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Article de méthode

La coloration histochimique de l'

42.2K vues

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DOI :

10.3791/51381

⸱

13 mai 2014

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Dans cet article

Résumé

La composition de la paroi cellulaire végétale varie selon les types de tissus et peut inclure la lignine, la cellulose, les hémicelluloses et la pectine. Diverses techniques de coloration ont été développées pour visualiser les différences au niveau du type de cellule. Cet article est une compilation des techniques de coloration de la paroi cellulaire couramment utilisées.

Résumé

Arabidopsis thaliana est un organisme modèle couramment utilisé pour comprendre et manipuler divers processus cellulaires chez les plantes, et il a été largement utilisé dans l’étude de la formation de la paroi cellulaire secondaire. Le dépôt de la paroi cellulaire secondaire se produit après la formation de la paroi cellulaire primaire, un processus effectué exclusivement par des cellules spécialisées telles que celles formant des tissus de vaisseaux et de fibres. La plupart des parois cellulaires secondaires sont composées de cellulose (40 à 50 %), d’hémicellulose (25 à 30 %) et de lignine (20 à 30 %). Plusieurs mutations affectant la biosynthèse de la paroi cellulaire secondaire ont été isolées, et les mutants correspondants peuvent ou non présenter des changements évidents de composition biochimique ou des phénotypes visuels, car ces mutations pourraient être masquées par des réponses compensatoires. Historiquement, les procédures de coloration ont été utilisées pour montrer les différences sur une base cellulaire. Ces méthodes sont exclusivement des moyens d’analyse visuels ; Néanmoins, leur rôle dans l’analyse rapide et critique est d’une grande importance. Le rouge Congo et le blanc calcofluor sont des colorants utilisés pour détecter les polysaccharides, tandis que le Mäule et le phloroglucinol sont couramment utilisés pour déterminer les différences de lignine, et le bleu de toluidine O est utilisé pour colorer différemment les polysaccharides et la lignine. Les techniques apparemment simples de sectionnement, de coloration et d’imagerie peuvent être un défi pour les débutants. En commençant par la préparation d’échantillons à l’aide du modèle A. thaliana, cette étude détaille les protocoles d’une variété de méthodologies de coloration qui peuvent être facilement mises en œuvre pour l’observation de l’organisation cellulaire et tissulaire dans les parois cellulaires secondaires des plantes.

Introduction

La paroi de cellule végétale est titulaire d'une pléthore d'informations à l'intérieur de ses divers composants: la lignine, la cellulose, les hémicelluloses (xylane, glucuronoxylane, xyloglucane, arabinoxylane, glucane de liaison mixte, ou glucomannane), et de la pectine. Techniques histologiques fournissent des repères visuels importants dans l'étude des différences dans les parois secondaires au niveau organisationnel et cellulaires. Diverses techniques histologiques ont été développés et peuvent être trouvés dans la littérature, mais ces techniques peuvent être difficiles et fastidieux pour les débutants car protocoles très détaillés avec des instructions visuelles simples sont rarement, voire jamais disponible. Le but de cette étude est de fournir des lignes directrices simples pour les techniques de coloration histologique pour obtenir des images de haute qualité.

Sectionner le tissu de la tige est la première étape dans la visualisation des parois cellulaires et des formes cellulaires. Bien que les sections coupées à la main sont peu coûteux et prennent moins de temps pour se préparer, l'utilisation d'un vibratome offre cohérence etdonne des images de haute qualité. L'utilisation d'un vibratome permet de produire des données de meilleure qualité en générant même des sections avec la même épaisseur, ce qui permet de produire des images nettes et réduit de manière significative le risque de produire des différences entre les échantillons inexactes qui serait tout simplement causés par une mauvaise préparation de l'échantillon. Utilisation de résines pour fixer les échantillons frais peut être un défi pour les débutants et peut-être encore temps, même pour des experts quand une analyse qui doit être fait rapidement. En outre, il devient impossible de mesurer une quelconque activité biologique de l'échantillon lorsqu'il a été noyé dans une résine. Une technique simple qui utilise un moule d'agarose et fait maison est utile pour l'enrobage tissus de la tige, et elle peut également être utilisée dans d'autres applications nécessitant une dissection des tissus mous. Par rapport aux échantillons enrobage dans de la résine, ce procédé présente l'avantage de conserver les tissus vivants et de réduire la manipulation de l'échantillon. Sectionnement des tissus par un vibratome est très précis et génère homogenUO sections, qui, en fonction de l'objectif de l'étude, peuvent ensuite être utilisés avec plusieurs techniques de coloration différents.

