Protéomique quantitative à l'aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

Summary

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l'analyse des mélanges de protéines à l'aide de l'approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type d'échantillon.

Abstract

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une méthode pour quantifier avec précision les différences d'expression des protéines entre les échantillons à l'aide de la spectrométrie de masse. Étiquetage Redi est réalisée en utilisant soit régulière (lumière) ou deutérés formes (lourds) de formaldéhyde et cyanoborohydrure de sodium à ajouter deux groupes méthyle à chaque amine libre. Ici, nous démontrons un protocole robuste pour l'étiquetage de Redi et la comparaison quantitative de mélanges complexes de protéines. Les échantillons de protéines pour la comparaison sont digérés en peptides, marqués à porter la lumière ou des étiquettes de méthyle lourds, mélangé, et co-analysés par LC-MS/MS. Les abondances relatives des protéines sont quantifiées en comparant les aires des pics du chromatogramme d'ions de versions lourdes et légères marqués du peptide constituant extrait de la MS spectres complet. La méthode décrite ici comprend la préparation d'échantillons par phase inverse extraction en phase solide, en colonne étiquetage de Redi de peptides, un peptide fractionnement par pH rev basephase ersed (BPRP) Chromatographie, et StageTip purification de peptide. Nous discutons des avantages et des limites de l'étiquetage Redi par rapport à d'autres méthodes pour l'incorporation des isotopes stables. Nous soulignons de nouvelles applications utilisant l'étiquetage PENSER comme une méthode rapide, peu coûteux et précis pour comparer l'abondance de protéines dans presque n'importe quel type d'échantillon.

Introduction

Mesure des différences de concentration de nombreuses protéines entre les échantillons complexes est un défi central en protéomique. De plus en plus, ce qui est fait par marquage des protéines dans chaque échantillon avec des étiquettes isotopiques, combiner les échantillons, et l'utilisation de la spectrométrie de masse pour quantifier les différences de concentration. Plusieurs méthodes existent pour marquage isotopique stable des protéines et des peptides. ¹⁵ N étiquetage ¹ et ² présentent SILAC marqueurs isotopiques métabolique in vivo, alors que iCAT ^3, iTRAQ ^4, et la réduction diméthylation

Protocol

NOTE: Cette méthode a déjà été décrite ^12.

Une. Protein Isolation

Préparer 1 mg de protéine cellulaire par lyse des cellules, de préférence par des méthodes physiques telles que la presse française, bourrelet battage ou sonication. Éviter la lyse cellulaire par le lysozyme médiation car l'enzyme confondra mesures de spectrométrie de masse.

2. TCA précipitation des protéines

Ajouter de l'acide trichloroacétique 1 volume (TCA) à 4 volumes de protéines et de froid sur la glace pendant 10 min pour précipiter les protéines. Centrifugeuse à 12 ....

Results

Nous avons évalué l'exactitude, la précision et la reproductibilité de l'étiquetage Redi utilisant Saccharomyces cerevisiae et Clostridium phytofermentans lysats de cellules entières. Nous avons d'abord quantifié l'étiquetage efficacité de Redi d'un mélange de C phytofermentans lysats de protéines à partir de cellulose (lourde marqué, H) et le glucose (étiquette de la lumière, L) cultures. Lorsque filtré à un peptide taux de fausses découvertes de 1%, cet échantillon contenait 11 194 séquences.......

Discussion

Plusieurs points font stable marquage isotopique des peptides en utilisant une méthode intéressante pour la protéomique quantitative diméthylation réductrice (étiquetage PENSER): réactifs peu coûteux en matière d'étiquetage (réactifs coûtent moins de 1 $ par échantillon), la vitesse de réaction rapide (~ 10 min), l'absence de produits secondaires, hauts reproductibilité (figures 3, 4), produits de réaction stables, la capacité à utiliser toute la protéase, et une grande efficacité de l'ionis.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide trichloracétique	Sigma-Aldrich	T9159	précipitation des protéines
Acétone	Sigma-Aldrich	650501	précipitation des protéines
Dodécylsulfate de sodium	Sigma-Aldrich	71736	dénature, réduire les protéines
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	S8045	dénaturer, réduire les protéines
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	dénaturer, réduire, alkylate protéine
Inhibiteur de protéase Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	dénaturer, réduire les protéines
Iodoacétamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	remettre, extraire, marquer protéine
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	C5670	Protéine de remise en suspension
Lysyl Endoprotéase	Wako Chemicals	129-02541	digestion des protéines
Séquençage grade trypsine Promega		V5111	digestion des protéines
Acide acétique	Sigma-Aldrich	320099	digestion des protéines
Acide trifluoroacétique	Sigma-Aldrich	299537	Extraction peptidique en phase inverse
tC18 Sep-Pak C18 cartouches	Waters	WAT054960	Extraction peptidique en phase inverse
Collecteur d’extraction	Eaux	WAT200609	Extraction peptidique en phase inverse
Acétonitrile	Sigma-Aldrich	14261
divers Formaldéhyde	Sigma-Aldrich	252549	" lumière" marquage peptidique
Cyanoborohydrure	Sigma-Aldrich	71435	" lumière" marquage peptidique
Formaldéhyde deutéré	Sigma-Aldrich	492620	" lourd" marquage peptidique
Isotopes CDN	du cyanoborodeutéride de sodium	D-1797	" lourd" marquage peptidique
MES	Sigma-Aldrich	M3671	marquage peptidique
C18-HPLC colonne (4,6 x 250 mm, 5 & micro ; m taille des particules)	Agilent	770450-902	pH basique chromatographie en phase inversée
Acide formique	Sigma-Aldrich	399388	divers
disques C18 Empore	3M	14-386-3  ;	Conseils STAGE
Méthanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips