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Fabrication de concentré, de l'oxygène à base de lipides microbulles émulsions par cisaillement élevé homogénéisation et la concentration de série

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DOI :

10.3791/51467

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26 mai 2014

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1Department of Cardiology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons des procédés pour la fabrication de grandes quantités de micro-bulles d'oxygène à base de lipides (OLM) conçus pour la délivrance par voie intraveineuse de l'oxygène en utilisant une homogénéisation à cisaillement élevé et la concentration en série.

Résumé

microbulles remplies de gaz ont été mis au point en tant que contraste ultrasonore et des agents de libération de médicaments. Les microbulles peuvent être produits par traitement à l'aide des tensioactifs sonication, une agitation mécanique, des dispositifs microfluidiques, ou l'homogénéisation. Récemment, des microbulles d'oxygène à base de lipides (OLM) ont été conçus pour fournir de l'oxygène par voie intraveineuse en cas d'urgence médicale, inversant hypoxémie de la vie en danger, et de prévenir tout dommage ultérieur d'organes, l'arrêt cardiaque et la mort. Nous présentons les méthodes pour la production à l'échelle-up de microbulles hautement oxygénées à l'aide d'une boucle fermée à cisaillement élevé d'homogénéisation. Le processus peut produire 2 L de LOM concentrées (90% en volume) en 90 min. Les bulles résultantes ont un diamètre moyen d'environ 2 pm, et un profil rhéologique conforme à celle du sang lorsqu'il est dilué à 60% en volume. Cette technique produit OLM à haute capacité et à haute pureté de l'oxygène, ce qui suggère que cette technique peut être utile pour les laboratoires de recherche translationnelle.

Introduction

Microbulles composés de protéines, de polymère, et des obus de lipides ont été développés en tant que vecteurs pour l'administration de médicaments, la thérapie génique et les agents de contraste ultrasonores 1-5. Parce que ces utilisations thérapeutiques nécessitent persistance microbulles intravasculaire, ces microbulles sont généralement remplis de gaz moléculaire, de poids élevés inertes tels que les hydrocarbures perfluorés 6, qui ont une faible solubilité dans le sang et stabilisent le 3,4 bulle.

Récemment, des microbulles d'oxygène à base de lipides (OLM) ont été conçus pour administrer des doses thérapeutiques de l'oxygène, ce qui peut préserver l'apport d'oxygène aux organes cibles et prévenir l'instabilité hémodynamique pendant les périodes d'obstruction des voies respiratoires ou hypoxémie 7. Émulsions conçus pour la livraison de gaz par voie intraveineuse ont besoin de différents éléments de conception que ceux utilisés pour les agents de contraste ultrasonores ou administration ciblée des médicaments. En premier lieu, parce que le corps consomme de grandes quantités de gaz d'oxygène (~ 200 ml / min), OLM doivent être produites etinjecté sur une grande échelle. Il faut pour cela que le procédé de fabrication soit efficace. Deuxièmement, le processus de fabrication doit être en boucle fermée afin d'éviter la contamination de l'azote à travers l'exposition de LOM (qui doit être rempli avec 100% d'oxygène) à l'air ambiant. Troisièmement, parce que le but de LOM est la livraison de gaz par voie intraveineuse, la fraction de gaz de LOM doit être maximisée, en reconnaissant les limites imposées par la viscosité de l'émulsion 7. Enfin, comme avec n'importe quel injectable par voie intraveineuse, un contrôle précis de la distribution de taille des particules est indispensable pour éviter l'obstruction microvasculaire 8.