Les méthodes les plus simples pour visualiser la lignine et d'autres composés aromatiques emploient les rayons ultraviolets (UV). Excitation des molécules aromatiques à base de lumière UV est une technique ancienne, mais il est encore l'un des plus rapides des approches pour la visualisation de la lignine. Cependant, la visualisation UV n'est effectivement pas idéal pour la détection de la lignine parce que la lumière UV va exciter d'autres composés aromatiques. La lignine est composé principalement de trois blocs de construction, les monolignols (alcools hydroxycinnamyl: alcool coniférylique, alcool sinapylique, et de l'alcool p-coumaryl) 1-3. Phloroglucinol tache peut fournir des indices à la mesure de cinnamaldéhydes présents dans le xylème, de fibres et de tissus de la trachée 4. Phloroglucinol est un bon indicateur de cinnamaldéhydes générales et peut différencier entre cinnamaldéhydes et d'autres composés aromatiques. Les monomères d'alcool sinapylique peuvent être détectéset différenciées par l'utilisation de Mäule taches. le bleu de toluidine O est un colorant polychromatique et a la capacité de colorer les différents éléments de la paroi cellulaire dans des couleurs différentes donc 5,6. La principale utilisation de bleu de toluidine O est de détecter la pectine et de la lignine 5,6. L'avantage d'utiliser le bleu de toluidine O, c'est que de nombreux éléments de la paroi cellulaire peuvent être visualisés en une seule étape. Les deux calcofluor blanc et rouge Congo sont faciles à travailler et peuvent être utilisés pour visualiser la cellulose. Calcofluor taches blanches cellulose, callose, et d'autres β-glucanes non-substitués ou substitués faiblement 6-9, tandis que le congo taches rouges directement à β-(1 → 4)-glucanes et notamment de cellulose 10,11. Le but de cette étude est de fournir des lignes directrices simples pour l'utilisation des techniques de coloration ci-dessus pour obtenir des images de haute qualité à partir de A. thaliana tiges.

