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Article de méthode

Imagerie confocale de clos de repos et Flowing mélanges colloïdes-polymères

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DOI :

10.3791/51461

⸱

20 mai 2014

 ,  , 
1Chemical and Biomolecular Engineering Department, University of Houston

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La microscopie confocale est utilisé pour les mélanges polymère-colloïde quiescentes et s'écoulant image, qui sont étudiés en tant que systèmes modèles pour des suspensions attractifs. des algorithmes d'analyse d'image sont utilisés pour calculer des paramètres structuraux et dynamiques par des particules colloïdales qui permettent de mesurer les changements dus au confinement géométrique.

Résumé

Le comportement des suspensions colloïdales confinés avec des interactions interparticulaires attractives est essentielle à la conception rationnelle de matériaux pour l'assemblage dirigé 1-3, l'administration de médicaments 4, l'amélioration de la récupération des hydrocarbures 5-7, et des électrodes fluides de stockage d'énergie 8. De suspensions contenant des colloïdes et polymères fluorescents non-adsorbantes sont attrayants systèmes modèles, comme le rapport du rayon de giration de polymère par rapport au rayon de la particule et la concentration de contrôle du polymère de la gamme et de la force de l'attraction interparticulaire, respectivement. En ajustant les propriétés du polymère et la fraction volumique des colloïdes, des fluides colloïdaux, les fluides de grappes, gels, cristaux, et les verres peuvent être obtenus 9. Microscopie confocale, une variante de la microscopie de fluorescence, permet à un échantillon optiquement transparent et fluorescent à imager avec une haute résolution spatiale et temporelle en trois dimensions. Dans cette technique, un petit trou d'épingle ou une fente bloque la lumière fluorescente émise à partir de régions de l'échantillon qui sont en dehors du volume focal du système optique du microscope. En conséquence, seule une mince section de l'échantillon dans le plan focal est imagé. Cette technique est particulièrement bien adaptée pour sonder la structure et la dynamique des suspensions colloïdales denses à l'échelle unique de particules: les particules sont assez grands pour être résolus en utilisant la lumière visible et diffusent suffisamment lentement pour être capturés à des vitesses typiques de balayage des systèmes confocaux commerciaux 10 . L'amélioration de la vitesse de balayage et des algorithmes d'analyse ont également permis l'imagerie confocale quantitative des suspensions découlant 11-16,37. Dans cet article, nous démontrons expériences de microscopie confocale à sonder le comportement de phase confiné et propriétés d'écoulement des mélanges colloïdes polymères. Nous préparons premier collmélanges oid-polymères qui sont la densité et l'indice de réfraction adaptés. Ensuite, nous présentons un protocole standard pour l'imagerie mélanges colloïdes polymères denses de repos sous divers confinement dans des cellules en forme de coin minces. Enfin, nous démontrons un protocole pour l'imagerie mélanges colloïdes polymères lors de l'écoulement de microcanaux.

Introduction

Cet article démontre (a) l'imagerie confocale de mélanges de repos et fluides confinés colloïdes polymères en deux et trois dimensions et (b) des particules suivi et analyses de corrélation des images résultantes pour obtenir des informations quantitatives sur le comportement de phase et propriétés d'écoulement.

Suspensions colloïdales avec les interactions entre particules intéressantes apparaissent de façon ubiquitaire dans les applications technologiques comme matériaux pour l'assemblage dirigé 1-3, l'administration de médicaments 4, l'amélioration de 5-7 de récupération des hydrocarbures, et le stockage d'énergie 8. Une caractéristique commune de ces applications est que les particules doivent être sous géométries fines, tels que des buses, têtes d'impression, des microcanaux ou des milieux poreux, et / ou être façonnés en couches minces ou de tiges. Les techniques utilisées pour sonder la structure des colloïdes de l'ordre du micromètre dans des géométries confinées, y compris la microscopie électronique 17,18, la microscopie à rayons X 19, et diffraction laser microscopy 20, peut être utilisé pour mesurer la structure et la dynamique des particules sur l'échelle microscopique. Ces techniques, cependant, ne permettent pas l'accès aux trajectoires des particules individuelles, dont les paramètres structurels et dynamiques peuvent être calculées pour une comparaison directe à des simulations numériques 21,22.

La microscopie confocale est une variante de la microscopie à fluorescence qui permet l'imagerie des sections minces d'un échantillon fluorescent. Pour la science colloïdale 10, cette technique est particulièrement utile pour l'imagerie profonde dans les suspensions denses ou en trois dimensions. Des algorithmes de poursuite de particules 23 appliqués à deux ou à une série de temps tridimensionnelles de micrographies confocales produire les trajectoires de toutes les particules visibles. Par conséquent, la combinaison de la microscopie confocale et de suivi des particules a été appliquée pour étudier le comportement de phase, la structure et la dynamique des suspensions colloïdales, notamment des cristaux de 24 à 27 commandés et troubleed lunettes 28-31 et 32-35 gels.

