Protéomique quantitative à l'aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

Mesure des différences de concentration de nombreuses protéines entre les échantillons complexes est un défi central en protéomique. De plus en plus, ce qui est fait par marquage des protéines dans chaque échantillon avec des étiquettes isotopiques, combiner les échantillons, et l'utilisation de la spectrométrie de masse pour quantifier les différences de concentration. Plusieurs méthodes existent pour marquage isotopique stable des protéines et des peptides. ¹⁵ N étiquetage ¹ et ² présentent SILAC marqueurs isotopiques métabolique in vivo, alors que iCAT ^3, iTRAQ ^4, et la réduction diméthylation ⁵ ajouter des tags sur les isotopes stables après extraction des protéines et la digestion. Parmi ces méthodes, diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) gagne en popularité comme une méthode reproductible peu coûteux à quantifier les différences de concentration de protéines dans presque n'importe quel type d'échantillon.

Étiquetage Redi implique peptides réagissant avec du formaldéhyde pour former une base de Schiff, qui est ensuite réduitpar cyanoborohydrure. Cette réaction dimethylates groupes amino libres sur N-terminales et latérales de lysine chaînes et monomethylates ProLines N-terminaux. Le protocole décrit ici méthylation peptides dans l'échantillon 1 avec une étiquette "lumière" en utilisant des réactifs avec des atomes d'hydrogène dans leur distribution isotopique naturelle et de l'échantillon 2 avec une étiquette "lourd" en utilisant du formaldéhyde et du cyanoborohydrure deutéré (Figure 1). Chaque groupe amino diméthylé sur un résultat de peptide dans une différence de masse de 6,0377 Da entre la lumière et les formes lourds, qui est utilisé pour distinguer les deux formes à l'aide d'un spectromètre de masse. Plus précisément, les abondances relatives des peptides sont quantifiées comme étant le rapport des aires de chromatogramme d'ions MS1 extraites (MS1 de rapport de surface de pic) de la lumière et de la version lourde pour chaque paire d'ions peptide. L'abondance relative d'une protéine est calculée comme le rapport médian MS1 ​​de surface de pic parmi tous les peptides dans la protéine. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole robuste pour conduitement Redi expériences de marquage par LC-MS/MS qui comprend peptide extraction en phase inverse en phase solide, en colonne étiquetage de Redi, peptide fractionnement par pH basique en phase inverse (BPRP) Chromatographie, et la purification de mélanges de peptides à l'aide StageTips (Figure 2) . Nous discutons des avantages et des limites de l'utilisation étiquetage PENSER pour protéomique quantitative.

NOTE: Cette méthode a déjà été décrite ^12.

Une. Protein Isolation

Préparer 1 mg de protéine cellulaire par lyse des cellules, de préférence par des méthodes physiques telles que la presse française, bourrelet battage ou sonication. Éviter la lyse cellulaire par le lysozyme médiation car l'enzyme confondra mesures de spectrométrie de masse.

2. TCA précipitation des protéines

Ajouter de l'acide trichloroacétique 1 volume (TCA) à 4 volumes de protéines et de froid sur la glace pendant 10 min pour précipiter les protéines. Centrifugeuse à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 1 ml d'acétone glacée et centrifuger à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C. Eliminer le surnageant et inverser le tube sur le banc pour sécher le culot pendant 15 min. boulettes de protéines de magasin à -80 ° C.

3. Dénaturer les protéines et réduire les liaisons disulfures

Resuspendre les protéines à ~ 2 mg / ml dans 500 ul de tampon de dénaturation et de réduction (soit 4 M d'urée ou de 3% de SDS à 50 mM d'HEPES pH 8,5, 5 mM de DTT). En option, inclure un inhibiteur de protéase dans la mémoire tampon. Incuber les protéines de 30 min à 56 ° C, suivies de 10 min à température ambiante.

4. Aklylate Groupes sulfhydryle libre de perturber de façon irréversible la formation de liaisons disulfures

Préparer une solution fraîche 0,3 M iodacétamide dans l'eau. ATTENTION! Iodoacetamide est hautement toxique. Ajouter 25 ul de 0,3 M d'iodoacétamide (15 mM de concentration finale) et 500 ul de protéine et incuber pendant 20 min à l'obscurité à température ambiante. Étancher iodacétamide en ajoutant 10 ul de 300 mM de DTT (5 mM concentration finale TNT). Stocker des protéines alkylés à -80 ° C.