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Protocole

1. Souches Embedding

  1. Préparer une solution d'agarose à 7% dans l'eau (7 g d'agarose à une électrophorèse de qualité dans 100 ml d'eau distillée). Dissoudre la gélose par autoclavage pendant 20 min ou par micro-ondes pendant 20 min à la plus faible intensité (par exemple, une intensité de 1250 watts à micro-ondes de 10%).
  2. Préparer un moule maison pour intégrer les tiges à l'aide des flacons en plastique.
    1. En utilisant une lame de rasoir, coupez le fond conique d'un bouchon à vis microtube de 2 ml (partie A). Avec une aiguille de seringue, percer un trou dans le bouchon du tube légèrement plus grand que le diamètre de la tige à être noyée. Ensuite, coupez 0,5 cm du fond d'un tube à centrifuger de 0,6 ml (partie B).
    2. Ajouter la portion de 0,5 cm de coupure du tube de 0,6 ml à centrifuger dans le tube de ml prédécoupé 2 à centrifuger. Sceller les deux parties à l'aide de Parafilm (figure 1). NOTE: Le fond du tube est coupée pour faciliter l'élimination de l'échantillon incorporé, après la solidification de l'agarose. Til trou dans le bouchon aidera à tenir la tige stable lorsque la tige est ancrée dans agarose. Le moule servira à tenir l'agarose et tenir la ligne droite de la tige lors de l'incorporation. Le Parafilm tiendra les deux parties, A et B, jusqu'à ce que l'agarose est réglé et la tige est noyée.
    3. En utilisant une lame de rasoir, couper une section de la tige de la zone d'intérêt (par exemple, milieu du premier entre souches). NOTE: Dans l'idéal, la tige doit être coupé juste avant l'incorporation à éviter la destruction par la déshydratation. En variante, la tige peut être stockée temporairement dans une plaque contenant un papier filtre mouillé avec de l'eau. Cette plaque peut être placé sur de la glace avant d'être prêt à être incorporé pour empêcher la déshydratation du tissu et de la déformation. Stockage de la tige pour des périodes de plus de 30 min sans humidité élevée provoque la tige de sécher.
  3. Faire fondre l'agarose au micro-ondes à basse intensité. ATTENTION: La bouteille contenant de l'agarose peut être chaud. Utilisez un gant pour ramasser la bouteille. Que les s agarose fondutand à température ambiante (entre 20 ° C et 25 ° C) jusqu'à ce qu'elle se refroidit à environ 50 ° C.
  4. Pipette lentement 5 ml d'agarose dans le moule en plastique de premade pour remplir le flacon. REMARQUE: Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans les moules. Les bulles d'air causer des trous dans le moule d'agarose et ne couvrent pas complètement l'échantillon de la tige, ce qui mènera éventuellement à la coupe inégale des sections échantillons.
    1. Laissez le agarose refroidir pendant 30 à 60 sec pour devenir semi-solide. Testez avec un petit cure-dent, en s'assurant qu'il peut pénétrer et se tenir debout, mais pas flotter, dans l'agarose. NOTE: Si la tige est placée quand l'agarose est encore chaud, il peut endommager l'échantillon par le flétrissement de la tige, la destruction de la morphologie des cellules.
    2. Placez la tige dans cette fiole d'agarose-rempli. Assurez-vous que la tige reste droit. Placer le bouchon perforé de manière à ce que l'extrémité de la tige est maintenue par le bouchon. Ne pas tourner le bouchon à visser. Parfois, plus d'une tige (d'un seul type) peut être embedded dans un seul flacon; mais dans ce cas particulier, ne pas utiliser le bouchon. REMARQUE: Si le bouchon à visser est activée, la tige va se tordre.
  5. Laisser le flacon à température ambiante ou à 4 ° C pendant 10 à 30 min, jusqu'à ce qu'elle se solidifie.
  6. Retirer le moule en le faisant glisser doucement hors du tube. Ouvrez le Parafilm. Poussez la partie inférieure de la partie B du moule doucement avec le pouce pour libérer l'agarose solidifié de la partie A sur une lame de microscope en verre.
  7. Couper la tige incorporée agarose en trois parties à peu près égales de 1,2 cm de longueur. Découpez la partie de la tige qui n'était pas dans l'agarose et le jeter.
    1. Stocker ces morceaux de agarose avec l'intégré tiges dans hermétique 2 ml microtubes dans une boîte noire à 4 ° C jusqu'au moment de section. Sinon, stocker les tubes à 4 ° C pendant un maximum d'une semaine. NOTE: Le stockage est possible, mais l'expérimentateur doit être conscient que les tiges intégré sont encore en vie et, en fonction de l'expérience, Des objets pourraient être introduits.

