Transcription et profilage des métabolites pour l'évaluation des arbres tabac et le peuplier comme matière première pour l'industrie de la bioéconomie

Résumé

La biomasse végétale offre une ressource renouvelable pour plusieurs produits, y compris le carburant, l'alimentation, la nourriture et une variété de matériaux. Dans cet article, nous étudions les propriétés de l'arbre de tabac (Nicotiana glauca) et de peupliers de sources appropriées pour un pipeline de bioraffinerie.

Résumé

La demande mondiale pour l'alimentation, l'alimentation, l'énergie et l'eau pose des défis extraordinaires pour les générations futures. Il est évident que les plates-formes robustes pour l'exploration des ressources renouvelables sont nécessaires pour surmonter ces défis. Dans le cadre multinational MultiBioPro nous développons pipelines de bioraffinage afin de maximiser l'utilisation de la biomasse végétale. Plus précisément, nous utilisons le peuplier et l'arbre de tabac (Nicotiana glauca) comme espèces cultivées cible pour l'amélioration de la saccharification, isoprénoïdes, teneurs en hydrocarbures à chaîne longue, qualité de la fibre, et subérine et la lignine contenu. Les méthodes utilisées pour obtenir ces résultats comprennent GC-MS, LC-MS et plates-formes de séquençage de l'ARN. Les pipelines de métabolites sont des outils bien établie pour générer ces types de données, mais aussi les limites de ce que les métabolites seulement bien caractérisé peuvent être utilisés. Le séquençage profonde nous permettra d'inclure toutes les transcriptions présents pendant les stades de développement de l'arbre de feuilles de tabac, mais hà être mappé vers la séquence de Nicotiana tabacum. Avec ces montages, nous visons à une compréhension de base pour les processus sous-jacents et à établir un cadre industriel pour exploiter les résultats. Dans une perspective à plus long terme, nous croyons que les données générées ici fourniront moyen d'un processus de bioraffinerie durable en utilisant peuplier et le tabac comme matière première. À ce jour, le niveau de base de métabolites dans les échantillons ont été analysés et les protocoles utilisés sont fournis dans cet article.

Introduction

Population et la croissance économique ont provoqué une demande croissante de nourriture, d'eau et de combustibles. Une grande partie de ces fournitures sont produits, transformés et transportés par des moyens à base de fossiles-finis, tels que le pétrole. Il est clair, cependant, que cette pratique n'est pas durable, et le développement de ressources alternatives sera donc d'une grande importance ^1. Beaucoup de ressources renouvelables sont, à des degrés divers, déjà exploitées, y compris le vent, le mouvement de l'eau, solaire, géothermique, et agitent des sources d'énergie à base. Une autre ressource durable et largement inexploité est la biomasse à partir de plantes. Cette ressource offre également un moyen très rentable de convertir l'énergie solaire en carburants dérivés ^2. En plus de fournir du carburant à base de bio-, la biomasse végétale offre également des opportunités uniques pour les produits de remplacement, y compris les plastiques, les détergents et les produits chimiques de grande valeur.

La paroi de la cellule végétale, qui se compose essentiellement de polymères à base de sucre, MAKes la masse principale de la biomasse de la plante et beaucoup d'efforts sont actuellement investis dans la conversion efficace en bioéthanol. La biomasse restante peut ensuite être transformé en biogaz et liées au pétrole produits ^3. Une grande partie des espèces de plantes vivaces, y compris les herbes et les arbres, qui produisent de grandes quantités de biomasse cellulosique poussent généralement mieux dans les zones tempérées. Cependant, environ 20% de la superficie des terres semi-arides, et est donc également sujettes à la sécheresse ^4. De toute évidence, il serait intéressant de cultiver aussi ces terres arides avec des plantes qui pourraient contribuer efficacement à la production durable d'énergie et de matériel. Ces plantes ont besoin d'avoir une efficacité de l'utilisation optimale de l'eau et résistance à la sécheresse et inclurait l'arbre de tabac (Nicotiana glauca) et des espèces du genre Agave.

