Lineage reprogrammation de cellules pericyte dérivés du cerveau humain adulte en neurones induits

Résumé

Cibler les cellules du cerveau-résident pour la lignée reprogrammation directe offre de nouvelles perspectives pour la réparation du cerveau. Nous décrivons ici un protocole de la façon de préparer les cultures enrichies en péricytes du cerveau-résident de l'adulte cortex cérébral humain et les convertir en neurones induits par l'expression de retrovirus de facteurs de transcription Sox2 et Ascl1.

Résumé

Direct lignage reprogrammation des cellules non-neuronales en neurones induits (INS) peut fournir des indications sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la neurogenèse et de nouvelles stratégies pour la modélisation in vitro ou la réparation du cerveau malade. Identifier les types de cellules cérébrales-résident non-neuronales qui se prêtent à la conversion directe dans INS pourraient permettre de lancer une telle approche in situ, c'est à dire dans le tissu cérébral endommagé. Nous décrivons ici un protocole mis au point pour tenter d'identifier des cellules dérivées du cerveau humain adulte qui remplissent cette hypothèse. Ce protocole consiste à: (1) la mise en culture de cellules humaines à partir du cortex cérébral obtenu à partir de biopsies du cerveau humain adulte; (2) l'expansion in vitro (ce ​​qui nécessite environ 2-4 semaines) et la caractérisation de la culture par immunocytochimie et cytométrie de flux; (3) l'enrichissement en cellules activé par fluorescence (FACS) en utilisant des anti-récepteur de PDGF-β et d'anticorps anti-CD146;(4) la transduction rétrovirale médiée par la transcription des facteurs Sox2 neurogène et ASCL1; (5) et, enfin, la caractérisation des neurones résultantes de péricytes dérivé induits (PdiNs) par immunocytochimie (14 jours à huit semaines suivant transduction rétrovirale). A ce stade, l'INS peut être sondé pour leurs propriétés électriques par l'enregistrement de patch-clamp. Ce protocole prévoit une procédure hautement reproductible pour la conversion in vitro de la lignée des péricytes du cerveau-résident en ins humaines fonctionnelles.

Introduction

Par opposition à la reprogrammation des cellules somatiques dans des cellules souches pluripotentes induites (CISP), qui à leur tour sont équipés d'une multitude de potentiels de différenciation, une reprogrammation directe vise à conversion directe d'un type de cellule spécifique dans une autre. En ce qui concerne leur application dans le contexte de la modélisation des maladies et des thérapies à base de cellules potentiels, deux approches de reprogrammation ont des avantages et des inconvénients spécifiques. Reprogrammation en CSPi (i) fournit une source quasi infinie de cellules; (Ii) permet de génie génétique; (Iii) confère un potentiel de différenciatio....

Protocole

1. Isolement et culture des cellules cerveau humain adulte

Les expériences impliquant des tissus humains doivent être effectués en conformité avec toutes les réglementations gouvernementales et institutionnelles pertinentes concernant l'utilisation de matériel humain à des fins de recherche. Le présent protocole a été élaboré en conformité avec l'approbation par le comité d'éthique de la Faculté de médecine de la LMU Munich et le consentement éclairé de tous les patients.

Ce protocole de préparation des cultures de l'adulte cortex cérébral humain a été créé à l'aide de l'échantillon des p....

Résultats

Le premier résultat de ce protocole après avoir réussi à établir une culture d'un spécimen de l'homme adulte cortex cérébral consiste à l'identification de la composition cellulaire de la culture. Immunocytochimie pour des protéines spécifiques de type cellulaire révèle un degré élevé d'hétérogénéité entre les cultures dérivées de l'échantillon de différents patients (Figure 1A). Telle que quantifiée par cytométrie de flux, il ya toujours une fraction substantielle des cellules qui e.......