2. Tige de section

  1. ATTENTION: Lire le manuel d'vibratome attentivement et suivez toutes les instructions de sécurité.
  2. Assurez-vous que la platine est propre et complètement sec (libre de tout solide ou liquide). Nettoyez le disque de l'échantillon avec une lame de rasoir pour enlever la colle résiduelle à partir d'expériences antérieures et laver avec de l'eau. Puis sécher avec une serviette en papier. NOTE: Cela permettra d'assurer que la colle fonctionne bien et se lie à l'échantillon d'agarose. Si cette étape n'est pas fait correctement, il est possible que l'échantillon peut ne pas adhérer au disque et seront par la suite provoquer le spécimen à tomber le disque pendant la coupe.
    1. Utilisez du papier essuie doux pour enlever toute l'humidité du bloc d'agarose contenant les échantillons.
    2. Placer une petite goutte de colle pour tissus sur le disque de spécimen. Tués sur l'adhésif pour couvrir la zone au milieu de la plaque à l'aide de la pointe de la bouteille d'adhésif. Place rapidementle bloc d'agarose de telle sorte que les échantillons sont soit perpendiculaire ou parallèle à la plaque transversale pour des sections transversales ou longitudinales, respectivement. Laisser l'adhésif pour fixer l'échantillon sur la platine à la température ambiante ou à 4 ° C pendant 10 à 30 min. NOTE: Il s'agit d'un pas de temps sensible.
  3. Fixer la platine en place sur le plateau de tampon ou creux. Les blocs d'agarose / s avec les sections doivent être en parallèle avec la lame de rasoir. Remplir le bac tampon avec de l'eau distillée à la température ambiante jusqu'à ce que les échantillons sont complètement immergées.
  4. Couper une lame de rasoir en deux, puis couper les extrémités avec des ciseaux robustes pour que la lame reste plat. Attacher une moitié de la lame de rasoir prédécoupée sur le porte-couteau.
    1. Régler l'angle du support de couteau à 84 °, la vitesse de 0,90 mm / s (position 8 sur le vibratome) et la fréquence de 50 Hz (position 5 sur le vibratome). Couper des sections de 100 um d'épaisseur. Utilisez le mode continu. NOTE: Cette épaisseur a été choisie pour assurer que le tissu peut supporter les divers traitements à l'acide et de la base utilisés dans certains des protocoles de coloration. Réglez la fenêtre pour la coupe et permettre 15-20 min sur un mode continu pour la vibratome à l'article un bloc d'agarose d'environ 1,2 cm.
  5. Recueillir les sections à l'aide d'une pipette en plastique jetable pendant la coupe dans le bac tampon. Alternativement, les sections peuvent être transférés dans le bac tampon dans un récipient en verre, puis à une boîte de Pétri clair. Transférer quelques sections les 2,0 ml microtubes. Remarque: Les échantillons sont prélevés à partir d'une boîte de Pétri, car il est plus facile de voir les sections sur un fond clair, et parce que le bac tampon peuvent être apprêtées pour l'échantillon suivant.
  6. Les sections peuvent être stockés dans un tube de 50 ml ou collectés et stockés dans des tubes de 1,5 à 2 ml de microcentrifugation à 4 ° C pendant 30 à 60 min. NOTE: Le stockage des sections pour de plus longues périodes entraîne une mauvaise qualité d'image.

3. Microscope et Réglage de l'appareil pour l'imagerie

  1. Régler l'éclairage Koehler sur la loupe. Choisissez un objectif. Focus sur l'échantillon d'abord. Amener l'intensité lumineuse à la moitié ou moins. Fermer le diaphragme de champ (FD) et l'ouverture (AP) ou l'amener au niveau le plus bas possible sur cet objectif particulier.
    1. Plus le grossissement est élevé, plus l'anneau aura. Utilisez le bouton de mise au point condenseur à concentrer les iris sur le terrain aussi fortement que possible.
    2. Porter lentement l'image de l'iris sur le terrain (petit anneau en forme de hexagone) au centre en utilisant les boutons condenseur-centrage (vis en forme de broche entourant le condenseur). Augmentez progressivement le diaphragme (FD) de telle sorte que l'iris de terrain atteint le bord. Arrêtez l'augmentation de la FD juste après le diaphragme de champ a passé le bord.
    3. Lentement augmenter l'ouverture (AP) pour régler le contraste. Réglez l'intensité lumineuse au besoin. REMARQUE: éclairage Koehler doit être ajustée pour chaque objectif, chaque jour expérimental. Notez les numéros obtenus après ajustement pour la journée. Ces chiffres seront réutilisés chaque fois que les objectifs sont mis en arrière pour ce jour particulier.
  2. Réglez l'ouverture, l'intensité, la durée d'exposition, le gain et filtres tels que décrits dans le Tableau 1. Cette information devrait être utilisé comme un guide.
  3. Utilisez un appareil photo numérique haute résolution avec un grand capteur CCD format interligne sans obturateur mécanique pour capturer des images de fluorescence; et une haute résolution, appareil photo à haute vitesse pour des images lumineuses-terrain.
  4. Traiter les lames en utilisant un logiciel standard. Chargez le logiciel. Cliquez sur "Acquire" et "Set caméra / planche", puis sélectionnez l'appareil à utiliser. Cliquez sur "OK". Cliquez sur "acquérir" puis "onglet Couleur." Sous "onglet en couleur," choisir "méthode Bayer" suivi de "moyenne quatre." Ajouter le gain proposé (rouge, vert, bleu) vientm Tableau 1. Sélectionnez l'onglet "Set sauver" et cliquez sur le répertoire où les images doivent être stockées. Réglez "temps d'exposition" à partir des suggestions dans le tableau 1. Set "Regroupement" à "1" et "binning Live" à "1". Mise au point sur ​​la zone d'intérêt, puis cliquez sur "Enregistrer en direct."
  5. images de sortie sur le logiciel de l'appareil photo sont au format "TIF". Analyser les images pour l'histochimie des types cellulaires. Utilisez un logiciel standard de l'ordinateur pour des utilisations en aval de présentation et de publication.