Il existe plusieurs méthodes établies pour la fabrication de micro-bulles. La sonication utilise une grande intensité, à basse fréquence ultrasonore appliquée à l'interface air-liquide d'une émulsion qui comprend un agent tensio-actif, tel qu'un phospholipide amphipathique, en présence d'un ciel gazeux pour produire des microbulles 7,9. Ce processus peut être commandé en faisant varier ultrala fréquence du son, la puissance et la durée d'impulsion, et la distribution de la taille résultante peuvent être adaptées pour produire des micro-bulles d'une distribution de taille spécifique, bien que la sonication est rarement utilisé dans la fabrication de micro-bulles cliniquement utilisés. Fusion est l'agitation mécanique intense d'un tensioactif et de gaz dans un système fermé, qui est également difficile à l'échelle en place pour accueillir de grands volumes 2. Microfluidique à base de gouttelettes permet un contrôle précis de la distribution de taille des microbulles de 10 à 13. Bien que traditionnellement difficile d'extrapoler, multi-canal, la microfluidique à haut débit ont été décrits qui augmentent l'efficacité de la production de microbulles 13. Microbulles fabriqués en utilisant une de ces méthodes peuvent nécessiter des processus de réduction de la taille de post-production, telles que le fractionnement centrifuge 14,15 et 16,17 microbulles flottation.

Une autre méthode connue pour la fabrication de micro-bulles très stables au cisaillement est homogenization 6, ce qui peut se traduire par un motif hexagonal de phospholipide stabilisateur sur la surface à microbulles 18. S'appuyant sur ​​ce concept, nous décrivons l'incorporation d'un cisaillement élevé homogénéisateur en ligne pour créer OLM d'auto-assemblage 19. Dans ce processus, l'homogénéisation utilise des lames en rotation rapide à proximité de deux beaux écrans maille émulseur, créant un fort cisaillement mécanique et hydraulique pour la création de micro-bulles. Concentration de série de l'émulsion lipidique à travers ce système produit une fraction de gaz de plus en plus concentrées, qui peuvent être encore plus concentré par centrifugation.

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Protocole

1. Configuration du système

Le système est constitué d'un support et en concentrant réservoir (HCT) équipé d'un mélangeur à un étage, un cisaillement élevé homogénéisateur en ligne, une pompe à rouleaux pour déplacer le fluide entre le HCT et l'homogénéisateur, et un échangeur de chaleur (figure 1).

  1. Placez un, large ouverture 4 L récipient de collecte de verre stérilisé équipé de 2 ports de base et 3 ports secondaires sous le mélangeur en une seule étape. Abaissez la tête du batteur jusqu'à l'embouchure de la cuve et assurer un raccord étanche aux gaz en utilisant des joints en caoutchouc ou du ruban adhésif (pour éviter de contaminer l'air ambiant de l'espace de tête).
  2. Monter un des ports de base (Figure 1, le port n ° 1) du HCT avec stérile 3/8 "(ID) tuyau transparent, environ 10" de long, munie d'un robinet 3 voies à la pointe pour la collecte de l'émulsion concentrée .
  3. Monter le deuxième port de base (figure 1, le port # 2) stérile 3/8 "(ID) des tubes, approximately 36 "de longueur. Alimenter ce tube à travers une pompe à rouleaux. Monter l'entrée de l'homogénéisateur à cisaillement élevé avec un T-pièces, y compris deux ports et connecter comme suit: connecter les tubes du port n ° 2, à travers la pompe à galet et se connecter au port du côté de la pièce en T. Attachez l'autre orifice à un réservoir d'oxygène en utilisant un débitmètre à faible débit d'oxygène gazeux.
  4. Connecter le port de sortie du dispositif d'homogénéisation à cisaillement élevé à l'orifice d'entrée d'un échangeur de chaleur en ligne maintenue à 4 ° C. Connecter le port de sortie de l'échangeur de chaleur à l'orifice de retour du HCT (figure 1, le port n ° 3), la création d'un système en boucle fermée.
  5. Attacher un réservoir d'oxygène (via un débitmètre) au HCT (figure 1, le port # 4). Fixer un écran de composition du gaz qui est ouvert à l'atmosphère à l'orifice supérieur de l'HCT (figure 1, le port n ° 5).
  6. Si la stérilité est souhaitée, stériliser les composants de verre et de métal avant chaque utilisation par autoclave. Stériliser les composants de tubes et co plastiquennectors par l'oxyde d'éthylène avant chaque utilisation. Ceci est particulièrement important si le produit doit être testé in vivo.

