La composition de la paroi cellulaire végétale varie selon les types de tissus et peut inclure la lignine, la cellulose, les hémicelluloses et la pectine. Diverses techniques de coloration ont été développées pour visualiser les différences au niveau du type de cellule. Cet article est une compilation des techniques de coloration de la paroi cellulaire couramment utilisées.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Dans cet article
Résumé
Résumé
Arabidopsis thaliana est un organisme modèle couramment utilisé pour comprendre et manipuler divers processus cellulaires chez les plantes, et il a été largement utilisé dans l’étude de la formation de la paroi cellulaire secondaire. Le dépôt de la paroi cellulaire secondaire se produit après la formation de la paroi cellulaire primaire, un processus effectué exclusivement par des cellules spécialisées telles que celles formant des tissus de vaisseaux et de fibres. La plupart des parois cellulaires secondaires sont composées de cellulose (40 à 50 %), d’hémicellulose (25 à 30 %) et de lignine (20 à 30 %). Plusieurs mutations affectant la biosynthèse de la paroi cellulaire secondaire ont été isolées, et les mutants correspondants peuvent ou non présenter des changements évidents de composition biochimique ou des phénotypes visuels, car ces mutations pourraient être masquées par des réponses compensatoires. Historiquement, les procédures de coloration ont été utilisées pour montrer les différences sur une base cellulaire. Ces méthodes sont exclusivement des moyens d’analyse visuels ; Néanmoins, leur rôle dans l’analyse rapide et critique est d’une grande importance. Le rouge Congo et le blanc calcofluor sont des colorants utilisés pour détecter les polysaccharides, tandis que le Mäule et le phloroglucinol sont couramment utilisés pour déterminer les différences de lignine, et le bleu de toluidine O est utilisé pour colorer différemment les polysaccharides et la lignine. Les techniques apparemment simples de sectionnement, de coloration et d’imagerie peuvent être un défi pour les débutants. En commençant par la préparation d’échantillons à l’aide du modèle A. thaliana, cette étude détaille les protocoles d’une variété de méthodologies de coloration qui peuvent être facilement mises en œuvre pour l’observation de l’organisation cellulaire et tissulaire dans les parois cellulaires secondaires des plantes.
Introduction
La paroi de cellule végétale est titulaire d'une pléthore d'informations à l'intérieur de ses divers composants: la lignine, la cellulose, les hémicelluloses (xylane, glucuronoxylane, xyloglucane, arabinoxylane, glucane de liaison mixte, ou glucomannane), et de la pectine. Techniques histologiques fournissent des repères visuels importants dans l'étude des différences dans les parois secondaires au niveau organisationnel et cellulaires. Diverses techniques histologiques ont été développés et peuvent être trouvés dans la littérature, mais ces techniques peuvent être difficiles et fastidieux pour les débutants car protocoles très détaillés avec des inst....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Souches Embedding
- Préparer une solution d'agarose à 7% dans l'eau (7 g d'agarose à une électrophorèse de qualité dans 100 ml d'eau distillée). Dissoudre la gélose par autoclavage pendant 20 min ou par micro-ondes pendant 20 min à la plus faible intensité (par exemple, une intensité de 1250 watts à micro-ondes de 10%).
- Préparer un moule maison pour intégrer les tiges à l'aide des flacons en plastique.
- En utilisant une lame de rasoir, coupez le fond conique d'un bouchon à vis microtube de 2 ml (partie A). Avec une aiguille de seringue, percer un trou dans le bouchon du tube légèrement plus grand que le d....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Tige inclusion et la coupe:
L'utilisation du moule en matière plastique à incorporer le fait maison tiges dans 7% d'agarose révélée être rapide et facile (figure 1). Les deux parties (A et B; figure 1) du système de flacon intégré le rendent simple pour libérer facilement la tige intégré dans agarose comme l'agarose ne colle pas aux parties des flacons qui sont inertes, maintenir le système propre. Les flacons peuvent être réutilisés plusieurs fois pendant des années........
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Sections de la tige A. thaliana sont largement utilisés pour étudier l'organisation des cellules dans la paroi de la cellule secondaire et pour examiner les différences entre qualitativement type sauvage et des plantes transgéniques. Les techniques couramment utilisées pour sectionner les spécimens sont coupe de main directe; ou lorsque les spécimens sont intégrés dans agarose ou fixateur, la coupe peut être fait avec un vibratome ou microtome. A la différence de la découpe de la main, les deux derniers per.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit financier à divulguer.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants à Sabin Russell pour aide à l'édition. Ce travail faisait partie de l'Institut mixte bioénergie DOE (http://www.jbei.org) soutenue par le Département américain de l'énergie, Bureau de la science, Bureau de la recherche biologique et l'environnement, par le biais du contrat DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley National Laboratory et l'US Department of Energy.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agarose | EMD | MERC2125 | Numéro CAS : 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzène [Numéro CAS : 108-73-6] |
| Acide chlorhydrique | EMD | HX0603-75 | Numéro CAS : 7647-01-0 |
| Hydroxyde d’ammonium | EMD | AX1303-6 | Numéro CAS : 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Chlorure de blétène, chlorure de tolonium [numéro CAS 92-31-9] ; |
| Permanganate de potassium | Sigma | 223468 | numéro CAS 7722-64-7 ; |
| Éthanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | Numéro CAS : 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma ; | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphényl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphtalène 1-sulfonate) [Numéro CAS 573-58-0] |
| Azurant 28/ Calcofluor Teinture Blanche | Sigma | F3543 ; | Acide 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyéthyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbène-2,2'-disulfonique [numéro CAS 4404-43-7] ; |
| Vibratome | Leica | Leica Microtome à lame vibrante | VT1000S http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Article # 60-0139-0000 ; | Lame à double tranchant en acier inoxydable (Personna Super) |
| Tubes de microcentrifugation à bouchon à vis (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Tubes de microcentrifugation (0,6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitaine | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE ; Hot Hand Protector Mitt |
| Adhésif en tissu | Ted Pella Inc | 10033 | Magasinez à 4 ° ; C ou 20 ° ; C pour une conservation de 3 mois ou plus |
| Micro-ondes | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Adhésif tissulaire instantané ; |
| Caméra avec puce CCD sans obturateur mécanique | Hamamatsu | C4742-95 | |
| Caméra couleur haute vitesse ; ; ; | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Logiciel de caméra ; | ; Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imaginer l’anaylsis ; | Adobe ; | Lunettes Photoshop CS4 | |
| Micro Cover, carrées, n° 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8") - Les lunettes sont résistantes à la corrosion et uniformément épaisses et plates. L’épaisseur n° 1 est de 0,13 à 0,17 mm. |
| Micro lames givrées, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm Emballage |
| Parafilm M | Alcan | BRNDPM998 | |
| TX2 Filtre cube | Leica | 11513851/11513885 | Filtre utilisé pour l’analyse du rouge Congo avec une bande passante de 560/40. |
Références
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