Le consortium MultiBioPro vise à mettre en œuvre un pipeline de bioraffinerie intégrée, en utilisant les deux cr importanteespèces op, le peuplier et l'arbre de tabac. Peuplier a émergé comme une culture de biocarburant prometteur car il est de plus en plus rapidement, facilement propagées par clonage et hautement adaptable à un large éventail de conditions climatiques et pédologiques. Il fournit également un large éventail de bois, de fibres, bois de chauffage, et d'autres produits forestiers ^5. L'arbre de tabac est également apparu comme une plante adaptée à des fins de biocarburants et bioraffinage. Il produit généralement des quantités importantes de biomasse, contient de grandes quantités d'hydrates de carbone non structuraux ^6, et a également la capacité rare d'accumuler de grandes quantités d'huiles non alimentaires facilement extractibles (y compris à longue chaîne C _{29-C 31} hydrocarbures saturés et triterpenoids) qui sont appropriés pour le biodiesel production. L'arbre de tabac est, en outre, se prêtent à l'amélioration génétique, a une capacité de germination élevé, et pousse joyeusement sur des sols semi-arides ne sont pas utilisés pour la production alimentaire. Il apparaît donc que les deux peupliers et d'arbres de tabac ont le potentiel intrinsèque pour multiparebjectif cultures, c'est à dire que les nouvelles matières premières de grande valeur pour une industrie à base de bio-intégration. Dans cet article, nous nous concentrons sur ensemble d'approches diverses de discerner les hydrocarbures à chaîne comment dépôts d'arbres de tabac longues.

Dans une tentative pour identifier le mécanisme moléculaire sous-jacente responsable de la production et de la sécrétion des hydrocarbures à longue chaîne saturés sur les feuilles de tabac, nous appliquons «omiques» modernes technologies basées. Cela comprend l'ARN suivants d'une série de feuilles de développement (dix étapes), et multiplateforme métabolite méthodes de profilage utilisant LC et GC-MS (pour les métabolites et lipidomique polaires et non polaires). Ces données seront utilisées pour extraire de l'expression du gène qui est en corrélation avec, ou précède, l'apparition de la biosynthèse des molécules indiquées ci-dessus. Gènes et les voies qui semblent prometteuses de ces efforts seront utilisées pour les tests fonctionnels dans le espèce Arabidopsis modèle et pourraient à terme être prête pour l'ingénierie biotechnologique dans tobarbre acco.

Protocole

1. Matériel végétal

Faire pousser des plantes Nicotiana glauca dans 30 pots cm de diamètre contenant un milieu de culture M2 professionnel. Cultiver des plantes dans une serre, avec une température diurne de 20 à 25 ° C et température nocturne de 15 ° C. Utiliser une lampe de 16 h et le cycle de l'obscurité de 8 heures que le régime de lumière supplémentaire.

2. Préparation de l'échantillon

1. Pour métabolites primaires:
   1. matières végétales de récolte (feuilles et tiges de N. glauca) et le matériel de gel immédiatement.
   2. Lyophiliser matériaux végétaux surgelés par lyophilisation pendant trois jours.
   3. Broyer les échantillons lyophilisés par vibro-broyeur avec des boules métalliques.
   4. Aliquote amende sol matériaux secs dans un tube de centrifugeuse de 2 ml ou un flacon de verre.
2. Pour métabolites secondaires:
   1. tissus végétaux de récolte et de matériel de gel immédiatement.
   2. Broyer les tissus végétaux congelés par mmoulin à ixer avec bille en acier inoxydable ou en mortier et un pilon.
   3. Aliquotes tissus sol fines dans 2 ml tube de centrifugation (environ 20 mg de poids humide).