Discussion

Le présent protocole décrit l'expansion in vitro et l'enrichissement des cellules péricytes dérivé après l'isolement de l'adulte cortex cérébral humain et la conversion ultérieure en ins par l'expression de retrovirus de la transcription neurogène facteurs Sox2 et Ascl1. Ce protocole prévoit une expérimentation dans le système in vitro pour étudier la lignée de conversion des cellules du cerveau résident dans les neurones et potentiellement les cellules gliales, avec l'.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
anti-CD140b-PE	BD Biosciences	558821	utiliser 1:100
anti-CD146-FITC	AbD Serotec	MCA2141FT	utiliser 1:100
anti-CD13-FITC	AbD Serotec	MVA1270A488T	utiliser 1:100
anti-CD34-APC	BD Biosciences	560940	utiliser 1:100
anti-PDGFR&beta ;	Signalisation cellulaire	3169S	utiliser 1:200
anti-CD146	Abcam	Ab75769	utiliser 1:400
anti-NG2	Millipore	AB5320	utiliser 1:400
anti-SMA	Sigma-Aldrich	A2547	utiliser 1:400
anti-&beta ; III-tubuline	Sigma-Aldrich	T8660	utilise 1:400
anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M4403	utilise 1:200
anti-GFAP	Sigma-Aldrich	G3893	utilise 1:600
anti-GFP	Aves Labs	GFP 10-20	utilise 1:1 000
anti-RFP	Chromotek	5F8	utilise 1:500
anti-S100&beta ;	Sigma-Aldrich	S2532	utilise 1:300
anti-NeuN	Millipore	MAB377	utilise 1:200
anti-GABA	Sigma-Aldrich	A2052	utilise 1:500
anti-calrétinine	Millipore	AB5054	utilise 1:500
anti-vGluT1	SYnaptic SYstems	135511	utilise 1:1 000
Rat IgG1 contrôle d’isotype FITC	AbD Serotec	11-4301-81	utiliser 1:100
Rat IgG1 contrôle isotype PE	AbD Serotec	12-4301-81	utiliser 1:100
Rat IgG1 contrôle isotype APC	AbD Serotec	17-4301-81	utiliser 1:100
TrypLE	Invitrogen	12605-010
DMEM, glycémie élevée, GlutaMAX	Invitrogen	61965
B27 supplément sans sérum	Invitrogen
sérum de veau fœtal	Invitrogen	10106-169	effectuer une inactivation thermique par incubation à 56 ° ; C pendant 30 min
Pénicilline-streptomycine	Invitrogen	15140122
HBSS (solution saline équilibrée de Hanks)	Invitrogen	24020-091
Dulbecco’s PBS sans CaCl2 et MgCl2 (D-PBS, 1x)	Invitrogen	14190
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Poly-D-lysine bromhydrate d’hydrocarbure (PDL)	Sigma-Aldrich	P0899
PFA (paraformaldéhyde)	Sigma-Aldrich	P1648
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A9418
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI (4&prime ;,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate	Sigma-Aldrich	042M4005
Aqua-Poly/ Mount	Polysciences	18606-20
Tubes à fond rond en polypropylène  ;	BD Biosciences	352063
Tubes à fond rond en polystyrène avec capuchon de filtre de cellules  ;	BD Biosciences	352235
Plaques 24 puits	Orange Scientific	5530305
75 cm2 flacons de culture	Greiner Bio-One	658175
25 cm2	Greiner Bio-One	690175
Pipettes jetables 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Verre Pasteur pipettes (150 mm)	Fisherbrand	FB50251
Lamelles en verre 12 mm de diamètre	Menzel	CB00120RA1
Scalpels chirurgicaux jetables  ;	B. Braun	5518083
Boîtes de culture tissulaire	Greiner Bio-One	633180
Tubes coniques 15 ml	BD Biosciences	352095
Hotte
Centrifugeuse et rotor pivotant avec adaptateurs pour tubes de 15 ml et 50 ml	Hettich Lab Technology	1406
Trieur de cellules de cytométrie en flux : FACSAria l avec logiciel FACSDiva	BD Biosciences
Incubateur de culture cellulaire humifiée	Eppendorf Galaxy 170R
Bain d’eau à 37 ° ; C
FACSFuivant de gaine faible  ;	BD Biosciences	342003
Microscope à épifluorescence BX61	Olympus
Microscope confocal LSM710	Zeiss

17504044à flux laminaire