Cibler les cellules du cerveau-résident pour la lignée reprogrammation directe offre de nouvelles perspectives pour la réparation du cerveau. Nous décrivons ici un protocole de la façon de préparer les cultures enrichies en péricytes du cerveau-résident de l'adulte cortex cérébral humain et les convertir en neurones induits par l'expression de retrovirus de facteurs de transcription Sox2 et Ascl1.
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Article de méthode
Lineage reprogrammation de cellules pericyte dérivés du cerveau humain adulte en neurones induits
Dans cet article
Résumé
Résumé
Direct lignage reprogrammation des cellules non-neuronales en neurones induits (INS) peut fournir des indications sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la neurogenèse et de nouvelles stratégies pour la modélisation in vitro ou la réparation du cerveau malade. Identifier les types de cellules cérébrales-résident non-neuronales qui se prêtent à la conversion directe dans INS pourraient permettre de lancer une telle approche in situ, c'est à dire dans le tissu cérébral endommagé. Nous décrivons ici un protocole mis au point pour tenter d'identifier des cellules dérivées du cerveau humain adulte qui remplissent cette hypothèse. Ce protocole consiste à: (1) la mise en culture de cellules humaines à partir du cortex cérébral obtenu à partir de biopsies du cerveau humain adulte; (2) l'expansion in vitro (ce qui nécessite environ 2-4 semaines) et la caractérisation de la culture par immunocytochimie et cytométrie de flux; (3) l'enrichissement en cellules activé par fluorescence (FACS) en utilisant des anti-récepteur de PDGF-β et d'anticorps anti-CD146;(4) la transduction rétrovirale médiée par la transcription des facteurs Sox2 neurogène et ASCL1; (5) et, enfin, la caractérisation des neurones résultantes de péricytes dérivé induits (PdiNs) par immunocytochimie (14 jours à huit semaines suivant transduction rétrovirale). A ce stade, l'INS peut être sondé pour leurs propriétés électriques par l'enregistrement de patch-clamp. Ce protocole prévoit une procédure hautement reproductible pour la conversion in vitro de la lignée des péricytes du cerveau-résident en ins humaines fonctionnelles.
Introduction
Par opposition à la reprogrammation des cellules somatiques dans des cellules souches pluripotentes induites (CISP), qui à leur tour sont équipés d'une multitude de potentiels de différenciation, une reprogrammation directe vise à conversion directe d'un type de cellule spécifique dans une autre. En ce qui concerne leur application dans le contexte de la modélisation des maladies et des thérapies à base de cellules potentiels, deux approches de reprogrammation ont des avantages et des inconvénients spécifiques. Reprogrammation en CSPi (i) fournit une source quasi infinie de cellules; (Ii) permet de génie génétique; (Iii) confère un potentiel de différenciation presque illimitée. Cependant, les inconvénients majeurs de iPSCs comportent le risque de tumorigénicité des cellules indifférenciées (formation de tératome in vivo) et la nécessité d'une culture ex vivo et la transplantation subséquente si ces cellules doivent être utilisées pour les thérapies à base de cellules. A l'inverse, la lignée-reprogrammation directe est limitée par le faible rendement des cellules désiréesqui est en corrélation directe avec le nombre de cellules ciblées de la population de départ, mais possède l'avantage que des cellules de la lignée-reprogrammé semblent présenter aucun risque lors de la transplantation tumorigène 1,2; en outre, la reprogrammation directe peut même être réalisée in situ, c'est à dire dans l'organe où ces cellules seraient nécessaires, ce qui évite le besoin d'une transplantation.