4. Ultraviolet et brillant champ d'imagerie

  1. Utiliser une pipette de 1 ml avec la coupe de la pointe de pipette de sorte que les sections peuvent être introduits à la pipette facilement. Doucement sections de pipette dans la pointe et sur une lame de microscope. Couvrir les sections avec une lamelle. Respecter les sections sous lumière UV ou un éclairage lumineux-champ.

5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Coloration 12

  1. Dissoudre 0,3 g de phloroglucinol dans 10 ml d'éthanol absolu pour obtenir une solution de phloroglucinol de 3%. Mélanger un volume de HCl concentré (37 N) à deux volumes de 3% phloroglucinol dans l'éthanol; cette solution est le phloroglucinol-HCl (Ph-HCl) ou Wiesner taches. NOTE: Cette solution doit être fait frais le jour de la coloration et ne peut pas être stockée, parce que la solution se dégrade au fil du temps et la coloration sera inefficace. ATTENTION: HCl est très corrosif, donc à utiliser une extrême prudence lors de la manipulation de la tache Ph-HCl.
  2. Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter 1 ml de la solution-Ph HCl dans le tube contenant les sections et couronner le tout de suite car le HCl dans la tache Ph-HCl est très corrosif. Déplacez doucement le tube pour assurer que toutes les sections sont colorées. Une alternative à cette étape est de maintenir le bouchon du tube ouvert de façon que le pH de la solution-HCl peut être introduit à la pipette de haut en bas, de préférence sans perturber le sections. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette, car cela pourrait endommager ces articles.
    1. Utiliser une pipette de 1 ml avec la coupe de la pointe de pipette de façon à ce que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans dommage. Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope. Couvrir les sections avec lamelle. Respecter les sections sous un éclairage lumineux-champ. NOTE: La solution Ph-HCl sèche en 5-10 min, provoquant une détérioration des échantillons. Par conséquent, l'imagerie doit être complété dans ce délai de temps.

6. Mäule coloration 13,14

  1. Dissoudre 0,2 g de permanganate de potassium dans 40 ml d'eau distillée pour préparer une solution de permanganate de potassium à 0,5%. Stocker dans une bouteille sombre à la température ambiante pendant un maximum de 7 jours.
    1. Préparer une solution de HCl à 3,7% par addition de 1 ml de HCl concentré (37 N) à 9 ml d'eau distillée (01:10). Préparer une solution de HCl de 3,7% sur le fraisjour de l'expérience. Assurez-vous que la solution stock HCl 37 utilisé n'est pas trop vieux. Une solution d'hydroxyde d'ammonium concentré (14,8 M) doit être conservé à 4 ° C pour empêcher la molarité de la solution saturée de diminuer.
  2. Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter 1 ml de la solution à 0,5% de permanganate de potassium dans le tube contenant les sections.
    1. Pipeter la solution de permanganate de potassium à 0,5% et doucement, de préférence sans perturber les sections. Incuber pendant 2 min et répéter le pipetage. Laissez le microtube reposer jusqu'à ce que toutes les sections s'installent. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette que les sections peuvent être endommagés. Il peut être difficile de voir les sections de souches que la solution est sombre, alors gardez le tube avec les sections sur la grille de tube à essai et leur permettre de se contenter de 2 min.
    2. L'utilisation d'une pipette de 1 ml, tirer 700 ul de solution de permanganate de potassium à 0,5%.Ajouter 700 ul d'eau distillée pour rincer la solution de permanganate de potassium. Répétez 3-4x ou jusqu'à ce que la solution de l'eau reste claire.
    3. Jeter l'eau. Ajouter rapidement 1 ml de HCl à 3% jusqu'à ce que la couleur brun foncé est déchargé des sections. Cela peut arriver dans 3-5 min ou peut nécessiter 2 lavages de 5 min chacune. Introduire à la pipette sur toute la solution HCl 3% et procéder immédiatement à l'étape suivante.
    4. Ajouter 1 ml de solution d'hydroxyde d'ammonium concentré. Utiliser une pipette de 1 ml avec la pointe de coupe de telle sorte que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans dommage. Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope. Couvrir les sections avec une lamelle. Respecter les sections sous un éclairage lumineux-champ. ATTENTION: En raison de l'hydroxyde d'ammonium est extrêmement corrosif, il nécessite des soins et d'attention pour éviter de provoquer la corrosion de la platine du microscope ou objectif. NOTE: Les vapeurs d'hydroxyde d'ammonium peuvent brouillard la lamelle, il est difficile d'observer l'échantillon. Donc être très prudent avant d'ajouter la lamelle. La solution sèche en 5-10 min, afin de l'imagerie doit être terminé dans ce laps de temps.