D'autres algorithmes d'analyse d'image peuvent être appliquées pour mesurer la dynamique des particules de série de temps de micrographies confocale. Par exemple, la dynamique des particules de diffusion peuvent être étudiés en analysant les fluctuations de l'intensité au fil du temps à l'aide différentielle de microscopie confocale dynamique 36. Lorsque les déplacements des particules sont plus grandes que l'espacement interparticulaire, la corrélation d'images sur la base de 37 particules vélocimétrie par image de 38 à 40 peut être appliquée pour mesurer les profils de vitesse des particules. La combinaison d'algorithmes de suivi et de corrélation a permis dynamique colloïdales qui doivent être mesurés dans des systèmes soumis à écoulement lent et rapide 11-16,41-45.

Nous utilisons des mélanges colloïdes polymères comme des modèles pour les suspensions colloïdales attrayantes 9. Dans ces mélanges, la plage et la force du potentiel interparticulaire attractive sont contrôlées par le rapportdu rayon de giration de polymère pour le rayon de la particule et la concentration du polymère et la répulsion électrostatique est commandé par l'intermédiaire de l'addition d'un sel organique monovalent 46. Etant donné que les interactions interparticulaires peuvent être réglées avec soin, la solidification de ces mélanges a été étudiée par microscopie confocale 34,47-51.

Ici, nous démontrons l'imagerie confocale et analyse d'image 37 de mélanges colloïdes polymères de repos et fluides, dans lequel la fraction de volume de colloïde est maintenu fixé à Φ = 0,15, qui sonde l'effet du confinement sur ​​le comportement de phase et les propriétés d'écoulement de ces mélanges. Ces techniques sont largement applicables à des systèmes de particules qui sont en correspondance l'indice de réfraction, et dans laquelle les particules et / ou de solvant peuvent être marqués avec un colorant fluorescent.

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Protocole

1. Préparation des mélanges colloïdes-polymères

Remarque: Ce protocole utilise le poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA), des particules, stabilisées stériquement à l'aide de poly (acide 12-hydroxystéarique) et marqué avec un colorant fluorescent (comme Nile Red, la rhodamine B, ou la fluorescéine), qui ont été synthétisé en suivant une norme recette 52.

  1. Préparer un w / w mélange de bromure de cyclohexyle (CXB) et décahydronaphtalène (DHN) comme solvant d'actions 03h01. Ce mélange correspond à peu près la densité et l'indice de réfraction des particules. Ajouter un sel organique, le chlorure de tétrabutylammonium (TBAC) 46, pour le solvant à une concentration de 1,5 mM pour cribler partiellement les charges sur les particules.
  2. Pour déterminer avec précision la densité des particules, préparer une suspension à une fraction approximative du volume de particules Φ = 0,10 dans le CXB: solvant DHN. Centrifuger la suspension à 800 g pendant 75 min et ajouter CXB ou DHN goutte à goutte à améliorer la flottabilitél'appariement. Dans ces expériences, la densité des particules de PMMA a été mesurée à ρ = 1,223 g / ml.
  3. Préparer une suspension de concentré de particules de PMMA (ici, Φ = 0,40) dans le CXB: DHN mélange de solvants.
  4. Préparer une solution concentrée de polystyrène linéaire (PS) dans la CXB: DHN mélange de solvants. Ici, une solution de PS de masse moléculaire M w ≈ 3000000 (rayon de giration r g = 15 nm) est préparé à la concentration c p ≈ 50 mg / ml.
  5. Mélanger les poids appropriés de la particule, polymère, et mélanges de solvant d'actions de formuler des suspensions aux concentrations désirées de particules et de polymères.
    Remarque: ici, des suspensions de particules monodispersées sont préparées à une fraction constante du volume de colloïde Φ = 0,15 et la concentration en polymère variable dans le volume libre 53 c p = 0 à 25 mg / ml, et les suspensions contenant deux tailles différentes de particules colloïdales bidispersed, wrâce à chaque taille portant un marqueur fluorescent distinct, sont préparés à une fraction totale fixe du volume de colloïde Φ = 0,15, rapport volumique de fraction de petites particules r = 0,50, et la concentration de polymère dans le volume libre de 5 ou 25 mg / ml.
  6. Après chaque suspension est préparée, ajouter CXB ou DHN goutte à goutte et centrifuger les échantillons à 800 g pendant au moins 75 min pour confirmer que les particules et les clusters dans la suspension restent flottabilité identifié.
  7. Tous les échantillons s'équilibrer pendant au moins 24 heures avant des expériences d'imagerie.

