injection intrapéritonéale. Évaluer la profondeur de l'anesthésie en surveillant pincée retrait, les réflexes des paupières, et les mouvements vibrisses.
2. Administrer une dose supplémentaire d'uréthane (10% de la dose initiale) dans le cas où l'animal ne parvient pas à la profondeur de l'anesthésie suffisante ou lorsque des secousses vibrisses sont observées au cours de l'expérience.
3. Placer l'animal anesthésié sur le cadre stéréotaxique équipé d'un patin chauffant, à insérer une sonde de température rectale et à maintenir la température du corps de l'animal à 37,5 ± 0,5 ° C par une couverture chauffante.
4. position de la tête de l'animal dans le cadre stéréotaxique; couper les cheveux sur le dessus de la tête à l'aide des ciseaux pour rendre la peau visible.
5. Injecter 100 ul de lidocaïne à 1% (dans du NaCl 0,9%), sous-cutanée pour l'anesthésie locale au site d'opération et d'attendre 3 à 5 min. Retirez la peau qui recouvre la surface du crâne en coupant dans le sens caudal à rostral et nettoyer le tissu restant.
6. Nettoyez le crâne largement avec 0,9% de NaCl et tampons absorbants.
7. Déterminer les coordonnées de la zone cible sur l'hémisphère gauche (pour cortex somatosensoriel primaire (S1): 2,5 mm et 5,5 mm postérieur au bregma latéral). Marquez l'emplacement sur le crâne avec un marqueur de la peau chirurgicale.
8. Racler l'os doucement par une fraise dentaire à partir de la région d'intérêt jusqu'à ce que l'os devient transparent et les vaisseaux sanguins sont clairement visibles.
9. Ajouter un 0,5 mm x 0,5 mm craniotomie par découpage d'une fenêtre dans le crâne amincie avec un scalpel (n ° 11), en évitant d'endommager la dure-mèreet les vaisseaux sanguins. En option: marquer les bords de la craniotomie en utilisant un marqueur de la peau chirurgicale pour améliorer la visibilité.
10. Appliquez une fine couche de colle sur le crâne sec et ciment dentaire pour construire une salle de bain (c'est à dire de la chambre d'enregistrement) entourant la craniotomie.
11. Coupez les moustaches du côté controlatéral à exactement 5 mm du follicule moustache. Facultatif: mettre en évidence les moustaches taillées avec mascara noir.