3. Protocole d'Extraction de profilage des métabolites de métabolites primaires par GC-MS

1. matériel végétal sec au sol aliquote (10 mg de feuilles et de 20 mg de matières souches) dans 2 ml, bouchon à vis, tubes à fond rond.
2. Ajouter 1400 pi de methanol à 100% et vortex pendant 10 s.
3. Ajouter 60 ul de ribitol (0,2 mg / ml d'actions en H ₂ O) comme une norme quantitative interne et vortex pendant 10 secondes.
4. Ajouter un acier inoxydable (ou zircone) balle et d'homogénéiser les matériaux avec un vibro-broyeur pendant 2 min à 25 Hz.
5. Centrifuger le mélange pendant 10 min à 11 000 x g.
6. Transférer le surnageant dans un flacon en verre.
7. Ajouter 750 ul de chloroforme.
8. Ajouter 1500 pi de H ₂ O et vortex le mélange pendant 10 secondes.
9. Transférer 150 ul de laphase supérieure (phase polaire) dans un nouveau tube de 1,5 ml de la centrifugeuse.
10. Les échantillons secs à l'aide d'un aspirateur de vitesse. Il est impératif que les échantillons sont réduits à siccité pour entre 3 et 24 heures jusqu'à ce qu'aucun liquide résiduel est présent.
11. Ajouter 40 pi de chlorhydrate de méthoxyamine (20 mg / ml dans de la pyridine).
12. Agiter le mélange dans un shaker horizontale du bloc de la chaleur pendant 2 heures à 37 ° C.
13. Ajouter 70 ul de N-méthyl-N - (triméthylsilyl)-trifluoroacétamide MSTFA mélange.
14. Agiter le mélange pendant 2 heures à 37 ° C.
15. Isoler les gouttes sur le couvercle par une courte centrifugation ~ 1 min à 11 000 x g.
16. Transférer le liquide dans des flacons en verre appropriés pour l'analyse GC-MS.

4. Extraction de profilage des métabolites de métabolites secondaires par LC-MS

1. Ajouter 500 ul de methanol pour les échantillons de sol gelé.
2. Agiter avec une thermomixer pendant 15 min à 70 ° C (1 000 sec ^-1).
3. Centrifuger les échantillons (5 kmn, 20 000 x g) et la phase liquide transféré dans un tube de 1,5 ml de la centrifugeuse.
4. Lyophiliser la phase liquide dans un évaporateur centrifuge (speedvac).
5. Ajouter 100 pi de cyclohexane et 100 pi d'eau milliQ au culot sec.
6. Agiter les échantillons pendant 5 min à température ambiante (utilisation de vortex).
7. Centrifuger les échantillons (5 min, 20 000 xg).
8. Transférer 80 ul de la phase aqueuse (phase inférieure) pour flacons d'injection LC-MS à fond conique pour l'analyse LC-MS.

5. Analyse des données

1. Configurez Xcalibur, MarkerLynx, Metalign ⁷ ou ⁸ XCMS et sélectionnez l'analyse de données à traiter.
2. Préparer un tableau de pics détectés de votre intérêt conformément à la classe de composés dans le tableau 1.
3. Identifier les pics par co-élution de composés standard.
4. Annoter la suite pics détectés en utilisant une analyse MSN, algorithmes de caractérisation structurale ^9,10, la littérature sNQUETE et métabolite recherche ^11,12 de base de données.

6. Hydrocarbures ¹³ Extraction

1. Immerger N. fraîchement récoltés feuilles glauca (~ 200 mg) dans un solvant (methanol, l'éthanol, le chloroforme, l'hexane ou l'éther de pétrole (point de 40 à 60 ° C ou de 60 à 80 ° C point d'ébullition) (5 ml; qualité HPLC) pour 2 à 20 min.
2. Enlevez les feuilles et sécher complètement les solvants par évaporation rotative.
3. Remettre en suspension les échantillons dans de l'hexane (1 ml; qualité HPLC).
4. Effectuer une analyse GC-MS en utilisant la chromatographie de gaz et un trait d'union à un 5973MSD. Les conditions d'exploitation devraient être les suivants; gaz vecteur, l'hélium avec un débit de 0,9 ml min ^-1 / 11 psi d'écoulement. Injecter des échantillons (1 pi) avec un injecteur sans division à 280 ° C. Maintenir le four de chromatographie en phase gazeuse à 70 ° C pendant 5 min avant de rampe à 4 ° C / min jusqu'à 320 ° C. Maintenir la température finale pendant 10 minutes supplémentaires, ce qui en un temps total de 67,5 min. Régler l'interface avec la MS à 280 ° C et perform MS en mode analyse complète en utilisant 70 eV assurance-emploi + et numérisée de 10 à 800 D.
5. Traiter d'abord les composants de chromatogramme par déconvolution de MS système automatisé d'identification, et ceux qui sont identifiés à l'aide de la bibliothèque MS NIST 98.
6. Confirmer l'identification d'hydrocarbures saturés à chaîne longue (alcanes hexacosenol, nonacosane, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane et tritriacontane) en comparant les temps de rétention et des motifs de fragmentation classiques aux normes authentiques connus.
7. Déterminer hydrocarbures quantitativement en comparant les aires des pics intégrés avec des courbes dose-réponse (de 0,07 à 2,5 mg), construits à partir des normes authentiques.
8. Calculer les moyens et l'erreur type de la moyenne (SEM) en utilisant le logiciel Excel.