2. LOM Fabrication

  1. Placer 20 g de GMP 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC) et 10 g de cholestérol à la base du HCT. Ajouter 1 L d'Plasma-Lyte A à l'HCT et mélanger à la main pendant 1 minute, en intégrant autant que possible des lipides en phase aqueuse.
  2. Abaisser le mélangeur en une seule étape dans la phase aqueuse, en veillant à ce que la tête de mélangeur est entièrement recouverte par la phase aqueuse. Assurez-vous que le haut de la HCT est étanche aux gaz (voir l'étape 1.1 ci-dessus) et qu'il n'y a pas de ports secondaires ouvertes. Allumez la source de gaz connecté au port n ° 4 et attendre jusqu'à ce que la fraction d'oxygène de l'espace libre du HCT atteint> 95%. À 10 L / min (LPM), ce qui devrait prendre ~ 10 min.
  3. Utilisation de la console en une seule étape, mélanger l'émulsion de précurseur pendant 5 min à 5000 rpm. Le mélange obtenu doit apparaître blanc pâle et ne contiennent pas lipi visibled touffes. Une fois mélangé, le mélange eau-lipide utilisé peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à 30 jours avant de l'utiliser seul.
  4. Premier l'ensemble du système en boucle fermée avec l'émulsion de précurseur en activant la pompe à galet à 1,3 LPM. Une fois que le système est amorcé, garder la pompe à 1,3 LPM.
  5. Pour commencer la fabrication des OLM, mettez le cisaillement élevé homogénéisateur en ligne à 7500 rpm. Immédiatement par la suite, mettre en marche le flux d'oxygène à la partie d'entrée du dispositif d'homogénéisation à 0,5 LPM. Gardez le mélangeur en une seule étape (dans le HCT) sur à 3500 rpm. LOM sont formées à l'interface des pales de rotor et les écrans d'émulseur au sein de l'homogénéisateur en ligne (figure 2). En quelques minutes, le liquide doit être visiblement plus visqueux. Une approche plus rigoureuse est de déterminer la viscosité en fonction du temps, ce qui peut être fait par prélèvement des aliquotes de Port 1 lors de la fabrication et de l'analyse avec un viscosimètre.
    Remarque: si des bulles d'air visibles sont présents dans le tube sortant du mélangeur, de l'oxygèneiront à l'homogénéisateur en ligne est trop élevé. Titrer bas débit de gaz jusqu'à ce que le fluide est opaque et ne contient pas de bulles de gaz visibles.
  6. Faire fonctionner le système pendant 15 min, puis éteignez l'homogénéisation de cisaillement élevé et l'entrée de l'oxygène à elle. Continuez à faire fonctionner le mélangeur en une seule étape dans le HCT jusqu'à l'émulsion est supprimé; atténue cette séparation de phase et maintient le produit relativement uniforme à l'intérieur de la HCT.
    Remarque: Le volume de l'émulsion rempli de gaz devrait augmenter d'environ 2 à 3 fois pendant la phase de série de la concentration. Si ce n'est pas, vérifier pour s'assurer que l'oxygène s'écoule dans l'homogénéisateur à cisaillement élevé et que les concentrations de lipides dans l'émulsion de précurseur sont corrects. Efficacité de la production diminue à mesure que diminue la concentration en lipides.

3. Collection, Concentration, l'évaluation, et le stockage des OLM

  1. Attacher une stérile, modifié 140 ml luer-lock seringue au robinet d'arrêt connecté au port de base n ° 1 sur le récipient de collecte. Dresser 100 ml de liquide. Fermer hermétiquement la seringue et répéter jusqu'à ce que tout le liquide a été retiré.
    1. Modifier seringues en retirant 100 ml d'air dans la seringue et scier l'excédent piston et matériau de la seringue au-dessus de la marque de 140 ml alors. Remplissez et seringues vides en utilisant une pince à griffes de dresser le piston. Cette modification permet plus facile centrifugation.
  2. seringues à centrifuger avec la fin plafonné orientée vers le bas dans un réfrigérateur (4 ° C) seau centrifuger à 225 g pendant 10 min.
  3. Trois couches de matériau apparaissent après centrifugation. Expulser la couche inférieure de l'excès de phase aqueuse trouble et jeter. La seconde couche est blanc lumineux et contient OLM concentrés. Transférer la mousse concentrée pour une seringue étanche aux gaz au moyen d'un robinet à trois voies pour empêcher la contamination du gaz ambiant. Jeter la couche finale, qui contient de l'oxygène libre de LOM rompus.
  4. la qualité de la mousse peut être évaluée en atteignant ≥ 90% de gaz de la mousse concentré. Calculmangé concentration de gaz de la manière suivante:
    Gaz =% en volume [(poids de la mousse / volume de mousse) - 1] x 100
    1. A titre de témoin seconde qualité, de la taille des microbulles par obscurcissement de lumière afin de déterminer si la taille des particules est comprise dans la plage attendue. Il est à noter que le changement dans le temps d'homogénéisation ou de la formulation peut modifier la taille des bulles.
  5. Fermer hermétiquement la seringue en verre avec un ajustement luer-lock. OLM concentrés peuvent être dilués avec de Plasma-Lyte A au moment de l'utilisation. Les seringues peuvent être stockés à 22, 4, ou -20 ° C; des températures plus froides peuvent fournir une meilleure stabilité durée de vie 7.