2. Juxtasomal Recordings et Biocytin étiquetage

1. Assurez-pipettes de patch du verre borosilicate avec un diamètre de pointe à l'intérieur de ~ 1 pm pour obtenir électrodes avec 3-5 résistance de MQ. Remarque: La morphologie de la pipette idéal pour l'enregistrement de juxtasomal est un cône progressif mince, un angle de cône faible, et un ~ 1 um bout (figure 1).
2. En fonction de la profondeur d'enregistrement (par rapport à la surface de la pie-mère), les dimensions de cône de l'électrode d'enregistrement doivent être ajustées. Critique important est que til cône diamètre doit être inférieure à 75 pm au point d'entrée dans le cerveau pour éviter les dommages mécaniques ou de stress à la zone d'enregistrement. Ceci indique que, pour des enregistrements corticales superficielles, un cône de 300 à 500 um avec un diamètre extérieur d'au maximum 75 um est nécessaire (figure 1A), alors que les enregistrements de couches corticales relativement profonds nécessitent une conicité plus de 1,500-1,800 pm, de nouveau avec extérieur maximal diamètre de 75 pm (1,800 um à partir de la pointe d'électrode).
3. Chargez la pipette de patch avec la sonnerie de rat normal (IRB) additionné de 2% biocytine (voir le tableau 1 pour les solutions et réactifs) et monter la pipette de patch sur une scène de tête fixé à un micromanipulateur.
4. Régler l'angle du support d'électrode à 34 ° par rapport au plan sagittal de cibler spécifiquement la colonne D2 de rat S1.
5. Connectez le stade de la tête à un amplificateur à pont-mode (c.-à-pince de courant).
6. Placez le patchpipette à proximité de la craniotomie. Remplir la baignoire avec 0,9% de NaCl et de déterminer la résistance de l'électrode qui doit être comprise entre 3-5 MQ, évalués en appliquant une impulsion carrée avec injection de courant positif (1 nA, 200 ms on / off).
7. Établir surpression de 100-150 mbar et faire progresser la pipette de patch dans une um étapes tout en appliquant un courant positif impulsions carrées (1 nA, 200 ms on / off). Suivre l'évolution de la résistance solide à établir le contact avec la dure-mère. À ce stade, de définir les coordonnées du micromanipulateur à «zéro» pour permettre des mesures précises de profondeur.
8. Avancez dans 1 um étape-mode jusqu'à ce que la pipette de patch pénètre la dure-mère indiquée par une chute soudaine de la résistance de l'électrode. Retirer la pression de maintien de la pipette.
9. Rechercher des unités simples tout en avançant dans une um étapes. Surveillance de la résistance de l'électrode en continu en appliquant 200 ms on / off impulsions. Une augmentation de la résistance électrode typicallié indique la proximité d'un seul neurone. Avancez jusqu'à ce que l'électrode potentiel d'action positive (AP) des formes d'onde de ~ 2 mV sont enregistrées (Figures 2A et 2B).
10. Facultatif: Enregistrez le modèle de dopage spontanée du neurone et déterminer moustache évoqués dopage, par exemple, de déviation caudale moustaches individuels pour 200 ms à un angle de 3,3 ° en utilisant un dispositif piézo-électrique ^18.
11. Avancer l'électrode jusqu'à ce que la résistance est 25-35 MQ et les pointes ont des amplitudes de 3-8 mV pour obtenir des conditions optimales de remplissage de juxtasomal. Commencez le remplissage de juxtasomal en appliquant des impulsions carrées de courant positif (1 nA, 200 ms on / off). Lentement et progressivement augmenter le courant par pas de 0,1 nA tout en surveillant la forme d'onde de l'AP et de la fréquence (figures 2A et 2B).
12. Surveillance de l'ouverture de la membrane comme une nette augmentation de la fréquence AP au cours de la sur-phase de l'impulsion de bloc (figure 2C ). La forme d'onde de pic pendant le remplissage montre une augmentation de la largeur et réduite après-hyperpolarisation (figures 2C et 2D). Paramètres supplémentaires comprennent une augmentation du bruit ou un petit (1-5 mV) négatif décalage DC.
13. Augmenter ou diminuer le courant (1 nA) pendant le remplissage afin de maintenir la perfusion de biocytine stable. Réduire ou d'arrêter les impulsions de courant lors d'une augmentation brusque de la fréquence AP pour éviter la toxicité par excès afflux d'ions extracellulaires, tels que des ions sodium. Remarque: chaque neurone réagit différemment à l'injection de courant et juxtasomal paramètres d'étiquetage doivent être ajustés en fonction des conditions d'enregistrement individuels.
14. Suivre de près le signal après l'arrêt de l'injection de courant. La forme d'onde de pic après une séance de remplissage est généralement élargie et montre une forte réduction après hyperpolarisation. Attendre la récupération du neurone, ce qui est évident lorsque la forme d'onde de transitoire revient à ses propriétés d'origine (c'est à dire la présence d'normale après-hyperpolarisation, figure 2).
15. Répétez biocytine remplissage sessions après la récupération complète du neurone à augmenter la charge biocytine pour une meilleure qualité de la coloration.
16. Rétracter la pipette de patch par pas de 1 pm jusqu'à ce que l'amplitude de crête diminue pour réduire toute contrainte mécanique de la cellule. Attendez au moins 1 heure pour la biocytine à diffuser intracellulaire tout en surveillant étroitement la température du corps de l'animal et de la respiration.

3. Perfusion de l'animal et retrait du cerveau

1. Préparer la mise en place de la perfusion, rincer, et précharger le tube avec 0,9% de NaCl.
2. Placez l'animal sur un plateau chirurgical et fixer avec une bande d'étiquetage standard. Assurer une profondeur suffisante de l'anesthésie; pincée de pied et les réflexes des paupières doivent être absents.
3. Faire une incision dedans en dehors (5-6 cm) à travers la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique et continuer en direction postéro-antérieure à exposer le sternum.Tirez le sternum en avant et bien séparer le foie de la membrane.
4. Faire une petite incision dans la membrane, couper à travers les côtes inférieures et continuer l'incision le long de toute la longueur de la cavité abdominale pour exposer le coeur.
5. Retirez le péricarde.
6. Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche et faire une incision dans l'oreillette droite. Perfuse avec du NaCl 0,9% (~ 8 ml / min) jusqu'à ce que la décoloration du foie est terminée.
7. Mettez la perfusion à 4% de paraformaldéhyde (PFA) jusqu'à ce que la rigidité de l'avant patte et la mâchoire inférieure est apparente.
8. Décapite les rats en utilisant une paire de ciseaux
9. Retirez les muscles du cou restants et exposer le crâne complètement.
10. Positionner les ciseaux dans le tronc cérébral sur la face dorsale et couper l'os avec soin le long de la suture sagittale, en maintenant la position dorsale.
11. Retirer les os de part et d'autre de la suture sagittale pour exposer le cerveau en utilisant une pince. Retirez délicatement la durée pour éviter dAmage.
12. Insérez délicatement une spatule mousse à la face ventrale du cerveau et enlever délicatement le cerveau.
13. Post-fixer l'ensemble de la nuit de cerveau en PFA à 4 ° C. Mettez le cerveau à 0,05 M de tampon phosphate (PB) et stocker à 4 ° C.