5. Digestion des protéines

TCA précipiter les protéines (comme décrit dans l'étape 2) et remettre en suspension dans 1 ml de 50 mM de HEPES (pH 8,2), 1 M d'urée. Préparer une solution stock de Lysyl endoproteinase (Lys-C) dans de l'eau à une concentration de 2 ug / ul et ajouter 5 pl de la solution de protéine. Faire incuber le mélange pendant 16 heures à température ambiante. S'assurer que la concentration finale Lys-C est de 10 ng / ul, et le rapport protéine-à-LysC (p / p) est 1/50-1/200. Remettre en suspension 20 ug de trypsine de qualité séquençage dans 40 ul de 50 mM d'acide acétique, 5 ul (10 ug de trypsine) à la digestion par Lys-C et incuber pendant 6 heures à 37 ° C. Utiliser la même concentration de la protéase et les ratios protease-à-protéine pour Lys-C, tel qu'utilisé pour la trypsine.

6. Phase inverse Peptide Extraction

1. On acidifie par addition de peptides de l'acide trifluoroacétique (TFA) à une concentration finale de 0,5% (pH d'≈ 2). Attacher une colonne C18 à un collecteur d'extraction. Utilisez le débit le plus élevé possible pour toutes les étapes sauf le chargement et l'élution des peptides.
2. Colonne d'eau avec 6 ml d'acétonitrile (ACN). Laver la colonne avec 6 ml de 80% d'ACN, 0,1% de TFA, puis s'équilibrer avec 6 ml de TFA 0,1%. Ne pas laisser lecolonne fonctionner à sec entre les étapes.
3. Arrêter la pression de vide et charger 500 ug de peptides sur la colonne à un débit d'environ 1 ml / min. Une fois que les peptides sont liés à la colonne, sous vide de redémarrage et laver avec 6 ml de TFA 0,1%, puis avec 3 ml de tampon d'acide citrique (0,09 M acide citrique, 0,23 M de Na ₂ HPO _4, à pH 5,5).
   Nota: Les montants élevés de peptides peuvent être marqués, mais la colonne C18 capacité de liaison devraient être au moins deux fois plus élevées que la quantité de peptide pour éviter la perte de l'échantillon.

7. Sur colonne Peptide étiquetage par réductrice diméthylation (PENSER étiquetage)

Effectuez cette étape sous une hotte chimique que le cyanure d'hydrogène est libéré en faible concentration pendant le processus d'étiquetage.

1. Préparer 12 ml de tampons et de PENSER "lourdes" "légères" à la méthylation des amines peptide libre. Tampon de Redi lumière est constituée de 0,8% de formaldéhyde et 0,12 M cyanoborohydrure de sodium portant des atomes d'hydrogène dans le eEIR naturelles distributions isotopiques dans le tampon d'acide citrique. Tampon de Redi lourde est constituée de 0,8% de formaldehyde deutéré et 0,12 M de cyanoborohydrure de sodium deutéré dans un tampon d'acide citrique.
2. Incuber colonne contenant des peptides par addition de 10 ml soit lumineux ou tampons de Redi lourd pour les colonnes contenant des peptides à raison de 1 ml / min et répéter à garantir un étiquetage complet. Laver la colonne avec 6 ml de TFA 0,1%, puis avec de l'acide acétique à 1 ml de 0,5%.
3. Arrêter le vide et éluer les peptides marqués première avec 1 ml de 40% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5%, puis avec 1 ml de 80% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5% en utilisant un débit d'environ 0,5 ml / min. Si vous le souhaitez, de mesurer l'efficacité de l'étiquetage des échantillons individuels par spectrométrie de masse avant de mélanger des échantillons lourds et légers (voir «Les résultats représentatifs"). Mélanger 01:01 échantillons peptidiques lourdes et légères marqué pour être quantifiée par spectrométrie de masse.

8. Peptide indépendante Mélange de pH basique de la phase inversée (BPRP) de chromatographie </ P>

PH basique en phase inverse (BPRP) chromatographie pour séparer le mélange de peptide en plusieurs fractions, qui sont analysées indépendamment par LC-MS/MS pour augmenter la couverture du protéome.

1. Fractionner le mélange de peptides sur une colonne HPLC C18 en appliquant un gradient de concentration croissante d'ACN dans 10 mM de bicarbonate d'ammonium (pH 8). Commencer avec 5% (v / v) pendant 5 min ACN, augmenter à 35% ACN en 60 min, puis à 90% d'ACN en 1 min. Conserver la CAN de 90% pendant 4 minutes avant de réduire la CAN à 5% de ré-équilibrer la colonne de 9 min. Recueillir 96 fractions de volume égal à une plaque de 96 puits (A1 à H12). Surveiller le fractionnement à l'aide d'un détecteur UV à 220 nm tandis que les peptides sont élution de la colonne (10 à 70 min dans les conditions décrites ici).
2. Combiner les fractions à partir de puits A1, C1, E1, et G1 (fraction A1), à partir de puits B1, D1, F1, H1 et (fraction B1), à partir de puits A2, C2, E2, et G2 (fraction A2) et en conséquence pour l' fractions restantes. Retirez le solvent en utilisant une centrifugeuse sous vide. peptides Remettre en suspension de fractions A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 et B12 dans 130 pi de 1 M urea/0.5% de TFA et purifier l'aide StageTips comme décrit à l'étape 9. magasin fractions B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 et A12 à -20 º C.

9. Purify peptides par Stop and Go Extraction (StageTips)

Préparer C18-StageTip ⁷ microcolonnes par emballage 200 conseils ul de pipettes avec deux C18 disques avec un diamètre interne (ID) de 1,07 mm. Mettez étape Conseils dans des tubes Eppendorf. Utilisez une micro à laver astuces avec 130 ul de méthanol, puis 130 ul de 80% d'ACN, l'acide acétique à 0,5%. Equilibrer StageTips avec 130 ul de 0,1% de TFA. Transfert mélange de peptides à StageTips et laver avec 130 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul d'acide acétique à 0,5%. Éluer les peptides d'abord avec 20 ul de 40% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5%, puis 20 ul de 80% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5%. Combinez éluats unend sec par filtration sous vide.

10. Microcapillaire LC-MS/MS

1. Dissoudre dans peptides 1-5 ul d'acide formique à 5%, 5% de ACN à une concentration d'environ 1 pg / pl. Résoudre ~ 1 pg peptides sur une 100 um x 20 cm C18-inversés colonne de HPLC en phase avec un gradient de 6-22% d'ACN dans de l'acide formique 0,125% appliqué sur 75 ou 100 min à un débit de ~ 300 nl / min.
2. Identifier des peptides en utilisant un Orbitrap Velos LTQ ¹² ou liquide similaire plate-forme de spectrométrie de masse chromatographie avec un spectromètre de masse offrant haute résolution et haute précision de masse. Fonctionner le spectromètre de masse en mode dépendant des données avec un plein MS balayage (résolution de 60000) acquise dans l'analyseur Orbitrap. Générer piège à ions linéaire spectres MS / MS pour les 20 ions les plus abondants détectés dans le spectre MS plein. Régler la commande automatique de gain (AGC) de cibles à 1 x 10 ⁶ pour la pleine MS et 2000 pour MS / MS. Réglez durées maximales d'accumulation d'ions à 1000 mspour MS et 150 ms pour MS / MS. Exclure ions précurseurs de peptides fragmentés de sélection supplémentaire à partir de MS / MS pour 20-60 sec.

11. Acquisition de données MS / MS

Identifier des peptides en comparant les fichiers RAW spectres MS / MS à une base de données théoriques avec un algorithme tel que SEQUEST ⁸ à l'aide de ces paramètres (tableau 1).

Tableau 1. Peptidiques Base de données Paramètres de recherche.

1. Filtrer les peptides à un taux de faux positifs de 1% avec un procédé tel que le ^9-stratégie de cible leurre en utilisant une base de données des cadres de lecture ouverts dans les orientations réelles et inversés.

12. Peptide Quantification

Calculer les domaines de paires lourdes et légères de MS1 extraits ion chromatogrammes (zones de pointe MS1) et le peptide signal-sur-bruit (S / N) ¹⁰ rapports. Inclure paires peptidiques lorsque leur moyenne signal-noirapport est supérieur à cinq soi. Quantifier l'abondance relative d'un peptide dans les deux échantillons en tant que le rapport des aires des pics des versions MS1 lourdes et légères de la même peptide (MS1 de rapport de surface de pic). Calculer l'abondance relative de la protéine comme étant le rapport de la MS1 surface du pic médian de tous les peptides dans la protéine.