7. Analyse des isoprénoïdes ¹⁴

1. Effectuer homogénéisation tel que décrit dans la section 2. Peser 10 mg de poudre lyophilisée homogénéisé dans un tube de centrifugeuse.
2. Ajouter successivement 250 ml de méthanol sur la poudre, mélanger, puis ajouter 500 ml de chloroforme (réactif de laboratoire de grade), et mélanger au vortex.
3. Laisser les échantillons sur la glace dans l'obscurité pendant 20 min.
4. Ajouter 250 ml de tampon Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) ou de l'eau (qualité HPLC) à la suspension et mélanger au vortex.
5. Centrifuger le mélange à 12 000 tours par minute (13 523 x g) pendant 5 minutes pour séparer le non-polaire à partir de phases aqueuses. La phase chloroformique contenant des extraits non polaires est isoprénoïdes en bas.
6. Transférer la phase dans un nouveau tube de centrifugation.
7. Ajouter un montant supplémentaire de 500 ml de chloroforme à la phase aqueuse, et procéder à une seconde extraction par vortex et centrifugation comme décrit ci-dessus.
8. On combine les extraits de chloroforme et de traduire les échantillons à sec à l'aide de l'évaporateur et de conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
9. Ajouter de l'acétate d'éthyle de 50 ml (qualité HPLC) à l'extrait séché isoprénoïde pour redissoudre la matière.
10. Injecter 3 ml sur une C18colonne en utilisant un module de séparation Acquity UPLC. Le gradient utilisé pour séparer les pigments devrait comprendre; A: un mélange méthanol / H ₂ 0 (50:50) et B: acétate d'acétonitrile / acétate d'éthyle (75:25), et les conditions initiales soient A 30% (v / v) et B à 70% (v / v) allant de 100 % B de plus de 6 min. Utilisez un taux de 0,6 ml / min.
11. Surveiller continuellement l'éluat avec une matrice de diodes d'images (PDA) du détecteur de 250 à 600 nm.
12. Identifier les composants par co-chromatographie et comparaisons spectrales entre les normes authentiques, bêta-carotène (provitamine A), phytoène, le lycopène, la lutéine et la zéaxanthine.
13. Effectuer la quantification à partir des courbes dose-réponse.
14. Confirmez composés par LC-MS; utiliser des conditions chromatographiques similaires. Détection doit être effectuée à l'aide APCI ionisation en mode positif avec un instrument Q-Tof.
15. Effectuer des modifications pour la détermination de tocophérol avec la matière séchée 25 mg de gel qui ont été extraites et saponification dans 6% de KOH à 50 ° C pendant 1,5 h.

8. Extraction d'ARN de l'ARN Seq

Ce protocole combine l'extraction d'ARN Trizol avec un kit RNeasy pour obtenir l'ARN de haute qualité.