7. Congo-Rouge coloration 11,15

  1. Dissoudre 0,5 g de rouge Congo dans 100 ml d'eau distillée pour préparer une solution à 0,5% rouge congo.
  2. Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter 1 ml de la solution de rouge Congo à 0,5% pour le tube. Pipette doucement la solution rouge de 0,5% congo de haut en bas sans déranger les sections. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette que cela pourrait endommager les sections.
    1. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes et répéter le pipetage. Suivre avec un autre 3 min d'incubation à température ambiante.
    2. Utilisez une pipette de 1 ml à tirer 700 pi de solution à 0,5% rouge congo. Ajouter 700 ul d'eau distillée pour rincer la solution rouge congo. Répétez le lavage 3-4x jusqu'à ce que la solution de lavageest clair.
    3. Utiliser une pipette de 1 ml avec sa coupe de la pointe de telle sorte que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans dommage. Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope, et les couvrir avec une lamelle. Respecter les échantillons sur la lame de microscope sous la lumière bleue excitation en utilisant un filtre passe-bande avec un 560/40. NOTE: Ne pas stocker les sections dans l'eau pendant longtemps avant l'analyse microscopique, comme l'eau va laver le rouge congo en 10-30 min.

8. Calcofluor Blanc coloration 9

  1. Dissoudre 0,02 g d'azurant optique 28 (calcofluor blanc M2R) dans 10 ml d'eau distillée pour préparer une solution stock à 0,2%. La solution à 0,2% peut être stocké pendant six mois dans une bouteille sombre à 4 ° C. Préparer une solution de travail de 0,02% par dilution de la solution à 0,2% du stock 10x avec de l'eau distillée.
  2. Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter dans le tube 1 ml de 0,02% calcofLuor solution blanc. Pipette doucement la solution blanc 0,02% de calcofluor de haut en bas. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette que cela pourrait endommager les sections.
    1. Incuber à température ambiante pendant 5 min et répéter le pipetage. Incuber la section pour un autre 3 min à température ambiante. REMARQUE: Laissez les sections à régler sur le fond du tube pour faciliter à la pipette la solution sans endommager les sections.
    2. Utilisez une pipette de 1 ml à tirer 700 pi de solution blanc 0,02% de calcofluor et ajouter 700 ul d'eau distillée; attendre 5 min pour rincer la solution de blanc d'calcofluor. Répétez le lavage 3-4x. Utiliser une pipette de 1 ml avec la coupe de la pointe de la pipette de telle façon que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans dommage.
    3. Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope et les recouvrir d'une lamelle. Respecter les sections sous lumière UV.

9. Toluidine Blue O coloration 16,17

  1. Dissoudre 0,02 g de bleu de O toluidine dans 100 ml d'eau distillée pour préparer une solution à 0,02%. NOTE: La solution de bleu de toluidine O peut être stocké pendant deux semaines dans une bouteille sombre à la température ambiante.
  2. Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter 1 ml de la solution de bleu de O toluidine 0,02% d'au tube. Pipette doucement la solution à 0,02% de bleu de toluidine O de haut en bas. Puis incuber à température ambiante pendant 5 min et répéter une fois le pipetage. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette que cela pourrait endommager les sections. Laissez le microtube rester immobile jusqu'à ce que les sections s'installent. Cela peut être difficile à voir, car la solution est sombre, alors gardez le tube contenant les sections sur la grille de tube à essai et leur permettre de se contenter de 2 min à température ambiante.
    1. Utilisez une pipette de 1 ml à tirer 700 pi d'une solution à 0,02% de bleu de toluidine O. Ajouter 700 ul d'eau distillée pour rincer le bleu de toluidine O solution. Répétez 3-4x ou jusqu'à ce que la solution de lavage est clair. Utiliser une pipette de 1 ml avec la coupe de la pointe de pipette de façon à ce que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans les endommager.
    2. Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope et les recouvrir d'une lamelle. Respecter les sections sous un éclairage lumineux-champ.