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Résultats

Homogénéisation à cisaillement élevé permet la production efficace (c'est à dire dans un après-midi) de LOM suffisantes pour une étude sur l'animal et ne nécessite pas de compétences techniques. Une fois compétent, jusqu'à 2 litres de concentré OLM peut être fabriqué en 90 min.

taille de microbulles et de la morphologie a été évaluée par microscopie optique et par obscurcissement. Quand un échantillon de 10 pi de OLM a été visualisé, OLM sphériques ont été notés, ainsi q...

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Discussion

Les étapes les plus importantes à la création concentrés OLM, très oxygénés comprennent: 1) veiller à ce que l'espace libre dans le HCT reste entièrement oxygéné; 2) veiller à ce que la pureté des excipients lipidiques est optimal (y compris les conditions de stockage et d'utilisation des produits BPF); 3) faire en sorte que les lipides en poudre se mélangent complètement avec la phase aqueuse avant l'amorçage du système; et 4) portant une attention particulière à l'augmentation de la fraction de gaz à l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Financement: US Army Research & Medical Materiel Command (USAMRMC) et géré par la télémédecine et avancée Technology Research Center. Shunxi Ji a contribué à la modification des seringues comme décrit ici.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids770365Produit alternatif : non-GMP de NOF America (Coatsome MC-8080)
CholestérolSigma AldrichC75209
Plasma-Lyte AVWR80089-818Peut également utiliser
récipient de collecte en verreSpecialty Glass, Inc.personnalisé: Pam Zurbrick - 281-595-2210
Moniteur de composition gazeuse (oxygène)Precision MedicalPM5900L
Pompe à rouleaux Sarns 8000Calicut Medical16407Fait partie d’un système de perfusion modulaire
Échangeur de chaleur BIOtherm MedtronicECMOtherm-II
Verso Mélangeur en ligne de laboratoireSilverson Machines, IncTH-IL-102-VERSOUtiliser des têtes de travail à plusieurs étages et une extension de l’extrémité avant avec une pièce en
T pour la pièce en T pour l’orifice d’entrée Silverson VersoProcess InnovationsContact personnalisé: Brian Leavitt - 508-423-2266
Mélangeur de laboratoire L5M-ASilverson Machines, IncNC0136483Utiliser un tamis à émulseur à mailles (fine)
Pince dentée Rochester-OchsnerFisher Scientific13-812-18
Seringue de 140 mlKendall Healthcare Monoject8881114030Assurez-vous qu’il y a un luer lock.
IX71 Microscope à lumière inverséeOlympusIX71
Retiga-2000R Caméra microscopeQImagingRET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A AutodilutionPSS-NICOMP Systèmes de granulométrieHors production
le NaCl Contact

Références

  1. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
  2. Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
  3. Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
  4. Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
  5. Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
  6. Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
  7. Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
  8. Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
  9. Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
  10. Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
  11. Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
  12. Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
  13. Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
  14. Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
  15. Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
  16. Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
  17. Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
  18. Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
  19. Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).

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Mots-clés

Microbulles d oxyg ne base de lipidespourcentage volumique d oxyg nedistribution de la taille des particulesmesure de la concentration gazeuseanalyse de la viscosit de l mulsionsyst me en boucle ferm econcentration par centrifugationtechnologie de diffusion de la lumi re

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