1. Broyer 100 mg de matière végétale congelée dans 2 ml des tubes de centrifugation avec une boule de métal d'un broyeur mélangeur.
2. Ajouter 1 ml Trizol.
3. Centrifuger le matériau pendant 10 min à 12 000 xg à 4 ° C.
4. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de réaction.
5. Ajouter 200 ul de chloroforme, inverser le tube plusieurs fois, et laisser incuber 3 min à température ambiante.
6. Centrifuger le mélange pendant 15 min à 12 000 g à 4 ° C.
7. Transférer la phase aqueuse supérieure (environ 700 ul d') dans un nouveau tube de réaction.
8. Ajouter environ 2,5 volumes d'éthanol (100%), inverser le tube plusieurs fois, et incuber pendant 30 min à -80 ° C.
9. Déplacer l'échantillon, y compris tout précipité de la colonne de centrifugation de kit.
10. Centrifuger la colonne pendant 15 secondes à 8000 xg, et jeter le fbas à travers.
11. Ajouter 700 ul de tampon RW1 à la colonne et centrifuger pendant 15 s à 8000 x g. Jeter l'effluent à travers.
12. Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne et centrifuger la colonne pendant 15 secondes à 8000 x g. Jeter l'effluent à travers.
13. Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne et centrifuger pendant 2 min à 8000 x g.
14. Placer la colonne spin dans un nouveau tube de 1,5 ml de réaction et ajouter 50 l'eau sans RNase-pi.
15. Centrifuger la colonne pendant 1 min à 8000 x g pour éluer l'ARN.
16. Éliminer l'ADN résiduel en utilisant un kit gratuit de l'ADN-Ambion selon les instructions du fabricant.
17. Déterminer la qualité de l'ARN. L'ARN doit avoir des numéros de l'intégrité de l'ARN (RIN) ci-dessus 8.
18. Envoyer l'ARN pour le séquençage de prochaine génération.

Résultats

Le profil de HPLC de la figure 1 montre un résultat représentatif de l'analyse des isoprénoïdes de N. glauca extraits de feuilles. Les différents isoprénoïdes de C40 et au-dessus ont été détectés à l'aide d'un tableau photo Diode (PDA) de détecteur. Les pics ont été annotées sur la base de co-chromatographie et la comparaison spectrale entre les normes authentiques, bêta-carotène (provitamine A), phytoène, le lycopène, la lutéine et la zéaxanthine. Les deux chromatogrammes MS dans la figure 2 montrent le résultat de l'analyse des métabolites primaires de N. feuille de glauca et tige matériau, respectivement. Le spectre d'un pic correspondant à la serine (indiqué par une flèche) de la MS est également donnée à titre d'exemple. Figure 3 montre le Bioanalyzer utilisé pour la détermination de la qualité de l'ARN et une sortie représentatif de l'appareil. Les deux principaux pics dans le chromatogramme correspondant à 18 S et 25 S de l'ARN ribosomique, l'ARN intact indiquant dans l'échantillon. Pics supplémentaires de nervure fragmentéosomal ARN semble dans le cas de l'ARN partiellement ou fortement dégradées.

Figure 1. Profil HPLC montrant isoprénoïdes présents dans les extraits de feuilles de N. glauca. plupart des isoprénoïdes de C40 et surtout ne se prêtent pas à l'analyse par GC-MS. Nous avons donc utilisé séparations par CLHP avec détection à barrette de photodiodes. Un chromatogramme typique enregistré à 450 nm est représentée. Les pigments caroténoïdes sont typiques des tissus photosynthétiques avec lutéine prédominant. Egalement présent est la zéaxanthine, qui se trouve rarement dans les tissus foliaires moins placée sous stress lumineux élevé. Les niveaux de zéaxanthine font une bonne source de ce composé à forte valeur ajoutée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 2. Chromatogramme et un spectre MS de N. extraits de tissus glauca. totale d'ions MS chromatogramme (TIC) de feuilles et des tiges extraits mesurées par GC-MS est présenté (70-600 m / z). L'analyse GC-MS a été réalisée comme décrit précédemment en ^15. Pics détectés ont été annotés en utilisant la bibliothèque de balises spectrales de masse. MS spectre de la sérine (2TMS) est présentée comme un exemple. MS chromatogramme: axe X et l'axe Y indiquent le temps de rétention (min) et l'intensité (l'abondance) du signal, le spectre MS: axe X et l'axe Y indiquent les ratios M / Z et l'intensité (l'abondance) du signal, respectivement. Cliquez ici pour agrandirl'image.