. 2 exemples expériences quiescentes: Phase comportement

  1. Pour déterminer le comportement de phase en vrac, fabriquer chambres rectangulaires de lamelles de verre (figure 1a). Pour les mélanges colloïdes polymères dans cette étude, les chambres de l'épaisseur h = 1 mm (fixé par l'épaisseur d'une lame de microscope) donnent le comportement en vrac.
  2. Pour accéder à plusieurs accouchements dans une expérience de microscopie unique, fabriquer mince coinchambres en forme, à l'aide d'une seule lamelle couvre-objet comme un élément d'espacement sur ​​une cale (figure 1b). L'angle de la chambre d'ouverture est <0,5 °, de sorte que dans un seul champ de vision, les murs sont à peu près parallèles. Une chambre représentant permet d'accéder à des épaisseurs de confinement de h = 6 à> 100 um.
  3. Construire des enceintes sur une base de lamelle couvre-objet pour une imagerie sur un microscope inversé et sceller avec époxy durcissant aux UV, qui ne se dissout pas dans le mélange solvant-CXB DHN.
  4. échantillons de l'image à l'aide d'un microscope confocal. Ce protocole démontre l'imagerie confocale d'une ligne de balayage fixée à un microscope inversé équipé d'un objectif 100X à immersion dans l'huile de l'ouverture numérique NA = 1,40.
  5. Exciter les colorants à l'aide d'une source laser. Voici les longueurs d'onde λ = 491 nm ou 561 sont utilisés pour exciter la fluorescéine et la rhodamine colorants / Nil rouge, respectivement.
  6. Dans le système de point de balayage, de générer une image en balayant rapidement le point focal à travers l'échantillon (dans le x-y plane) en utilisant le logiciel confocal. Une image en deux dimensions de 512 pixels x 512 pixels, couvrant environ 50 um x 50 um, peuvent être acquises en 1/32 sec. Améliorer la qualité de l'image en faisant la moyenne de plusieurs images ou d'augmenter le temps d'acquisition.
  7. Localiser le fond de la chambre (z = 0), par exemple en mettant l'accent sur les particules adhérant à sa partie inférieure. Dans cette configuration, la hauteur (z) augmente avec la mise au point dans la chambre.
  8. A titre d'exemple, de caractériser l'effet de confinement sur la dynamique des particules par l'acquisition d'une série temporelle de 2-D des images (dans le plan xy) dans le plan médian de la chambre. Dans une expérience typique, 500 images de la dimension 512 pixels x 512 pixels sont acquises à une cadence de 1 image / s (temps d'espacement At = 1 s).
  9. Comme deuxième exemple, de caractériser la structure 3-D des particules en acquérant une série tridimensionnelle d'images (x, y, z). Dans une expérience typique, des images bidimensionnelles (512 pixels x 512 pixels) sontacquis à plusieurs positions z dans la chambre, avec un espacement constant de Az = 0,2 um entre les images consécutives fixées par un piézo. Une pile de volume couvrant une épaisseur h = 30 um contient donc 151 images.
  10. Recherchez et particules de piste dans le temps de 2-D ou 3-D à l'aide de logiciels de traces de particules écrite en IDL 23,54-56, MATLAB 57,58, LabView 59, ou Python 60. Ces algorithmes permettent généralement les centres des particules à être résolues dans les 40-50 nm. Suivi des particules réussie nécessite que les particules se déplacent inférieure à l'espacement interparticulaire entre les trames consécutives.
  11. De la position des particules, calculer des métriques structurelles et dynamiques. Trois mesures pratiques présentées ici sont la fonction de corrélation de paires 3-D g (r) 61, le déplacement quadratique moyenne 2-D (MSD) 58,62, et l'auto-partie 2 D de la fonction de corrélation van Hove G s ( x, t) 58. Les deux derniers paramètres peuvent également être calculées en 3-D.