Dans cet esprit, notre laboratoire a poursuivi la possibilité des cellules du cerveau-résident lignagères reprogrammation en ins comme une nouvelle approche vers des thérapies à base de cellules de maladies neurodégénératives. Les cellules du cerveau-résident qui peuvent être potentiellement considérés comme des cibles cellulaires pour lignage reprogrammation comprennent différents types de macroglie (astrocytes, des cellules NG2 et oligodendrocytes), la microglie et les cellules microvasculaires associées (cellules endothéliales et péricytes). Nous avons beaucoup étudié le potentiel de reprogrammation in vitro de astroglia du cor cérébraletex de souris postnatale précoce 3-5. A la recherche de sources de cellules de la même lignée appropriés pour reprogrammation directe dans le cerveau humain adulte, nous avons rencontré une population de cellules qui peuvent être reprogrammé avec succès dans tenants et les caractéristiques d'exposition des péricytes. Nous décrivons ici un protocole de façon à récolter les cellules à partir de biopsies du cerveau humain adulte, d'élargir et d'enrichir ces cellules in vitro, et, enfin, de reprogrammer avec succès une fraction substantielle de ces cellules in vitro en expansées (dans la plage de 25 à 30%) dans Ins. La reprogrammation peut être obtenue par retrovirus co-expression simultanée de deux facteurs de transcription, et Sox2 ASCL1. Ces PdiNs ont été trouvés à acquérir la capacité d'action répétitive tir potentiel et de servir de cibles synaptiques d'autres neurones indiquant leur capacité d'intégration dans les réseaux de neurones. Notre protocole prévoit une procédure simple pour la conversion de l'isolement et de la lignée des péricytes adultes du cerveau humain dans Ins.
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Protocole
1. Isolement et culture des cellules cerveau humain adulte
Les expériences impliquant des tissus humains doivent être effectués en conformité avec toutes les réglementations gouvernementales et institutionnelles pertinentes concernant l'utilisation de matériel humain à des fins de recherche. Le présent protocole a été élaboré en conformité avec l'approbation par le comité d'éthique de la Faculté de médecine de la LMU Munich et le consentement éclairé de tous les patients.
Ce protocole de préparation des cultures de l'adulte cortex cérébral humain a été créé à l'aide de l'échantillon des patients des deux sexes atteints d'épilepsie du lobe temporal ou d'autres lésions profondes non-traumatiques, non malignes. Le tissu obtenu à partir de la salle d'opération constituée exclusivement le canal d'accès à la lésion cérébrale et donc est considérée comme saine. La tranche d'âge des patients était de 19-70 ans.
- Préparer un milieu de croissance par addition de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur(FCS) de DMEM riche en glucose avec GlutaMAX pour obtenir une concentration finale de 20% de FCS. Ajouter 5 ml de pénicilline / streptomycine à un total de 500 ml de milieu de croissance. Effectuez cette et toutes les étapes ultérieures nécessitant des conditions de culture stériles sous une hotte à flux laminaire approprié.
- Maintenir l'adulte biopsie du cerveau humain obtenu à partir de la salle d'opération dans une solution saline équilibrée de Hanks avec CaCl 2 et MgCl 2 (HBSS) moyen compris HEPES (10 mM de concentration finale) sur de la glace jusqu'à transformation. Commencer le traitement dès que possible.
- Pour démarrer la dissociation dans des cellules individuelles, transférer le tissu dans une boîte de Pétri de 65 mm et émincer en petits morceaux à l'aide de deux à usage unique scalpels stériles. Pour la digestion enzymatique en utilisant 6.3 ml TrypLE dans un tube conique de 15 ml et incuber pendant 15 à 30 min à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Ajouter 1 volume de milieu de culture préchauffé afin de faciliter la dissociation et triturer doucement la solution contenant les morceaux de tissu vers le haut et vers le bas en utilisant d'abordune pipette jetable de 5 ml, puis à l'aide d'une pipette Pasteur en verre jusqu'à ce que l'homogénéisation de la suspension cellulaire. Typiquement, des morceaux de tissus résiduels, principalement constitués de la matière blanche, resteront dans la suspension.
- Centrifuger à 157 g pendant 5 min et remettre en suspension le culot dans la quantité appropriée de milieu de croissance (10 ml par flacon de culture non revêtue T75). Utilisez un flacon de culture T75 pour une biopsie de 5-10 mm de diamètre en taille et en extrapoler en cas de plus gros spécimens.
- Placer les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 5% d'O 2.
- Remplacer la moitié du milieu tous les 3-4 jours jusqu'à ce que les cellules ont atteint la confluence. Cela prend habituellement de deux semaines (dénommé passage 0 [P0]).
Expansion 2. In vitro et caractérisation des cellules cerveau humain adulte
- Dans l'expansion in vitro:
- Aspirer le milieu de culture et laver avec tampon phosphate salin (PBS), conserver à température ambiante temperature, avant d'ajouter 3 ml TrypLE.
- Incuber à 37 ° C pendant 5 à 10 min jusqu'à ce que la plupart des cellules détachées. Tapoter doucement les flacons pour faciliter le levage des cellules; après addition de 3 volumes de milieu de croissance, transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 157 g pendant 5 min et remettre en suspension les cellules dans la quantité appropriée de milieu de croissance.