Nous avons évalué l'exactitude, la précision et la reproductibilité de l'étiquetage Redi utilisant Saccharomyces cerevisiae et Clostridium phytofermentans lysats de cellules entières. Nous avons d'abord quantifié l'étiquetage efficacité de Redi d'un mélange de C phytofermentans lysats de protéines à partir de cellulose (lourde marqué, H) et le glucose (étiquette de la lumière, L) cultures. Lorsque filtré à un peptide taux de fausses découvertes de 1%, cet échantillon contenait 11 194 séquences peptidiques uniques avec une efficacité de marquage de Redi de 98%. Non fractionnée S. cerevisiae lysat de protéine a été de même marqué avec H ou L réactifs, mélangé à différents rapports, et analysé. différences d'expression des protéines (log 2 (zones médianes de pointe MS1)) reflètent de manière reproductible les ratios les échantillons H et L à laquelle ont été mélangés dans un large éventail de rapports de mélange (figure 3). Plus précisément, le facteur de variation de 99% des protéines ont été mesurées comme étant inférieure à 1,6 fois pour les échantillons mélangés 01:01. Dans01:10 et 10:01 les échantillons, dont 99% étaient des protéines à l'intérieur de 3,8 fois du ratio attendu, montrant une augmentation de l'écart-type à une plus grande distance d'un mélange 1:1. Lorsque l'étiquetage de PENSER a été appliquée à la protéome du Clostridium, nous avons quantifié plus de 2000 protéines avec 94% de protéines mesurées dans les niveaux 2 fois pour les cultures répétées croissance sur glucose (figure 4A). Protéine de pliage changements pour les paires de cultures en double (par rapport à la cellulose en glucose) ont été également fortement corrélés (r 2 = 0,82), (figure 4b). S. comparaisons cerevisiae (figure 3) sont d'une seule culture et montrent ainsi la reproductibilité technique de protéomique quantitative sur la base Redi. C. phytofermentans mesures (figures 4a, b) comparent les cultures afin de reproduire des différences d'expression représentent à la fois des erreurs de mesure et de la variation biologique entre les cultures. Ensemble, ces expériencesments soutiennent que Redi protéomique est une méthode précise et reproductible pour quantifier les différences d'expression des protéines entre les échantillons complexes.

Figure 1. Diméthylation réductrice de peptides en utilisant des réactifs lourdes et légères à dimethylate amines libres. Le même peptide marqué avec de fortes contre réactifs lumière a une masse Da décalage par amine libre 6,0377. Le peptide représenté ici est marqué à la fois à l'extrémité N-terminale et sur une chaîne latérale de la lysine. Image adapté de référence 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Vue d'ensemble de protocole pour la protéomique quantitative par diméthylation réductrice. Chiffres rouges au-dessus des flèches correspondent aux étapes décrites dans le protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Évaluation de l'étiquetage de Redi utilisant Saccharomyces lysats de cellules entières cerevisiae. Les échantillons d'une seule culture ont été marquées avec soit lourde (H) et la lumière (L) réactifs, mélangés à différents rapports (1H: 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1L, 2H: 1L, 5H: 1L, et 10H: 1L), et les différences entre les échantillons de protéines H et L ont été quantifiés que les ratios log 2 MS1 médiane de la zone de pointe (log 2 rapport H / L). La valeur de R 2 une ligne de tendance linéaire à travers toutes les donnéesdes points était de 0,96 (ligne noire); la corrélation de Pearson était de 0,98. limites de confiance (lignes rouges) indiquent la distance perpendiculaire absolue de la ligne de tendance au sein de laquelle 95% des points de données ont été trouvés pour chaque échantillon. Image adapté de référence 12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Quantification de Redi marqué Clostridium phytofermentans protéines à partir de cultures de plus en plus de différentes sources de carbone. A) L'expression de protéine dans une culture de glucose par rapport à une culture répétition de glucose, la culture de l'hémicellulose, et une culture de la cellulose. La fraction de protéines exprimées dans de doubles niveaux: glucose-glucose (94%), glucose-hémicellulose (80%), et glucose-cellulose (49%). B) Plier les changements dans l'expression des protéines de glucose par rapport à des cultures de cellulose sont fortement corrélés (r 2 = 0,82) pour des paires de cultures en double. Images adaptées de référence 12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents ou d'autres conflits d'intérêts.