. 3 expériences Flowing: propriétés d'écoulement

  1. Fabriquer une cellule d'écoulement simple à l'aide d'un micro-capillaire de verre à section transversale carrée (100 um x 100 um) qui est fixée à un tube de Téflon. Utilisation des lamelles de verre pour supporter le tube capillaire et une rigidité mécanique, comme le montre le schéma de la figure 7.
  2. Chargez le mélange colloïde-polymère dans une seringue en verre. Fixer la seringue à une pompe à seringue ou d'un système de distribution de fluide pneumatique.
  3. Montez la configuration de la cellule d'écoulement sur le microscope inversé. Conserver la seringue, la cellule, la sortie d'écoulement et à la même hauteur afin de minimiser l'effet de la gravité sur le profil d'écoulement.
  4. Contrôler la vitesse de la suspension d'écoulement à travers la cellule d'écoulement par le débit volumétrique d'écoulement (pour la pompe à seringue) ou la pression appliquée (pour la zone de pression). La vitesse moyenne de la suspension dans les microcanaux dépend aussi de la diformulation de spension. Les valeurs typiques de la vitesse maximale dans les micro-canaux carrés sont ici mesurées 200-2000 um / sec.
  5. Au cours de l'écoulement, d'acquérir une série de temps confocale 2-D à des cadences rapides. Ici, les images de dimension 500 512 pixels x 512 pixels sont acquis à 32 images / s (espacement temps Δ t = 1/32 sec) à des hauteurs différentes au-dessus du fond du micro-canal (z = 0 um) allant de z = 5 - 50 um. Chaque image couvre environ la moitié de la dimension latérale (y) du micro-canal, comme indiqué dans l'encart de la Figure 7. Si les particules apparaissent elliptique, augmenter le taux d'acquisition de trame.
  6. Comme dans les expériences de repos, de localiser les particules en 2-D en utilisant des algorithmes standard pour la localisation et le suivi des particules dans IDL ou MATLAB. Pour les flux lents, dans laquelle les particules se déplacent moins que la distance interparticulaire moyenne entre les cadres, utilisent des algorithmes de suivi pour obtenir les trajectoires.
  7. Utilisez la corrélation d'images à calcouler les profils de vitesse des flux rapides.
    1. Subdiviser l'image en des images horizontales de hauteur constante (y) le long de la direction d'écoulement (x). Pour deux images séquentielles I 1 (x, y) et I 2 (x, y) passer la dernière image par un facteur Ax et ensuite calculer la covariance croisée entre I 1 (x, y) et I 2 (x + Ax, y).
    2. Identifier la position du pic de l'histogramme des valeurs Ax qui maximisent la covariance croisée entre chaque paire d'images pour obtenir la vitesse d'advection moyen au niveau de chaque position latérale y. Si cette distribution n'est pas fortement atteint un sommet, d'acquérir des images à une cadence plus rapide.

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Résultats

Pour démontrer l'imagerie confocale et particules de suivi, nous avons étudié l'effet du confinement sur ​​le comportement de phase de mélanges colloïdes polymères 63-65. Pour ces expériences, le diamètre des colloïdes est de 2 a = 0,865 um. La fraction volumique de colloïde a été fixé à Φ = 0,15 et la concentration du polymère c p a fait varier de 0 à 23,6 mg / ml. Images confocales représentatifs sont présentés dans la figure 2 63, colonne de ...

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Discussion

Suspensions colloïdales sont largement étudiés comme modèles de comportement de phase confinée, car les particules colloïdales de taille micronique présentent dynamique nettement plus lent que les atomes et les molécules et donc peuvent être facilement visualisés et suivis dans le temps 10. Pour ces études fondamentales, la compréhension de l'effet des attractions interparticulaires sur le comportement de phase confinée offre la possibilité d'explorer des phénomènes tels que la condensation capillaire...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l'Université de Houston New Faculté Grant, une subvention de démarrage du Centre du Texas pour la supraconductivité, et le Fonds de recherche de l'American Petroleum Chemical Society (52537-DNI).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bromure de cyclohexyleSigma Aldrich135194Numéro CAS  ; 108-85-0, Poids moléculaire = 163,06, Utilisé dans le solvant de base
DécahydronapthaleneSigma AldrichD251Numéro CAS 91-17-8, Poids moléculaire = 138,25, Utilisé dans le solvant de base
Nile RedSigma Aldrich72485Colorant fluorescent
Fluorescéine 5(6)-isothiocyanateSigma AldrichF3651Colorant fluorescent
Rhodamine BSigma Aldrich83689Colorant fluorescent
Diffusion dynamique de la lumière  ;Brookhaven InstrumentsBI-APDDLS équipement utilisé pour la mesure de la taille des particules
Polystyrène  ;Varian/AgilentPL20138-23Polystyrène (polymère) pour induire l’attraction de l’appauvrissement
Tétrabutyle (chlorure d’ammonium) (TBAC)Sigma Aldrich86870sel monovalent
Adhésif UVNorland AdhesiveNOA 68TNuméro de pièce 68T01 (adhésif durci UV)
VT EyeVisitechVT Scannerconfocal
VT InfinityVisitechVT Microscopeà scanner confocal
l’infiniLeica DMI3000B Microscope inversé
CentrifugeuseThermo ScientificSorvall ST 161-5 000 tr/min
Tube en téflon petitespiècesSLTT 26-72Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0.016 » ID x 0.003 »
Wall EpoxyDevconDA051 5min
SeringueMicromate/Cadence5004seringue en verre avec luer en métal embouts de
seringueNordson701846232 GA  ;
Pompe à seringueSystème de pompe New Era Inc.NE1002XPompe microfluidique programmable (syringepump.com)
Balance peséeMettler ToledoAB204-S0.0001-220 g particules
PMMAsynthétiséesen poly(méthacrylate) colloïdal
oculaireà époxy Embouts de précision de

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