- Passage des cellules à un rapport de 1:3 pour un rendement optimal dans de nouveaux flacons de culture de cellules T75.
Note: Nous avons repiquées ces cellules jusqu'à P5 sans aucun signe de réduction de l'efficacité de la reprogrammation. Bien au P0 la culture contient une fraction considérable de cellules endothéliales (évaluée par l'expression de CD34), à des passages ultérieurs de leur nombre devient négligeable.
- Caractérisation des cultures adultes du cerveau humain:
- Immunocytochimie:
- Pour la caractérisation des cellules, semences ~ 60 000 cellules sur la poly-D-lysine couvercle en verre glisse dans 500 pi mediu de croissance fraism dans des plaques à 24 puits pour culture de tissus et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 5% d'O 2.
- Pour une analyse immunocytochimique des cellules cultivées du cerveau humain éliminer le milieu et laver 3 fois avec 1 ml de PBS.
- Fixer les cellules en ajoutant 500 ul de paraformaldehyde à 4% dans du PBS pendant 15 min à température ambiante.
- Transférer le couvercle de verre se glisse dans une chambre de coloration approprié humidifié et bloquer avec 80 ul de PBS contenant 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 0,5% de Triton X-100 pendant 1 heure à température ambiante.
- Ajouter des anticorps primaires dilués dans la même solution (pour les facteurs de dilution, voir le tableau des réactifs et du matériel spécifiques) et incuber une nuit à 4 ° C ou 1 h à température ambiante.
Remarque: Une fraction substantielle mais en faisant varier des cellules à ce stade de la culture sont immunoréactives pour la croissance β du récepteur du facteur dérivé des plaquettes (PDGFRß), groupe de différenciation 146 (CD146), NG2 chondroïtine sulfate protéoglycane, et l'actine musculaire lisse (SMA), c'est à dire des marqueurs caractéristiques des péricytes microvasculaires associées. Seule une minorité (<1%) expriment les marqueurs astroglials protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et S100β. En outre, à ce stade, la culture doit être dépourvu de toutes les cellules exprimant le marqueur neuronal ßlll-tubuline. Utilisez plusieurs combinaisons d'anticorps primaire pour co-étiquetage des différents marqueurs. Une autre confirmation de l'expression de marqueurs gliaux, neuronaux, endothéliales et péricytes peut être obtenue par transcription inverse et réaction en temps réel en chaîne par polymérase quantitative (qui n'est pas décrit dans ce protocole). - Après l'incubation avec les anticorps primaires laver trois fois avec 1 ml de PBS et ajouter les anticorps secondaires correspondants (dans les dilutions appropriées) à la solution de coloration et incuber 1 h à température ambiante dans l'obscurité. Laver les cellules avec du PBS 3X. Si nécessaire, avant montage inclure coloration avec DAPI pendant 5 min à mangertempérature.
- Utilisation antifading milieu de montage et d'analyser les lamelles en utilisant un microscope à épifluorescence ou un microscope confocal.
- Cytométrie en flux:
- Pour l'analyse de l'expression des marqueurs de surface en utilisant la cytométrie en flux, les cellules se développer jusqu'à confluence en T25 ou T75 non revêtue des flacons de culture cellulaire.
- Détacher les cellules en utilisant TrypLE comme décrit précédemment et remettre en suspension dans une solution de coloration constitué de PBS + 0,5% de BSA. Par réaction de coloration, remettre en suspension 100,000-200,000 cellules dans 100 ul de solution de coloration. Préparer les réactions de coloration uniques par anticorps utilisés (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, des anticorps témoins d'isotype respectifs).
- Ajouter les anticorps conjugués à un fluorochrome pour chaque solution de coloration (voir le tableau pour les dilutions des réactifs et des équipements spécifiques) directement dans la suspension de cellules et incuber à 4 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
- Laver les cellules trois fois avec 500 ul de PBS et centrifuger entre chaqueétape de lavage à 157 xg pendant 5 min.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 0,5 à 1 ml de solution de coloration et les cellules de transfert à travers un tamis cellulaire (70 um) dans des tubes FACS. Le protéger de l'exposition à la lumière.
- Vortex échantillons avant de les placer dans l'instrument FACS.