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Résultats

Tige inclusion et la coupe:
L'utilisation du moule en matière plastique à incorporer le fait maison tiges dans 7% d'agarose révélée être rapide et facile (figure 1). Les deux parties (A et B; figure 1) du système de flacon intégré le rendent simple pour libérer facilement la tige intégré dans agarose comme l'agarose ne colle pas aux parties des flacons qui sont inertes, maintenir le système propre. Les flacons peuvent être réutilisés plusieurs fois pendant des années....

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Discussion

Sections de la tige A. thaliana sont largement utilisés pour étudier l'organisation des cellules dans la paroi de la cellule secondaire et pour examiner les différences entre qualitativement type sauvage et des plantes transgéniques. Les techniques couramment utilisées pour sectionner les spécimens sont coupe de main directe; ou lorsque les spécimens sont intégrés dans agarose ou fixateur, la coupe peut être fait avec un vibratome ou microtome. A la différence de la découpe de la main, les deux derniers per...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit financier à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Sabin Russell pour aide à l'édition. Ce travail faisait partie de l'Institut mixte bioénergie DOE (http://www.jbei.org) soutenue par le Département américain de l'énergie, Bureau de la science, Bureau de la recherche biologique et l'environnement, par le biais du contrat DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley National Laboratory et l'US Department of Energy.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseEMDMERC2125Numéro CAS : 9012-36-6
PhloroglucinolSigmaP 35021,3,5-trihydroxybenzène [Numéro CAS : 108-73-6]
Acide chlorhydriqueEMDHX0603-75Numéro CAS : 7647-01-0
Hydroxyde d’ammoniumEMDAX1303-6Numéro CAS : 1336-21-6
Toulidine Blue OSigmaT3260Chlorure de blétène, chlorure de tolonium [numéro CAS 92-31-9]  ;
Permanganate de potassiumSigma223468numéro CAS 7722-64-7  ;
Éthanol 190 proofKOPTECV1401Numéro CAS : 64-17-5
Congo RedSigma  ;C6277Disodium 3,3'-[[1,1'-biphényl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphtalène 1-sulfonate) [Numéro CAS 573-58-0]
Azurant 28/ Calcofluor Teinture BlancheSigmaF3543  ;Acide 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyéthyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbène-2,2'-disulfonique [numéro CAS 4404-43-7]  ;
VibratomeLeicaLeica Microtome à lame vibranteVT1000S http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
RazorAmerican Safety razor companyArticle # 60-0139-0000  ;Lame à double tranchant en acier inoxydable (Personna Super)
Tubes de microcentrifugation à bouchon à vis (2 ml)VWR16466-044
Tubes de microcentrifugation (0,6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
MitaineBel-Art380000000SCIENCEWARE  ; Hot Hand Protector Mitt
Adhésif en tissuTed Pella Inc10033Magasinez à 4 ° ; C ou 20 ° ; C pour une conservation de 3 mois ou plus
Micro-ondesPanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 Adhésif tissulaire instantané  ;
Caméra avec puce CCD sans obturateur mécaniqueHamamatsuC4742-95
Caméra couleur haute vitesse  ;   ;   ;QImagingMicroPublisher 5.0 RTV
Logiciel de caméra  ;  ; Molecular DevicesMetaMorph version 7.7.0.0
Imaginer l’anaylsis  ;Adobe  ;Lunettes Photoshop CS4
Micro Cover, carrées, n° 1VWR48366-06722 x 22 mm (7/8 x 7/8") - Les lunettes sont résistantes à la corrosion et uniformément épaisses et plates. L’épaisseur n° 1 est de 0,13 à 0,17 mm.
Micro lames givrées, 1 mmVWR48312-00375 x 25 mm - 1 mm Emballage
Parafilm MAlcanBRNDPM998
TX2 Filtre cubeLeica11513851/11513885Filtre utilisé pour l’analyse du rouge Congo avec une bande passante de 560/40.

Références

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