4. Couper en tranches le cerveau dans les sections tangentielles

1. Prenez le cerveau de l'0,05 M PB et le mettre sur un papier filtre face antérieure. Utilisez une lame de rasoir pour couper le cervelet dans le plan coronal et séparer les hémisphères en coupant le long du plan sagittal milieu.
2. Appliquer colle sur la plate-forme de montage et monter l'hémisphère gauche de son plan sagittal avec antérieure vers la droite. Fixez la plate-forme de montage à un angle de 45 ° sur un vibratome et plonger le cerveau dans 0,05 M PB.
3. Fixer une lame de rasoir sur le vibratome et faire en sorte que le premier contact avec la surface du cerveau se trouve au milieu du plan antéro-postérieur de l'hémisphère. Couper 24 100 umsections et les recueillir dans une plaque de 24 puits contenant 0,05 M de PB.

5. Procédures histologiques

1. Effectuer des protocoles pour la coloration histologique cytochrome oxydase et ²⁴ la biotine-peroxydase-avidine Procédé selon l'une des méthodes ²⁵ décrites précédemment. Facultatif: visualiser biocytine utilisant des conjugués fluorescents avidine / streptavidine-Alexa. Cela permet en outre double coloration avec des techniques de traçage rétrograde ou antérograde.
2. Laver les sections 5 x 5 min avec 0,05 M de PB et préparer le tétrachlorhydrate de 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) solution pour la coloration de la cytochrome oxydase pour visualiser les fûts dans la couche 4 (L4) de S1-contenant (voir le tableau 2 pour les solutions et réactifs). Incuber sections 6-12 de la pie dans la solution préchauffé pendant 30-45 min à 37 ° C.
3. Rincer les sections avec 0,05 M PB pour 6 x 5 min et éteindre l'activité de la peroxydase endogène en incubant les sections dans 3% _de H ₂ O ₂ à 0,05 M de PB pendant 20 min à température ambiante (RT).
4. Rincer les sections avec 0,05 M PB pour 5 x 10 min. Incuber les coupes dans ABC-solution (voir le tableau 3 pour les solutions et réactifs) pendant une nuit à 4 ° C.
5. Rincer sections avec 0,05 M de PB à 5 x 10 min et préparer la solution-DAB pour visualiser le neurone de biocytine-remplie (voir tableau 4 pour les solutions et les réactifs). Incuber les coupes dans la solution filtrée pendant 45-60 min à température ambiante.
6. Rincer les sections avec 0,05 M PB pour 5 x 10 min. Sections de montage sur des lames de microscope et lamelles à l'aide Mowiol (voir le tableau 5 pour des solutions et réactifs).
7. Déterminer la qualité de l'étiquetage par microscopie optique.

Results

La connaissance détaillée de la structure 3D de neurones individuels est cruciale pour élucider les principes d'organisation des réseaux de neurones. Notre méthode consiste à un pipeline pour atteindre la haute qualité de l'étiquetage biocytine partir d'une préparation in vivo, ce qui permet la classification neuronale après hoc et la reconstruction détaillée de l'architecture dendritique et axonale des neurones isolés à haute résolution. En fonction de la qualité de l'étiquetage des juxtasomal, les ne...

Discussion

La méthode de juxtasomal permet d'enregistrer dans l'action in vivo dopage potentiel des unités simples dans des conditions de comportement (anesthésiés, éveillé tête fixe ou mobile librement) avec l'option de biocytine-étiquetage du neurone enregistré pour la classification post hoc de type cellulaire et / ou la reconstruction 3D. L'avantage majeur est d'obtenir des paramètres physiologiques de la configuration extracellulaire (donc non invasif), tout en étant capable de m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Système de contrôle SM-6	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 amplificateur	Neuralynx
Axoclamp-2B amplificateur	Axon Instruments
Osada modèle EXL-M40	Osada, Inc.
Dispositif piézoélectrique	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, USA		Logiciel d’acquisition LabView
Ntrode Virtual Instrument  ;	R. Bruno, Columbia Univ., NY
Écouvillons absorbants Sugi	Kettenbach	30601
Cytochrome C du cœur équin	Sigma	C2506
Catalase du foie bovin	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain standard ABC-kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Uréthane	Sigma	U2500
Isoflurane	Pharmachemie	45.112.110
Lidocaïne	Sigma	L5647
Ciment dentaire rapide	simplex Kemdent	ACR308/ACR924
Biocytine	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
Trizma base	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Glycérol analytique	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22 350-6
MgCl2	Fluka	63072