- Pour analyser les cellules vivantes et exclure les débris cellulaires et les agrégats, porte de FSC-A et SSC-A. doublets de cellules sont spécifiquement déclenchés par FSC-A et FSC-W. Pour déterminer les conditions de déclenchement correct pour les marqueurs de surface cellulaire fixées les portes avec un anticorps de contrôle d'isotype correspondant conjugué à du fluorochrome respectif. Ensuite, déterminer la proportion de cellules liées à l'anticorps.
- Immunocytochimie:
3. D'enrichissement pour les cellules dérivées de péricytes par cellulaire activé par fluorescence de tri
- Purifier la population de cellules des péricytes (remises en suspension dans du milieu de croissance) avant la transduction via tri par FACS en utilisant une buse de 70 um. Utilisez CD34-APC en combinaison avec CD140b-PE et CD146-FITC pour sélectionner des péricytes. Trier pour, les cellules CD140b-et-CD146 positives CD34 négatif.
- Recueillir les cellules triées dans un milieu de croissance et de la plaque sur la poly-D-lysine couvercle en verre glisse dans des plaques à 24 puits pour culture de tissus et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 5% d'O 2.
- 48 h après le tri remplacer le milieu avec un milieu de croissance frais et d'effectuer la transduction tel que décrit dans le protocole 4.
4. Rétrovirale transduction des cellules dérivées de péricytes et Reprogrammation en neurones induits
Remarque: Se référer aux lignes directrices en matière de biosécurité locales lors de la manipulation des particules rétrovirales. En Allemagne, l'utilisation des rétrovirus utilisés ici nécessitent de biosécurité de niveau 2. Pour la production de particules rétrovirales, se référer au protocole 6. Pour les constructions rétrovirales utilisées pour la reprogrammation, reportez-vous à Karow et al. (2012). Les rétrovirus sont pseudotypée avec la VSV-G (virus de la stomatite vésiculeuse-glycoprotéine) 5. Pour la production s'il vous plaît se référer à Gavrilescu et al 6.
- 24 heures avant la semence de transduction rétrovirale ~ 60 000 cellules sur la poly-D-lysine couvercle en verre glisse dans 500 pi de milieu de croissance frais dans des plaques à 24 puits de culture de tissu et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 et 5% d'O 2 .
- Le lendemain, remplacer le milieu de croissance avec 500 pi de milieu de croissance frais, préchauffé et ajouter 1 pl des surnageants concentrés respectifs contenant des particules rétrovirales (pCAG-IRES-dsRED pour le contrôle, en particulier lors de l'établissement du protocole dans le laboratoire), pCAG-ASCL1 -IRES-dsRED, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
- Un jour plus tard, retirez le support, y compris les particules virales à partir des cellules et ajouter 1 ml fraîches, préchauffé moyen B27-différenciation, composé de 49 ml de DMEM riche en glucose avec GlutaMAX et 1 supplément sans sérum B27 ml. Maintenir les cellules en culture à 37 ° C dans 5% De CO 2 et 5% O 2 pour 4-8 semaines sans changer le milieu que les changements de moyennes répétitives deviennent nuisibles comme ins maturité.
5. Caractérisation des neurones induite par immunocytochimie
- Pour déterminer l'identité cellulaire des cellules transduites, en particulier pour démontrer l'acquisition d'un phénotype neuronal, effectuer immunocytochimie contre des antigènes neuronaux tels que bIII-tubuline, MAP2, et NeuN (pour les anticorps et leurs dilutions respectives, voir le tableau des réactifs spécifiques et équipements; suivre la même procédure comme indiqué au point 2.2.1).
- Pour améliorer la maturation des PdiNs, de co-culture de ces cellules avec les neurones issus de cortex cérébral de souris E14. A cette fin, disséquer le cortex cérébral et les tissus dissocier mécaniquement avec une pipette Pasteur en verre poli au feu. Ajouter 10,000-50,000 neurones murins à des cultures de cellules dérivées de péricytes 2-3 semaines suivant la transduction de re-Sox2 et ASCL1-codagetroviruses et continuer la culture. Les cellules transduites peuvent être distingués des neurones murins par leur rapporteur (GFP et DsRed) expression, soit par épifluorescence en direct ou à la suite immunocytochimie pour la GFP et DsRed.
- Pour évaluer la formation des synapses sur PdiNs par les neurones de souris, effectuer immunocytochimie contre les récepteurs de neurotransmetteurs vésiculaires tels que vésiculaire transporteur du glutamate 1 (VGLUT1).