Figure 3. Mesure Bioanalyzer de l'ARN préparé pour l'ARN suivants du N. glauca matériau en feuilles. Pour obtenir l'ARN de haute pureté nécessaire pour l'ARN suivants on a extrait l'ARN en utilisant le réactif Trizol et ensuite purifié l'ARN en utilisant des colonnes à partir de la trousse RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne). Nous avons déterminé la qualité de l'ARN en utilisant la Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Allemagne) affiché sur la gauche. Un exemple d'une sortie Bioanalyseur est donné sur la droite. Les deux principaux pics de l'échantillon représentent 18 S et 25 S ribosomal RNA. Notre échantillon a montré un ARN nombre d'intégrité (RIN) de 9,2, ce qui est bien supérieur à la valeur requise de 8. Cliquez sone pour agrandir l'image.

Discussion

Les protocoles présentés ici fournissent un cadre général pour analyser les feuilles de tabac d'arbres pour les métabolites et les transcriptions. Il est prévu que ces efforts conjugués devraient nous fournir de nouvelles connaissances sur les processus sous-jacents de la synthèse et de l'extrusion des hydrocarbures et les composés à haute valeur présents dans ce tissu. Ces approches doivent donc nous donner une meilleure compréhension de la façon dont les composés sont synthétisés. En plus des arbres aspects de tabac de l'œuvre, il vise également à améliorer la biomasse peuplier, en ciblant particulièrement les lignification de la structure de paroi secondaire, mais aussi d'explorer si nous pouvons utiliser l'écorce pour l'extraction de composés intéressants.

Les méthodes présentées dans ce document sont de légères modifications de méthodes normalisées pour métabolite profilage. Ces méthodes sont bien sûr limités aux profils métaboliques connues, et il est possible que plusieurs nouveaux pics métaboliques peuvent être obtenus pour which pas composé est connu. Nous espérons mettre ces composés dans le contexte d'autres métabolites en combinant le comportement des métabolites et des relevés de notes au cours de la série de temps de développement.

Aucune des méthodes présentées ici sont significativement modifié par des méthodes généralement utilisées pour les matières végétales. L'aspect intéressant réside dans la combinaison de méthodes pour comprendre la structure sous-jacente de longues principalement la production d'hydrocarbures de la chaîne et de la modification dans les feuilles des arbres du tabac. L'une des étapes critiques pour l'obtention de cette information est la combinaison ultérieure des différents types de données. Nous prévoyons que les données que d'une première évaluation seront divisés en différents groupes en fonction du comportement des métabolites / transcriptions sur le développement et que ces données seront utilisées pour déduire transcription vs comportements de métabolites, et également pour les affecter potentiellement certains métabolites de voies . En outre, les analyses basées sur le réseau plus élaborées sont ensuite envisagées to exploiter les relations de cause à effet.

Les protocoles d'analyse présentées ici seront également fournir une base pour le terrain-essais et l'exploitation industrielle de la biomasse. Pour ce faire, le consortium MultiBioPro contient plusieurs partenaires industriels qui ont les capacités d'explorer davantage la biomasse, dans le but d'offrir le biodiesel, le bioéthanol et d'autres composés à haute valeur ajoutée. Ces types d'exploitation de la biomasse seront évalués sur la base; (1) tester la robustesse et la qualité des produits bio produits (essais typiques standard de l'industrie seront effectuées pour s'assurer que les produits générés ont une bonne valeur de marché), (2), une évaluation économique, sociale et environnementale des technologies sera effectuée utilisant des sources de la littérature, des entrevues et du matériel qui est généré au cours des essais sur le terrain et des évaluations de bioraffinage de l'usine pilote. Ces activités comprendront coûts-avantages et l'analyse du cycle de vie, la génération d'un dossier de l'environnement et du marché et Businestratégies ss. Nous croyons que ce pipeline sera un mélange utile du milieu universitaire, de la science et de l'exploitation industrielle appliquée à d'autres biomasse de peuplier et de tabac pour les produits finis de consommation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif Trizol	Invitrogen	15596-026
Chloroforme	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Électrophorèse Bioanalyseur	Agilent	G2939AA
1,5 ml et 2 ml tubes safe-lock	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Billes d’acier	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mélangeur MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifugeuse	Eppendorf	5424