- Sonder les cellules transduites pour leurs propriétés électriques (c. capacité de générer des potentiels d'action) et la mise en place des synapses fonctionnelles par patch-clamp électrophysiologie. Pour plus de détails de la procédure voir Heinrich et al. (2011).
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Résultats
Le premier résultat de ce protocole après avoir réussi à établir une culture d'un spécimen de l'homme adulte cortex cérébral consiste à l'identification de la composition cellulaire de la culture. Immunocytochimie pour des protéines spécifiques de type cellulaire révèle un degré élevé d'hétérogénéité entre les cultures dérivées de l'échantillon de différents patients (Figure 1A). Telle que quantifiée par cytométrie de flux, il ya toujours une fraction substantielle des cellules qui e...
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Discussion
Le présent protocole décrit l'expansion in vitro et l'enrichissement des cellules péricytes dérivé après l'isolement de l'adulte cortex cérébral humain et la conversion ultérieure en ins par l'expression de retrovirus de la transcription neurogène facteurs Sox2 et Ascl1. Ce protocole prévoit une expérimentation dans le système in vitro pour étudier la lignée de conversion des cellules du cerveau résident dans les neurones et potentiellement les cellules gliales, avec l'...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont rien à révéler.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants envers le Dr Magdalena Götz pour sa contribution au cours de l'élaboration de ce protocole. Nous remercions le Dr Marius Wernig (Stanford University) pour généreusement nous fournir la séquence codante de Sox2. Nous sommes également très reconnaissants envers le Dr Alexandra Lepier pour la production de virus. Ce travail a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) et le BMBF (01GN1009A) à BB, et le ministère bavarois des Sciences, de la Recherche et des Arts à MK et BBCS reçu des fonds du SYSTHER binational INREMOS Institut virtuel (ministères fédéral allemand et slovène de l'éducation et de la recherche) et la DFG (SFB 824).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | utiliser 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | utiliser 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | utiliser 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | utiliser 1:100 |
| anti-PDGFR&beta ; | Signalisation cellulaire | 3169S | utiliser 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | utiliser 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | utiliser 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | utiliser 1:400 |
| anti-&beta ; III-tubuline | Sigma-Aldrich | T8660 | utilise 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | utilise 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | utilise 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | utilise 1:1 000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | utilise 1:500 |
| anti-S100&beta ; | Sigma-Aldrich | S2532 | utilise 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | utilise 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | utilise 1:500 |
| anti-calrétinine | Millipore | AB5054 | utilise 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | utilise 1:1 000 |
| Rat IgG1 contrôle d’isotype FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | utiliser 1:100 |
| Rat IgG1 contrôle isotype PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | utiliser 1:100 |
| Rat IgG1 contrôle isotype APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | utiliser 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, glycémie élevée, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 supplément sans sérum | Invitrogen | ||
| sérum de veau fœtal | Invitrogen | 10106-169 | effectuer une inactivation thermique par incubation à 56 ° ; C pendant 30 min |
| Pénicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (solution saline équilibrée de Hanks) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco’s PBS sans CaCl2 et MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine bromhydrate d’hydrocarbure (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldéhyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4&prime ;,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/ Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Tubes à fond rond en polypropylène ; | BD Biosciences | 352063 | |
| Tubes à fond rond en polystyrène avec capuchon de filtre de cellules ; | BD Biosciences | 352235 | |
| Plaques 24 puits | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 flacons de culture | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Pipettes jetables 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Verre Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Lamelles en verre 12 mm de diamètre | Menzel | CB00120RA1 | |
| Scalpels chirurgicaux jetables ; | B. Braun | 5518083 | |
| Boîtes de culture tissulaire | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Tubes coniques 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Hotte | |||
| Centrifugeuse et rotor pivotant avec adaptateurs pour tubes de 15 ml et 50 ml | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Trieur de cellules de cytométrie en flux : FACSAria l avec logiciel FACSDiva | BD Biosciences | ||
| Incubateur de culture cellulaire humifiée | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Bain d’eau à 37 ° ; C | |||
| FACSFuivant de gaine faible ; | BD Biosciences | 342003 | |
| Microscope à épifluorescence BX61 | Olympus | ||
| Microscope confocal LSM710 | Zeiss |
Références
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Réimpressions et autorisations
